细胞因子风暴（cytokine storm）是指在机体感染微生物后或者其他情况下，免疫系统被过度激活，导致体液中多种细胞因子迅速大量产生的现象，这些细胞因子包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α），白细胞介素-1、2、4、6、8、10、12（IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12），干扰素（IFN-α、IFN-β、IFN-γ）等。Ferrara等1993年首次提出“细胞因子风暴”的概念，但其很大程度上是由于2005年H5N1禽流感病毒爆发而进入公众视野，从此广泛见诸于各种科学文献报道^{[1, 2]}。细胞因子风暴是引起急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）和多器官衰竭的重要原因，在多种疾病中是致死的重要原因之一，近年来越来越引起人们的关注^[1]。研究表明热毒宁注射液具有抗病毒、抗菌、解热、抗炎等药理作用^{[3, 4, 5, 6, 7]}，可降低TNF-α、IL-1、IL-6、内皮素-1（ET-1）、前列腺素E₂（PGE₂）、环磷酸腺苷（cAMP）等炎症因子的水平。本研究通过脂多糖（LPS）致大鼠急性肺损伤（ALI）模型，探讨热毒宁注射液抑制细胞因子风暴的作用机制，为其临床用于呼吸系统疾病治疗提供依据。

热毒宁注射液，规格10 mL/支，6支/盒，批号140103，江苏康缘药业股份有限公司；醋酸地塞米松注射液，规格5 mg/mL，批号140125，吉林精优长白山药业有限公司；LPS（批号L2660），Biolopped Sigma；IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、核转录因子-κB（NF-κB）放免试剂盒，北京华英生物技术研究所。日本日立7160全自动生化仪。

SD大鼠，雄性，体质量180～200 g，SPF级，上海西普尔-必凯实验动物有限公司，合格证号（沪）2008-0016。

取雄性SD大鼠60只，将大鼠随机分成6组，每组10只，即对照组、模型组、阳性对照组（地塞米松0.5 mg/kg）及热毒宁注射液高、中、低剂量（10.16、5.08、2.54 g/kg）治疗组。实验前动物禁食12 h，自由饮水。

依据文献方法，采用LPS气管滴注法制备ALI模型。LPS以无菌生理盐水配制成5 mg/mL。大鼠ip 10%水合氯醛0.35 g/kg麻醉，颈部正中切口2 cm，分离气管，微量注射器由气管向肺方向滴注LPS（6 mg/kg）复制ALI模型，对照组滴注等体积生理盐水。造模30 min后各组大鼠iv给予相应药物治疗，注射LPS后16 h，大鼠ip 10%水合氯醛0.35 g/kg麻醉，取材。

各组动物处死后，迅速打开胸腔，取出右肺中叶放入液氮中待处理。肺组织称质量，以0.1 g肺组织加生理盐水1 mL，用玻璃匀浆器匀浆，4 ℃低温离心（3 000 r/min），取上清液-70 ℃冻存，按试剂盒说明方法检测。

各组动物处死后，迅速打开胸腔，取出右肺上叶放入10%甲醛固定24 h，石蜡切片，HE染色观察病理改变情况。根据病变范围及炎症评分：1分代表轻微，病变范围＜25%；2分代表中度，病变范围25%～50%；3分代表重度，病变范围50%～75%；4分代表严重，病变范围75%～100%；无明显病变为0分，极轻度病变为0.5分，累加所有分数，并计算出每组每只动物的平均分值，分值越高提示炎症病变程度越严重。

数据以x ± s表示，量反应资料统计方法采用单因素方差分析检验法，统计软件SPSS 17.0。

模型组与对照组相比，大鼠肺组织IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-6水平明显升高（P＜0.01）。热毒宁注射液高、中剂量组和地塞米松组明显降低大鼠肺组织中IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-6水平（P＜0.05、0.01），热毒宁低剂量组明显降低大鼠肺组织中IL-1β和TNF-α水平（P＜0.05），结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 热毒宁注射液对LPS致ALI大鼠肺组织IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-6的影响(x±s , n=10) Table 1 Effects of Reduning Injectionon IL-1β,TNF-α,IL-4,and IL-6 in lung tissue of ALI rats induced by LPS(x±s , n=10) 组别 剂量/(g∙kg-1) IL-1β/(pg∙mL-1) TNF-α/(pg∙mL-1) IL-4/(pg∙mL-1) IL-6/(pg∙mL-1) 对照 — 63.33±19.53 93.27±17.08 89.45±13.01 136.29±31.16 模型 — 118.03±26.99△△ 149.76±21.67△△ 141.26±20.39△△ 210.53±50.58△△ 地塞米松 5×10-4 66.74±22.97** 110.98±16.97** 110.14±26.09** 154.61±39.52 热毒宁注射液 10.16 69.14±28.43** 112.73±20.00** 115.48±19.52** 165.97±30.41 5.08 78.99±23.37** 115.63±18.02** 118.89±19.85 171.03±23.35 2.54 92.37±23.28 126.17±19.30 121.57±23.79 181.61±32.25 与对照组比较：△△P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下同 △△P < 0.01 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs model group,same as below

表 1 热毒宁注射液对LPS致ALI大鼠肺组织IL-1β、TNF-α、IL-4、IL-6的影响(x±s , n=10) Table 1 Effects of Reduning Injectionon IL-1β,TNF-α,IL-4,and IL-6 in lung tissue of ALI rats induced by LPS(x±s , n=10)

表 2结果表明，模型组与对照组相比，大鼠肺 组织IL-8、IL-10、ICAM-1、NF-κB水平明显升高（P＜0.01）。热毒宁注射液高、中剂量组和地塞米松组明显降低大鼠肺组织中IL-8、IL-10、ICAM-1、NF-κB水平（P＜0.05、0.01）。

表 2(Table 2)

表 2 热毒宁注射液对LPS致ALI大鼠肺组织中IL-8、IL-10、ICAM-1、NF-κB的影响(x±s , n=10) Table 2 Effects of Reduning Injection on IL-8,IL-10,ICAM-1,and NF-κB in lung tissue of ALI rats induced by LPS(x±s , n=10) 组别 剂量/(g∙kg-1) IL-8/(pg∙mL-1) IL-10/(pg∙mL-1) ICAM-1/(ng∙mL-1) NF-κB/(pg∙mL-1) 对照 — 80.30±19.31 53.11±16.50 355.87±56.67 38.97± 6.12 模型 — 128.61±24.42△△ 80.25±22.43△△ 420.31±47.90△ 81.36±13.84△△ 地塞米松 5×10-4 93.51±12.68** 56.60±16.51 363.32±47.61 50.99±24.90** 热毒宁注射液 10.16 94.45±24.61** 56.31±13.83 361.23±39.64** 49.13±18.39** 5.08 104.96±23.52 58.37±21.18 363.27±39.31** 56.33±19.50** 2.54 103.74±28.71 66.43±16.97 382.90±47.42 62.87±24.45 与对照组比较：△P＜0.05 △△P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05 **P＜0.01，下同 △P < 0.05 △△P < 0.01 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs model group,same as below

表 2 热毒宁注射液对LPS致ALI大鼠肺组织中IL-8、IL-10、ICAM-1、NF-κB的影响(x±s , n=10) Table 2 Effects of Reduning Injection on IL-8,IL-10,ICAM-1,and NF-κB in lung tissue of ALI rats induced by LPS(x±s , n=10)

肺组织病理检查结果显示，对照组大鼠肺组织由肺泡、肺内支气管分支及间质组成，未见明显病变。模型组大鼠肺组织肺泡壁充血、有炎细胞浸润，部分大鼠肺泡腔内有渗出物，肺内各级支气管腔内、管周水肿，有炎细胞浸润。热毒宁注射液组和地塞米松组病变同模型组相比，肺泡壁充血、炎细胞浸润较模型组减轻，表明热毒宁注射液高、中、低剂量组能不同程度地减轻肺部炎症的病变，与模型组相比差异有显著性（P＜0.01）。见表 3、图 1。

表 3(Table 3)

表 3 热毒宁注射液对LPS致ALI大鼠肺组织病理改变的影响(x±s , n=10) Table 3 Effect of Reduning Injection on pathology of ALI rats induced by LPS(x±s , n=10) 组别 剂量/(g∙kg-1) 病理评分 对照 — 2.90±0.61 模型 — 10.30±1.01△△ 地塞米松 5×10-4 6.55±1.48** 热毒宁注射液 10.16 5.75±3.02** 5.08 7.15±1.40** 2.54 8.05±1.28**

表 3 热毒宁注射液对LPS致ALI大鼠肺组织病理改变的影响(x±s , n=10) Table 3 Effect of Reduning Injection on pathology of ALI rats induced by LPS(x±s , n=10)

图 1 热毒宁注射液对ALI大鼠肺损伤的影响 (HE染色)Fig. 1 Effect of Reduning Injection on injury of lung tissue in ALI rats (HE stainning)

ALI是以大量中性粒细胞浸润，微血管和肺泡上皮细胞受损，血管壁通透性增高，肺水肿及肺出血为主要病理特征的一种失控性炎症反应，细胞因子作为信号分子在启动、放大和维持局部和全身炎症反应中起关键作用^{[10, 11, 12]}。LPS损害是导致ALI发病的最常见形式之一，其可促进炎性细胞的活化和聚集以及其他炎性介质的生成和释放，从而引起瀑布式炎性反应，导致血管内皮受损、血管反应性调节机制紊乱、弥漫性肺组织损伤^[13]。LPS通过激活多条信号转导通路最终将胞外信号转变为核内信号，其中，NF-κB是被其强烈激活的一类核内信号，它的活化可诱发大量炎症相关因子的表达，因而在ALI发病过程中发挥着重要作用^{[14, 15, 16]}。研究发现，NF-κB调节的靶基因蛋白包括细胞因子（如IL-1、IL-2、IL-3、IL-6）、趋化因子（如IL-8、巨噬细胞趋化蛋白-1、巨噬细胞炎性蛋白-1A）、黏附因子（如ICAM-1、VCAM-1）等^[17]。

细胞因子有促炎细胞因子和抗炎细胞因子，前者主要包括IL-6、IL-8、TNF-α、IL-2、IL-1β等，后者主要有IL-11、IL-4、IL-13、IL-10、IL-1受体拮抗剂等，这两者之间平衡是维持机体的正常免疫功能和抵抗疾病的关键因素，内毒素可促进TNF-α、IL-6等的合成和释放^[18]。促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β也是NF-κB诱导基因的产物，也能作为激动剂进一步使其活性增强，此正反馈调节机制易使炎症反应扩大和持续^[17]。IL-1β在ALI发病中能诱导巨噬细胞产生多种趋化因子如IL-8、MCP-1、ENA-78，诱导单核/巨噬细胞和中性粒细胞趋化浸润炎症局部，激活肺毛细血管内皮细胞表达细胞黏附因子（ICAMs）等^[19]。TNF-α对肺有强烈的毒性，它能诱导肺内皮细胞活化、白细胞迁移、粒细胞脱颗粒和毛细血管渗漏，积聚的水肿液进一步阻碍肺泡细胞的灌流和氧气的交换，造成ALI^[20]。IL-10是一个以免疫抑制为主的多向免疫调节因子，其主要生物活性表现为直接抑制炎症细胞活化，进而抑制细胞因子的产生，IL-10抑制单核巨噬细胞表达IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、GM-CSF、TNF等^[21]。内毒素感染肺部引发全身性的细胞因子风暴，引起肺部炎症反应失控，最终可导致急性呼吸窘迫综合征是ALI最严重的后果。

热毒宁注射液是由青蒿、金银花、栀子组成的现代中药制剂，具有清热、解毒、疏风功效。临床上主要用于治疗上呼吸道感染、急性支气管炎，对社区获得性肺炎也显示较好疗效^[22]。研究表明热毒宁注射液对兔ALI模型具有良好治疗作用，可改善ALI兔的肺表面活性物质的量，抑制ALI的发生与发展^[23]。综上所述，本研究结果表明热毒宁注射液可有效减轻LPS诱导的大鼠ALI，可能通过抑制细胞因子风暴发挥其对LPS致ALI的保护效应。