中草药  2015, Vol. 46 Issue (19): 2846-2850
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引用本文doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2015.19.005
李岗, 仙云霞, 王晓, 周洪雷, 段文娟, 于金倩. 皂角刺化学成分及其抗肿瘤活性研究[J]. 中草药, 2015, 46(19): 2846-2850.
LI Gang, XIAN Yun-xia, WANG Xiao, ZHOU Hong-lei, DUAN Wen-juan, YU Jin-qian. Chemical constituents of Gleditsiae Spina and their antitumor activity[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2015, 46(19): 2846-2850.
皂角刺化学成分及其抗肿瘤活性研究
李岗1, 仙云霞1, 王晓1,2, 周洪雷1, 段文娟2, 于金倩2     
1. 山东中医药大学药学院, 山东 济南 250014;
2. 山东省中药质量控制技术重点实验室, 山东省分析测试中心, 山东 济南 250014
收稿日期：2015-07-30
基金项目：山东省科学院科学技术发展计划项目(2014QN02)
作者简介：李岗(1990-),男,硕士在读,研究方向为中药及天然药物有效成分及质量控制研究。E-mail:ligang2010@126.com
通讯作者：于金倩,女,博士,助理研究员,研究方向为天然产物化学。E-mail:yujinqian87528@126.com
摘要：目的 研究皂角刺(皂荚Gleditsia sinensis的干燥棘刺)的化学成分及抗肿瘤活性。方法 采用反复硅胶色谱、Sephadex LH-20凝胶色谱及半制备高效液相色谱等方法进行分离纯化,通过MS、NMR等波谱数据鉴定其化学结构;采用MTT法测定化合物1~4、6对人肝腹水腺癌细胞SK-HEP-1的细胞毒活性。结果 从皂角刺醋酸乙酯部位分离得到12个化合物,分别鉴定为2-氨基咪唑(1)、2,3-dihydro-5-(2-formylvinyl)-7-hydroxy-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-benzofuranmethanol(2)、E-肉桂酸(3)、3-O-反式阿魏酰基奎宁酸(4)、反式咖啡酸(5)、4-hydroxy-3-methoxybenzamide(6)、threo-guaiacylglycerol-β-coniferyl aldehyde ether(7)、5,7-二羟基色原酮(8)、香草酸(9)、原儿茶酸(10)、3-O-咖啡酰奎宁酸甲酯(11)、3-O-咖啡酰奎宁酸乙酯(12)。化合物1对SK-HEP-1细胞的IC50值为34.47μg/mL。结论 除化合物5外,其余化合物均首次从皂荚属植物中分离得到;化合物1对SK-HEP-1细胞具有明显细胞毒活性。
关键词： 豆科     皂角刺     2-氨基咪唑     3-O-反式阿魏酰基奎宁酸     5,7-二羟基色原酮     抗肿瘤     SK-HEP-1    
Chemical constituents of Gleditsiae Spina and their antitumor activity
LI Gang1, XIAN Yun-xia1, WANG Xiao1,2, ZHOU Hong-lei1, DUAN Wen-juan2, YU Jin-qian2    
1. College of Pharmacy, Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250014, China;
2. Shandong Analysis and Test Center, Key Laboratory of TCM Quality Control Technology, Jinan 250014, China
Abstract: Objective To investigate the chemical constituents from Gleditsiae Spina (the thorns of Gleditsia sinensis) and their antitumor activitives. Methods The chemical constituents were isolated and purified by the chromatography on repeated silica gel, Sephadex LH-20 column, semi-preparative HPLC, etc. Their structures were elucidated by NMR and MS spectroscopic data analyses; The cytotoxicity of compounds 1-4 and 6 was evaluated against human liver cancer SK-HEP-1 cells by MTT assay. Results Twelve compounds were isolated from Gleditsiae Spina, and identified as 2-aminoimidazole (1), 2,3-dihydro-5-(2-formylvinyl)-7-hydroxy-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-benzofuranmethanol (2), E-cinnamic acid (3), 3-O-trans-feruloylquinic acid (4), trans-caffeic acid (5), 4-hydroxy-3-methoxybenzamide (6), threo-guaiacylglycerol-β-coniferyl aldehyde ether (7), 5,7- dihydroxy-chromone (8), vanillic acid (9), protocatechuic acid (10), 3-O-caffeoylquinic acid methyl ester (11), and 3-O-caffeoylquinic acid ethyl ester (12); Compound 1 exhibited the potent cytotoxicity against SK-HEP-1 cells with IC50 value of 34.47 μg/mL. Conclusion All the compounds except compound 5 are isolated from the plants of Gleditsia L. for the first time; Compound 1 shows significant cytotoxic activity against SK-HEP-1 cells.
Key words: Leguminosae     Gleditsiae Spina     2-aminoimidazole     3-O-trans-feruloylquinic acid     5,7-dihydroxy-chromone     antitumor     SK-HEP-1    

皂角刺Gleditsiae Spina又名皂荚刺、皂刺、天丁、皂角针、皂针，为豆科（Leguminosae）皂荚属Gleditsia L. 植物皂荚Gleditsia sinensis Lam. 的干燥棘刺，全国广泛分布，江苏和湖北为主要产地，全年均可采收。其味辛，性温，归肝、胃经，具有消肿托毒、排脓、杀虫功效[1]，并且对肝癌[2]、宫颈癌[3]、直肠癌[4]、胃癌[5]等多种癌细胞有一定的抑制作用。目前国内外对皂角刺的研究报道比较偏重于生药学鉴定和临床功效的研究，而药理活性方面主要包括总黄酮提取物抗肿瘤活性[2]，乙醇提取物抗肿瘤[3, 4, 5]及杀菌[6]活性，总皂苷提取物抗肿瘤[7]、抗血栓[8]活性的研究，而对皂角刺抗肿瘤活性成分的研究报道比较少。为深入探究皂角刺抗肿瘤活性的药效物质基础，本实验对其化学成分进行了系统研究，从中分离得到12个化合物，分别鉴定为2-氨基咪唑（2-aminoimidazole，1）、2,3-dihydro-5-(2-formylvinyl)-7-hydroxy-2-(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-benzofuranmethanol（2）、E-肉桂酸（E-cinnamic acid，3）、3-O-反式阿魏酰基奎宁酸（3-O-trans-feruloylquinic acid，4）、反式咖啡酸（trans-caffeic acid，5）、4-hydroxy- 3-methoxy-benzamide（6）、threo-guaiacylglycerol- β-coniferyl aldehyde ether（7）、5,7-二羟基色原酮（5,7-dihydroxy-chromone，8）、香草酸（vanillic acid，9）、原儿茶酸（protocatechuic acid，10）、3-O-咖啡酰奎宁酸甲酯（3-O-caffeoylquinic acid methyl ester，11）、3-O-咖啡酰奎宁酸乙酯（3-O-caffeoylquinic acid ethyl ester，12）。除化合物5外，其余化合物均为首次从该属植物中分离得到，其中化合物1对人肝腹水腺癌细胞SK-HEP-1具有明显细胞毒活性。

1 仪器与材料

Varian INOVA-600核磁共振波谱仪（美国Varian公司）；Bruker-400核磁共振波谱仪（瑞士布鲁克公司）；半制备HPLC分析仪器为普源L-3000系列高效液相色谱仪；BB16型CO2培养箱（德国Heraeus公司）；Fluostar Omega全波长酶标仪（德国BmgLabtech公司）；OLYMPUS-CK光学显微镜（日本OLYMPUS公司）；一次性细胞培养瓶及96孔培养板（德国Greiner第一生化股份有限公司产品）；薄层硅胶GF254，柱色谱硅胶（200～300目）（青岛海洋化工厂）；HPLC用甲醇、乙腈为色谱纯（美国Tedia公司）；其余试剂均为分析纯。人肝腹水腺癌细胞SK-HEP-1细胞株（中国协和医科大学细胞中心）。

皂角刺Gleditsiae Spina药材采购于安徽亳州市场，经山东中医药大学周洪雷教授鉴定为豆科皂荚属植物皂荚Gleditsia sinensis Lam. 的干燥棘刺。

2 方法 2.1 提取与分离

干燥皂角刺8 kg，粉碎，95%乙醇回流提取3次，每次2 h，提取液合并、浓缩，得乙醇提取物；依次用等体积石油醚、醋酸乙酯萃取3次，合并萃取液，浓缩得醋酸乙酯部位浸膏230 g。取醋酸乙酯部位经硅胶柱色谱（二氯甲烷-甲醇，100∶0→ 0∶100）进行梯度洗脱，TLC检识合并得到15个部位Fr. 1～15。Fr. 5经硅胶柱色谱、Sephadex LH-20、制备液相色谱分离得到化合物3（24 mg）、8（7 mg）；Fr. 6经硅胶柱色谱结合Sephadex LH-20、制备液相色谱分离得到化合物1（35 mg）、2（26 mg）、4（29 mg）、6（30 mg）、7（7 mg）；Fr. 7经硅胶柱色谱、Sephadex LH-20纯化后得化合物9（5 mg）；Fr. 12经硅胶柱色谱结合Sephadex LH-20、制备液相色谱分离得到化合物5（11 mg）、10（6 mg）、11（8 mg）、12（6 mg）。

2.2 细胞毒活性研究 2.2.1 SK-HEP-1细胞株的培养

将细胞用含10%新生牛血清的DMEM完全培养基（NaHCO3，2 g，100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素）培养，37 ℃，5% CO2培养箱培养至细胞覆盖率达90%以上时传代，生长状态良好的细胞用于实验研究。

2.2.2 MTT实验

取96孔细胞培养板，每孔加入浓度为2×105个/mL的细胞悬液180 μL，37 ℃、5% CO2培养箱中贴壁培养，同时加入不同质量浓度的受试药物（溶解在含0.3% DMSO的培养基中）20 μL/孔，使其终质量浓度分别为100 μg/mL（C1）、50 μg/mL（C2）、25 μg/mL（C3）、12.5 μg/mL（C4）、6.3 μg/mL（C5）和3.1 μg/mL（C6），每质量浓度6个复孔，正常对照组加入等量含0.3% DMSO的培养基（C0），同时设阳性对照组（顺铂100 μg/mL）和阴性对照组（只加培养基），37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h。取出细胞培养板，倒置显微镜下观察细胞形态。

吸弃培养液，每孔加入180 μL无血清培养基和20 μL MTT溶液（原液5 mg/mL），继续培养4 h。弃去MTT，每孔加入200 μL DMSO，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。酶联免疫检测仪570 nm处测量各孔的吸光度值。计算抑制率和IC50。

3 结果 3.1 结构鉴定

化合物1：白色结晶（甲醇），ESI-MS m/z: 84 [M＋H]+（C3H5N3）。1H-NMR (600 MHz, CD3OD) δ: 13.43 (1H, s, 5-NH), 6.60 (2H, s, H-3, 4), 4.86 (2H, s, 6-NH2)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD) δ: 149.8 (C-1), 115.3 (C-3, 4)。以上数据与文献报道一致[9]，故鉴定化合物1为2-氨基咪唑。

化合物2：黄色针晶（甲醇），ESI-MS m/z: 343 [M＋H]+（C19H18O6）。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.59 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-9′), 9.57 (1H, s, 3′-OH), 9.06 (1H, s, 4-OH), 7.59 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-7′), 7.21 (1H, s, H-6′), 7.04 (1H, s, H-2′), 6.95 (1H, s, H-2), 6.79 (2H, m, H-5, 6), 6.58 (1H, dd, J = 8.0, 16.0 Hz, H-8′), 5.55 (1H, d, J = 6.4 Hz, H-7), 5.06 (1H, brs, 9-OH), 3.75 (3H, s, 3-OCH3), 3.67 (2H, m, H-9), 3.51 (1H, m, H-8)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 194.4 (C-9′), 154.6 (C-7′), 150.6 (C-4′), 148.1 (C-3), 147.0 (C-4), 141.9 (C-3′), 132.4 (C-1), 130.9 (C-5′), 128.0 (C-1′), 126.1 (C-8′), 119.3 (C-2), 117.3 (C-2′), 117.2 (C-6′), 115.8 (C-5), 110.9 (C-6), 88.3 (C-7), 63.2 (C-9), 56.1 (3-OCH3), 53.2 (C-8)。以上波谱数据与文献报道一致[10]，故鉴定化合物2为2,3-dihydro- 5-(2-formylvinyl)-7-hydroxy-2-(4-hydroxy-3-methoxy- phenyl)-3-benzofuranmethanol。

化合物3：白色粉末，ESI-MS m/z: 148.9 [M＋H]+（C9H8O2）。1H-NMR (600 MHz, CDCl3) δ: 11.43 (1H, s, -COOH), 7.79 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-7), 7.54 (2H, s, H-2, 6), 7.39 (3H, s, H-3, 4, 5), 6.46 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-8)；13C-NMR (150 MHz, CDCl3) δ: 172.7 (-COOH), 147.1 (C-7), 134.0 (C-1), 130.8 (C-4), 129.0 (C-3, 5), 128.4 (C-2, 6), 117.4 (C-8)。以上数据与文献报道一致[11]，故鉴定化合物3为E-肉桂酸。

化合物4：白色针晶（氯仿），ESI-MS m/z: 194.8 [M＋H]+（C10H10O4）。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.48 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-7), 7.28 (1H, d, J = 1.6 Hz, H-2), 7.08 (1H, dd, J = 1.6, 8.0 Hz, H-6), 6.78 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5), 6.36 (1H, d, J = 16 Hz, H-8), 3.82 (3H, s, 3-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 168.5 (C-9), 149.5 (C-3), 148.4 (C-4), 144.9 (C-7), 126.3 (C-1), 123.3 (C-6), 116.2 (C-5), 116.0 (C-8), 111.6 (C-2), 56.2 (3-OCH3)。以上数据与文献报道一致[12]，故鉴定化合物4为3-O-反式阿魏酰基奎宁酸。

化合物5：淡黄色针晶（甲醇）。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 10.20 (3H, brs, -OH), 7.43 (1H, d, J = 16 Hz, H-7), 7.04 (1H, s, H-2), 6.96 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-6), 6.77 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5), 6.19 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-8)。以上数据与文献报道一致[13]；与反式咖啡酸对照品共薄层，Rf值相同，显色行为吻合，故鉴定化合物5为反式咖啡酸。

化合物6：白色粉末，ESI-MS m/z: 166.6 [M－H]−（C8H9NO3）。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.45 (2H, dd, J = 1.6, 8.4 Hz, H-2, 6), 6.84 (1H, d, J = 8.8 Hz, H-5), 3.81 (3H, s, 3-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 167.8 (C-7), 151.5 (C-4), 147.7 (C-3), 123.9 (C-1), 122.4 (C-6), 115.5 (C-5), 113.2 (C-2), 56.0 (3-OCH3)。以上数据与文献报道一致[14]，故鉴定化合物6为4-hydroxy-3-methoxybenzamide。

化合物7：白色粉末，ESI-MS m/z: 396.9 [M＋Na]+（C20H22O7）。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 9.60 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-γ′), 7.60 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-α′), 7.30 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2′), 7.20 (1H, dd, J = 2.0, 8.4 Hz, H-6′), 7.07 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5′), 7.00 (1H, d, J = 2.0 Hz, H-2), 6.78 (1H, dd, J = 8.0, 15.6 Hz, H-β′), 6.77 (1H, dd, J = 1.6, 8.0 Hz, H-6), 6.66 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5), 5.40 (1H, d, J = 4.8 Hz, H-α), 4.70 (2H, m, H-γ), 4.47 (1H, m, H-β), 3.77 (3H, s, 3′-OCH3), 3.72 (3H, s, 3-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 194.5 (C-γ′), 154.1 (C-α′), 151.7 (C-3′), 150.1 (C-4′), 147.4 (C-4), 146.0 (C-3), 133.4 (C-1), 127.1 (C-β′), 126.8 (C-1′), 123.9 (C-5′), 120.0 (C-6), 115.0 (C-6′), 114.9 (C-5), 111.9 (C-2′), 111.8 (C-2), 83.8 (C-β), 72.0 (C-α), 60.8 (C-γ), 56.2 (3′-OCH3), 55.9 (3-OCH3)。以上数据与文献报道一致[15]，故鉴定化合物7为threo-guaiacylglycerol-β- coniferyl aldehyde ether。

化合物8：黄色粉末，ESI-MS m/z: 178.8 [M＋H]+（C9H6O4）。1H-NMR (600 MHz, DMSO-d6) δ: 12.70 (1H, s, -OH), 10.87 (1H, s, -OH), 8.19 (1H, d, J = 6.0 Hz, H-2), 6.38 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-8), 6.29 (1H, d, J = 6.0 Hz, H-3), 6.21 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-6)；13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ: 181.8 (C-4), 164.8 (C-7), 162.1 (C-5), 158.3 (C-9), 158.0 (C-2), 110.9 (C-3), 105.4 (C-10), 99.5 (C-6), 94.4 (C-8)。以上数据与文献报道一致[16]，故鉴定化合物8为5,7-二羟基色原酮。

化合物9：白色针晶（甲醇），ESI-MS m/z: 169 [M＋H]+（C8H8O4）。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.45 (1H, brs, H-2), 7.43 (1H, s, H-6), 6.85 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5), 3.81 (3H, s, 3-OCH3)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 167.7 (C-7), 151.6 (C-4), 147.7 (C-3), 123.9 (C-6), 122.2 (C-1), 115.5 (C-5), 113.2 (C-2), 56.0 (3-OCH3)。以上数据与文献报道一致[17]，故鉴定化合物9为香草酸。

化合物10：白色针晶（甲醇）。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.35 (1H, s, H-2), 7.30 (1H, d, J = 7.2 Hz, H-6), 6.79 (1H, d, J = 7.2 Hz, H-6)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 167.9 (C-7), 150.5 (C-4), 145.4 (C-3), 122.3 (C-6), 122.3 (C-1), 117.1 (C-2), 115.6 (C-5)。以上数据与文献报道一致[18]，故鉴定化合物10为原儿茶酸。

化合物11：黄色油状物。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.39 (1H, d, J = 16 Hz, H-7′), 7.04 (1H, brs, H-2′), 6.98 (1H, d, J = 8.6 Hz, H-6′), 6.77 (1H, d, J = 8.6 Hz, H-5′), 6.11 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-8′), 5.01 (1H, m, H-3), 3.88 (1H, m, H-5), 3.56 (1H, brs, H-4), 3.56 (3H, brs, H-8), 2.12 (H, m, H-6a), 2.09 (1H, brs, H-2a), 1.93 (1H, m, H-6b), 1.77 (1H, t, J = 11.2 Hz, H-2b)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 174.1 (C-7), 165.8 (C-9′), 149.1 (C-4′), 146.2 (C-3′), 145.6 (C-7′), 125.8 (C-1′), 121.8 (C-6′), 116.3 (C-5′), 115.0 (C-2′), 114.3 (C-8′), 73.5 (C-1), 71.5 (C-3), 69.8 (C-4), 67.3 (C-5), 52.3 (C-8), 37.7 (C-6), 35.6 (C-2)。以上数据与文献报道一致[19]，故鉴定化合物11为3-O-咖啡酰奎宁酸甲酯。

化合物12：黄色油状物。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.39 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-7′), 7.02 (1H, s, H-2′), 6.97 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-6′), 6.77 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-5′), 6.11 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-8′), 5.02 (1H, m, H-3), 4.00 (2H, m, H-8), 3.89 (1H, m, H-5), 3.58 (1H, s, H-4), 2.11 (1H, m, H-6a), 2.08 (1H, brs, H-2a), 1.94 (1H, m, H-6b), 1.77 (1H, t, J = 10 Hz, H-2b), 1.13 (3H, t, J = 6.8 Hz, H-9)；13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 173.5 (C-7), 165.9 (C-9′), 149.1 (C-4′), 146.2 (C-3′), 145.6 (C-7′), 125.8 (C-1′), 121.8 (C-6′), 116.3 (C-5′), 115.0 (C-2′), 114.3 (C-8′), 73.6 (C-1), 71.5 (C-3), 70.0 (C-4), 67.5 (C-5), 60.7 (C-8), 37.6 (C-6), 35.7 (C-2), 14.3 (C-9)。以上数据与文献报道一致[18]，故鉴定化合物12为3-O-咖啡酰奎宁酸乙酯。

3.2 对SK-HEP-1细胞毒活性

由于化合物1～4和6的样品量比较大，故对其进行体外抑制人肝腹水腺癌细胞SK-HEP-1的实验。镜下观察可见，化合物1组细胞形态不规则，破碎明显，其余各化合物不同剂量组细胞形态规则，生长良好，未见细胞破碎等现象，阳性药顺铂组细胞出现明显的细胞破碎现象，其抑制率为93.26%。各化合物对SK-HEP-1细胞抑制率及IC50值见表 1。从表 1可知，化合物1的IC50值为34.47 μg/mL，对SK-HEP-1细胞株具有较高的细胞毒活性。

表 1 化合物1~4、6对SK-HEP-1细胞活性的影响(x±s, n=6) Table 1 Effect of compounds 1—4 and 6 against SK-HEP-1 cell line (x±s, n = 6)
4 讨论

本实验在对皂角刺化学成分系统研究的基础上，对所得化合物进行人肝腹水腺癌细胞株SK-HEP-1的细胞毒活性实验，发现化合物1具有较好的细胞毒活性，为皂角刺的综合开发利用提供实验依据。

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