天麻Gastrodiae Rhizoma为兰科植物天麻Gastrodia elata Bl. 的干燥块茎，列于《神农本草经》上品，为我国传统贵重药材。天麻性甘、平，归肝经，有平肝息风止痉的功效，临床上主要用于头痛眩晕、肢体麻木、小儿惊风、癫痫抽搐、破伤风等的治疗^[1]。天麻的主要成分为酚类化合物及其苷、多糖、甾醇等^{[4, 5, 6, 7, 8]}。其中天麻素是主要有效成分，多项药理研究表明天麻素具有镇痛的作用，临床上多用于治疗头痛、眩晕、神经痛、肢体麻木、手足不遂、冠心病、心绞痛等，因此包括《中国药典》2010年版在内的多项标准都是以天麻素作为指标评价天麻饮片的质量。目前，也有较多文献指出天麻中所含香荚兰醇、香荚兰醛、对羟基苯甲醇、对羟基苯甲醛及巴利森苷类成分均具较强的生理活性^{[9, 10, 11, 12, 13, 14]}，表明仅采用单一指标测定天麻素量的方法，对天麻内在质量的判断不够全面。

本研究建立了HPLC-MS法同时测定天麻中天麻素、对羟基苯甲醇、香荚兰醇、对羟基苯甲醛、香荚兰醛、巴利森苷B、巴利森苷C和巴利森苷A 8个成分的量，以期客观、综合评价天麻饮片的质量，并为其药效物质基础研究提供方法学依据。

Shimadzu LC 20A型高效液相色谱仪；AB Sciex Qtrap 5500型三重四级杆线性离子阱质谱仪，配有ESI离子源，Analyst 1.5.1 Software工作站，美国AB公司。Shimadzu Librorael-40SM型电子分析天平，精确到0.01 mg。

天麻素（批号00256-2013）、香荚兰醇（批号01083-2013）、香荚兰醛（批号01147-2013）对照品，购自南京泽朗医药科技有限公司，对羟基苯甲醇（批号2014-0192）、对羟基苯甲醛（批号2014-0193）、巴利森苷A（批号2014-0078）、巴利森苷B（批号2014-0079）、巴利森苷C（批号2014-0080）对照品，购自南京森贝伽生物科技有限公司；上述对照品经HPLC法检测，质量分数均大于98.0%。甲醇为色谱纯，水为纯净水，其余试剂均为分析纯。

收集产地为安徽（编号为S1～S3）、云南（编号为S4～S6）、陕西（编号为S7～S9）、贵州（S10～S11）的11批天麻饮片，均经南京中医药大学吴啟南教授鉴定为兰科天麻属植物天麻Gastrodia elata Bl. 的干燥块茎。

Hypersil C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.5%醋酸水溶液（A）-0.5%醋酸甲醇溶液（B），线性梯度洗脱：0～10 min，98% A；10～60 min，98%～60% A；60～75 min，60% A；体积流量0.8 mL/min；检测波长270 nm；柱温30 ℃；进样量20 μL。

离子源为电喷雾离子化源（ESI）；多反应监测模式（MRM）进行定量分析；采用负离子检测模式；源喷射电压（IS）为-4 500 V；离子源温度为550 ℃；雾化气（N₂）压力为379.28 kPa（55 psi）；辅助气（N₂）压力为379.28 kPa（55 psi）；气帘气（N₂）压力为241.36 kPa（35 psi）。接口加热，全程通入氮气，MRM模式定量。监测的离子对、驻留时间（Dwell）、解簇电压（DP）、碰撞室射出电压（CXP）和碰撞能量（CE）等见表 1。8个被测成分的多重反应监测色谱图见图 1。

表 1(Table 1)

表 1 8种成分的质谱数据 Table 1 HPLC-ESI-MSn data of eight components 成分 tR/min 母离子质荷比 (m/z) 子离子质荷比 (m/z) 驻留时间/ms DP/V CE/eV CXP/V 天麻素 15.36 285.047 122.957 100 -75 -14 -13 对羟基苯甲醇 20.39 122.956 105.962 100 -75 -14 -11 香荚兰醇 28.07 152.953 136.020 100 -75 -14 -9 对羟基苯甲醛 34.91 120.900 93.000 100 -190 -31.8 -7 香荚兰醛 42.65 150.676 135.929 100 -105 -16 -15 巴利森苷B 49.20 727.005 423.080 100 -150 -36 -27 巴利森苷C 51.74 727.005 423.080 100 -150 -36 -27 巴利森苷A 58.69 995.113 727.114 100 -65 -38 -27

表 1 8种成分的质谱数据 Table 1HPLC-ESI-MSn data of eight components

1-天麻素 2-对羟基苯甲醇 3-香荚兰醇 4-对羟基苯甲醛 5-香荚兰醛 6-巴利森苷B 7-巴利森苷C 8-巴利森苷A 1-gastrodin 2-p-hydroxybenzyl alcohol 3-vanillyl alcohol 4-vanillin 5-p-hydroxybenzaldehyde 6-parishin B 7-parishin C 8-parishin A 图 1 对照品溶液 (A) 和供试品溶液 (B) 8种成分的MRM色谱图Fig.1 MRM chromatograms of eight components in reference solution (A) and sample solution (B)

取各对照品适量，加水制成含天麻素120.60 μg/mL、对羟基苯甲醇184.20 μg/mL、香荚兰醇3.06 μg/mL、对羟基苯甲醛10.60μg/mL、香荚兰醛0.69 μg/mL、巴利森苷B 95.536 mg/mL、巴利森苷C 445.73 μg/mL、巴利森苷A 311.66 μg/mL的混合对照品溶液。

取本品粉末（过3号筛）约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，放置2 h，时时振摇，称定质量，加热回流3 h，放冷，再称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，浓缩至近干，残渣加甲醇-水（3∶97）混合溶液溶解，转移至25 mL量瓶中。用甲醇-水（3∶97）混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

精密量取混合对照品溶液4 mL，置于5 mL量瓶中，加水稀释至刻度。用倍比稀释的方法以甲醇-水（3∶97）混合溶液制成系列对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下，分别进样20 μL，每个质量浓度进3针，测定峰面积值。以峰面积平均值与质量浓度进行线性回归。将混合对照品溶液用水不断稀释后分析，得到8种成分的LOD值（S/N≈3）和LOQ值（S/N≈10）。结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 8种成分的回归方程及LOD、LOQ值 Table 2 Regression equations and values of LOD and LOQ of eight components 化合物 回归方程 线性范围/(μg∙mL-1) r LOD/(ng∙mL-1) LOQ/(ng∙mL-1) 天麻素 Y＝2.24×105 X－2.99×105 6.03～ 96.48 0.999 7 2.19 10.95 对羟基苯甲醇 Y＝1.36×104 X＋3.72×103 9.21～147.36 0.999 5 1.38 6.91 香荚兰醇 Y＝7.56×102 X＋1.90×101 0.15～ 2.45 0.999 2 0.47 4.72 对羟基苯甲醛 Y＝1.11×105 X＋7.93×103 0.53～ 8.48 0.999 6 0.29 0.88 香荚兰醛 Y＝1.73×107 X―8.30×104 0.03～ 0.55 0.999 8 0.65 2.62 巴利森苷B Y＝3.01×105 X＋2.72×106 47.77～764.29 0.999 5 2.81 8.43 巴利森苷C Y＝4.19×105 X－3.04×106 22.29～356.58 0.999 7 3.92 19.60 巴利森苷A Y＝6.67×105 X＋1.18×106 15.58～249.33 0.999 2 3.76 18.80

表 2 8种成分的回归方程及LOD、LOQ值 Table 2Regression equations and values of LOD and LOQ of eight components

取编号为S7的天麻饮片制备的供试品溶液，进样20 μL，连续进样6次，依法测定，分别记录峰面积，计算RSD。结果天麻素、对羟基苯甲醇、香荚兰醇、对羟基苯甲醛、香荚兰醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A峰面积的RSD分别为2.47%、3.53%、1.22%、2.84%、2.99%、3.06%、1.60%和0.54%。

取编号为S7的天麻饮片制备的供试品溶液，于0、1、2、4、6、8 h分别进样20 μL，依法测定，分别记录峰面积，计算RSD。结果天麻素、对羟基苯甲醇、香荚兰醇、对羟基苯甲醛、香荚兰醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A峰面积的RSD分别为2.71%、1.92%、3.48%、1.50%、2.33%、2.61%、3.09%和1.18%，表明供试品溶液中8种成分在8 h内稳定。

取编号为S7的天麻饮片6份，每份2 g，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定并计算6份样品中8种成分的平均质量分数和RSD。结果，天麻素、对羟基苯甲醇、香荚兰醇、对羟基苯甲醛、香荚兰醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A的平均质量分数分别为2.573、4.101、0.075 75、0.272、0.018 55、22.265、10.368、7.964 mg/g，RSD分别为2.78%、1.90%、3.33%、3.82%、2.66%、4.05%、2.00%、1.52%。

取编号为S7的天麻饮片6份，每份1 g，精密称定，精密加入混合对照品溶1 mL（含天麻素2.293 mg/mL、对羟基苯甲醇0.364 mg/mL、香荚兰醇0.082 6 mg/mL、对羟基苯甲醛0.311 mg/mL、香荚兰醛0.199 mg/mL、巴利森苷B 24.261 mg/mL、巴利森苷C 12.836 mg/mL、巴利森苷A 7.281 mg/mL），按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，依法测定并计算6份样品中8种成分的平均加样回收率和RSD。结果，天麻素、对羟基苯甲醇、香荚兰醇、对羟基苯甲醛、香荚兰醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A的平均加样回收率分别为97.73%、95.56%、97.55%、94.51%、100.12%、102.70%、99.30%、96.81%，RSD分别为2.39%、2.14%、3.03%、1.07%、2.55%、1.91%、1.15%、1.35%。

取11批天麻饮片，每批3份，按“2.3.2”项下方法分别制备供试品溶液，各进样20 μL，以各成分峰面积按外标法对其中的天麻素、对羟基苯甲醇、香荚兰醇、对羟基苯甲醛、香荚兰醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A进行测定，并计算每批3份的平均质量分数，结果见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 11批饮片中8种成分的质量分数 Table 3 Determination of eight components in Gastrodiae Rhizoma 样品 产地 质量分数/(mg∙g-1) 天麻素 对羟基苯甲醇 香荚兰醇 对羟基苯甲醛 香荚兰醛 巴利森苷B 巴利森苷C 巴利森苷A S1 安徽 1.979 3.915 4.069×10-3 0.446 0.015 67 14.909 6.974 8.090 S2 3.359 1.322 0.016 07 0.193 0.024 28 23.882 8.915 8.164 S3 4.396 0.507 0.049 32 0.404 0.022 18 13.865 2.681 5.508 S4 云南 4.781 0.707 0.024 58 0.358 0.025 94 21.121 6.137 15.463 S5 4.565 1.265 9.528×10-3 0.373 0.020 73 20.273 6.805 13.679 S6 1.989 11.462 0.170 0.238 0.018 16 23.845 9.227 8.430 S7 陕西 2.563 4.198 0.078 79 0.263 0.017 31 22.888 10.795 8.032 S8 4.345 0.452 4.706×10-3 0.395 0.023 11 13.696 2.739 5.274 S9 2.513 3.966 0.088 48 0.248 0.023 45 22.958 11.326 8.346 S10 贵州 0.708 28.362 0.472 1.100 0.068 30 11.605 2.333 10.176 S11 2.970 4.701 0.094 15 0.292 0.029 26 24.136 14.704 8.214 *表明天麻素质量分数低于《中国药典》2010年版规定的0.20% *contents of gastrodin below 0.20%,minimum value defined in Chinese Pharmacopoeia (Volume I,2010)

表 3 11批饮片中8种成分的质量分数 Table 3Determination of eight components in Gastrodiae Rhizoma

结合文献报道^[15]，以《中国药典》2010年版天麻定量测定中提取方法为依据，本实验比较了超声提取、加热回流提取等不同提取方式，结果发现加热回流提取优于超声提取，且2次加热回流提取之间间隔较长时间优于2次加热回流提取连续进行。

本实验结果表明，天麻饮片中所含天麻素、对羟基苯甲醇、香荚兰醇、对羟基苯甲醛、香荚兰醛、巴利森苷B、巴利森苷C、巴利森苷A这8种成分的量差异较大，同一个成分的量相差甚至十几至几十倍，分析其原因，主要有（1）产地的影响，我国幅员辽阔，适宜天麻种植的产区较多，不同地区的气候、光照、海拔等环境因素不尽相同，对天麻的生长及其生长过程中各种次生代谢产物的累积也不相同。（2）产地加工的影响，中药材采收后均需在产地进行一定的初加工处理，以便保存其中的主要成分和后续的运输、贮藏，但是不同地区的产地加工方法也不相同，如有的地区对天麻采用蒸的方法，有的地区采用煮的方法，甚至有的地区还用硫磺进行熏蒸。（3）炮制工艺的影响，饮片来源于药材，又不同于药材，还需要经过一定的炮制工艺。不同地区的炮制习惯、不同饮片厂的炮制工艺具体参数和炮制设备也都有所差异，这也会造成各种成分量的差异。此外需要注意的是，受试样品中仍有少数几批的天麻素质量分数低于《中国药典》2010年版的规定（不少于0.20%），说明目前市场上销售的天麻质量问题不容忽视。

从化学结构上观察，巴利森苷A、B、C均为天麻素和柠檬酸结合而成的酯类。本实验结果表明，其量较高，大多数均高于天麻素，有的甚至超出10倍以上。此外，还有一些尚未确定结构的化合物在饮片中亦有较高的量。上述这些成分的存在或其量高低可能会对天麻饮片的质量产生影响。因此，还需对这些质量分数较高的化合物进行结构确证和归属，探索它们对天麻药效的贡献及它们与天麻素之间的内在转化关系，并为进一步完善天麻的质量控制方法提供技术支持和研究基础。