栀子Gardeniae Fructus为茜草科植物栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实^[1]，具有泻火除烦、清热利湿、凉血解毒等功效。栀子果实的化学成分主要包括环烯醚萜苷类、二萜类（西红花苷类）、有机酸酯类以及其他类化学成分^[2]。其中栀子苷具有抗炎、解热、利胆和轻泻作用；京尼平苷酸具有抗肿瘤和抗氧化的作用；京尼平1-β-D-龙胆二糖苷有文献报道其能改善戊巴比妥钠引起的心力衰竭；绿原酸为栀子中主要有机酸酯类成分，具有显著的抗癌作用及保肝利胆作用；西红花苷-I和西红花苷-II是西红花、栀子中共有的色素类成分，具有去黄疸、利胆及明显的降血脂作用^[3]。近年来，化学模式识别已广泛应用于中药材的质量控制与品质评价^{[4, 5, 6]}。目前已有一些关于栀子指纹图谱化学模式识别方面的研究报道，但应用多波长指纹图谱化学模式识别方面的研究依然少见。本实验研究不同产地的67批栀子药材的多波长指纹图谱，并基于指纹图谱信息采用系统聚类、主成分分析（PCA）等化学模式识别方法进行研究，为下一步栀子全国生产区划研究提供理论支持。

本实验采集了江西、湖南、湖北、四川、重庆、广西、福建、浙江、贵州、河南、陕西、安徽等地共67批栀子药材，经江西中医药大学药学院葛菲教授鉴定为栀子Gardenia jasminoides Ellis的干燥成熟果实，采集的栀子放烘箱60 ℃烘干，放入自封袋中保存备用。样品来源见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 样品来源 Table 1 Sample sources 编号 采收地点 编号 采收地点 1 江西省九江市湖口县武山镇何家埂 35 浙江省杭州市临安县於潜镇建新村/龙池里 2 江西省九江市湖口县武山镇塘落村 36 湖南省浏阳市沙市镇东门村野鸡冲 3 江西省吉安市新干县界埠镇南排镇 37 湖南省宁乡县青山桥镇柳家塘村 4 江西省吉安市新干县界埠镇胡家老村 38 湖南省永州市零陵区邮亭圩镇毛坪村 5 江西省宜春市樟树市临江镇黄土岗村 39 湖南省武冈市邓家铺镇东风村 6 江西省宜春市樟树市义城镇罗岗村 40 湖南省衡阳县演陂镇欧泉塘村 7 江西省宜春市丰城市隍城镇南田村 41 湖南省隆回县吴家冲镇 8 江西省南昌市进贤县张公镇渣兰村 42 湖南省邵东县杨桥镇两顺村 9 江西省抚州市金溪县双塘镇竹桥村 43 湖南省邵东县牛马司镇光华村 10 江西省抚州市金溪县秀谷镇 44 湖南省张家界市武陵源区协合乡插旗峪村 11 江西省抚州市金溪县双塘镇竹桥村 45 湖南省慈利县零阳镇柳林村杨湾 12 福建省宁德市福鼎市贯岭镇茗洋村 46 湖北省武汉市黄陂区木兰乡梳店村 13 福建省宁德市福鼎市分水关 47 湖北省大悟县新城镇段家畈/江冲村 14 福建省龙岩市小池镇 48 湖北省孝昌县花园镇龙井村左家河 15 福建省宁德市霞浦县东安 49 湖北省孝感市孝南区西河镇安平庙林果场 16 重庆市南川县三泉镇 50 湖北省蕲春县漕河镇清水河林场 17 四川省内江市资中县 51 湖北省英山县南河镇界碑石村 18 四川省资阳市雁江区 52 湖北省英山县杨柳镇水口桥村冷水塘组 19 四川省广元市青川县 53 湖北省长阳土家自治县都镇湾镇金福村 20 四川省绵阳市柏林镇 54 贵州省铜仁市德江县青龙镇 21 四川省万源市中坪乡 55 浙江省永嘉 22 四川省南充市西充县 56 福建省福州 23 四川省达州市达县 57 河南省唐河县马扶乡（蒸晒） 24 广西南宁市四塘镇那垌村 58 河南省唐河县马扶乡（晒干） 25 广西南宁市隆安县 59 安徽省霍山县漫水河镇 26 广西南宁市武鸣县 60 安徽省青阳县西华乡 27 广西南宁市邕宁县 61 贵州省贵阳 28 广西省玉林市兴业县城隍镇 62 陕西省汉中西乡县 29 广西省崇左市扶绥县东罗镇 63 河南省唐河 30 浙江省温州市永嘉县下桥镇吴垟村 64 福建省龙岩 31 浙江省温州市平阳县昆阳镇莲花山 65 四川省广安 32 浙江省温州市文成县金星乡 66 广西贵港 33 浙江省丽水市景宁县澄照乡三石村 67 江西省婺源 34 浙江省杭州市淳安县枫树岭

表 1 样品来源 Table 1 Sample sources

Waters 2695 separations module高效液相色谱仪（Waters 2996 Photodiode Array Detector检测器、Waters Empower化学工作站，美国Waters公司）；BP224S型万分之一电子天平（Sartorius公司）；KQ—300E超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。

甲醇（色谱纯，美国TEDIA）；乙腈（色谱纯，美国ACS）；甲醇（分析纯，西陇化工股份有限公司）；水为娃哈哈纯净水；京尼平苷酸（批号111828-201102，质量分数96.0%）、绿原酸（批号110753-201314，质量分数96.6%）、栀子苷（批号110749-201316，质量分数97.5%）、西红花苷-I（批号111588-201202，质量分数91.1%）、西红花苷-II（批号111589-201304，质量分数92.4%）购于中国食品药品检定研究院，京尼平1-β-D龙胆二糖苷（批号为ZM0501BA14，质量分数＞98.0%）购于上海源叶生物科技有限公司。

称取本品粉末（过四号筛）约0.1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇25 mL，称定质量，超声处理40 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过。精密量取续滤液10 mL，置25 mL量瓶中，加75%甲醇至刻度，摇匀，经0.45 μm微孔滤膜滤过即得。

精密称定各对照品适量，分别置于50 mL棕色量瓶中，用适量75%甲醇溶液溶解并定容至刻度，分别制成含京尼平苷酸10.176 μg/mL、京尼平1-β-D龙胆二糖苷201.292 μg/mL、绿原酸4.443 6 μg/mL、栀子苷311.61 μg/mL、西红花苷-I 175.276 4 μg/mL、西红花苷-II 17.371 2 μg/mL的对照品储备液，经0.45 μm微孔滤膜滤过即得。

Durashell C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水（B）；梯度洗脱：0～18 min，8%～15% A；18～25 min，15%～23% A；25～40 min，23%～35% A；40～50 min，35%～50% A；检测波长238、330、440 nm；柱温30 ℃；体积流量0.8 mL/min；进样量：10 μL。

将“2.2”项下混合对照品储备液，分别用75%甲醇稀释2、4、8、16、32、64倍，按“2.3”项下的色谱条件测定，进样10 μL，以进样量10 μL中对照品质量（μg）为横坐标，最佳检测波长下的峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 线性关系 Table 2 Linear relationship 对照品 标准曲线 r 线性范围 / μg 京尼平苷酸 Y＝1 610 765 X－95 0.999 9 0.101 76～0.001 59 京尼平1-β-D龙胆二糖苷 Y＝1 144 290 X－1 123 0.999 9 2.012 92～0.031 45 绿原酸 Y＝4 025 629 X＋744 0.999 7 0.044 44～0.000 69 栀子苷 Y＝1 859 824 X＋117 0.999 9 3.116 10～0.048 68 西红花苷-I Y＝7 633 873 X＋10 739 0.999 9 1.752 76～0.027 38 西红花苷-II Y＝8 706 055 X－576 0.999 9 0.173 71～0.002 71

表 2 线性关系 Table 2 Linear relationship

取稀释2倍的混合对照品溶液10 μL，按“2.3”项色谱条件下，连续进样5次，测定峰面积。栀子苷、西红花苷-I、西红花苷-II、绿原酸、京尼平1-β-D龙胆二糖苷、京尼平苷酸峰面积的RSD分别为0.55%、0.50%、0.41%、0.48%、0.49%、0.54%，表明仪器精密度良好。

取稀释2倍的供试品溶液，分别于样品制备后0、2、4、8、12、24 h进样10 μL，测峰面积，栀子苷、西红花苷-I、西红花苷-II、绿原酸、京尼平1-β-D龙胆二糖苷、京尼平苷酸的RSD分别为1.21%、1.33%、0.97%、1.74%、1.51%、1.82%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

取同一药材，按“2.1”项平行处理5份，同法制成供试品溶液，测峰面积，结果栀子苷、西红花苷-I、西红花苷-II、绿原酸、京尼平1-β-D龙胆二糖苷、京尼平苷酸峰面积的RSD分别为1.36%、1.89%、0.59%、1.30%、0.77%、1.43%，表明此法重复性良好。

取栀子样品按照“2.1”项制成供试品溶液，按“2.3”项色谱条件进样分析，得到各样品的HPLC指纹图谱。利用2004A版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》计算软件确定了16个共有峰。同时精密吸取混合对照品溶液适量，按“2.3”项色谱条件进样10 μL，参照6个对照品的色谱行为及其DAD检测紫外光谱图，在样品色谱图上对其峰进行指认，确认了6个成分，其中2号峰为京尼平苷酸，6号峰为京尼平1-β-D龙胆二糖苷，7号峰为绿原酸，8号峰为栀子苷，12号峰为西红花苷-I，13号峰为西红花苷-II，结果见图 1。

2-京尼平苷酸 6-京尼平1-β-D龙胆二糖苷 7-绿原酸 8-栀子苷 12-西红花苷-I 13-西红花苷-II S1～S67-1～67号样品 R-共有指纹图谱 2-geniposidic acid 6-genipin-1-β-D-gentiobioside 7-chlorogenic acid 8-gardenoside 12-crocin-I 13-crocin-II S1－S67-1－67 samples R-common HPLC fingerprint图 1 67批栀子药材指纹图谱Fig. 1 HPLC fingerprint of 67 batches of Gardeniae Fructus samples

利用国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2004A）”设置S1为参照指纹图谱，时间窗宽度为0.1，剪切前5 min溶剂峰后，采用多点校正后进行自动匹配，得到67批栀子药材在238、330、440 nm下的共有指纹图谱R（图 1）和指纹图谱相似度结果。根据软件计算结果确认67批样品中有16个共有峰，保留时间的RSD均＜1%、同一成分峰面积的RSD比较大，各样品238、330、440 nm图谱相对于对照图谱的相似度均＞89%，数据表明栀子药材的化学成分组成较为相似，但各批次药材相同成分量差异较大，可见品质存在较大的差异，如要更为客观地反映栀子药材的内在品质需要进一步进行分析。

利用SPSS 19.0数据分析软件，将67批样品的16个共有峰峰面积数据进行Z标准化后，选用组间联接（Between-groups linkage）聚类方法，采取欧氏距离（Euclidean distance）度量标准，计算样品的相似性程度，聚类结果见图 2。从聚类图结果可将67批样品聚类为3类，样品1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、14、16、17、25、26、27、28、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、62、67为一类，样品18、19、20、21、22、23、24、29、45、46、60、61、63、64、65、66为一类，样品9、12、13、15、30、31、33为一类。根据综合主成分值判断前2类栀子药材质量较优。即江西、四川、广西、湖南、湖北、安徽产栀子质量普遍较优，其余产地质量较为一般。

图 2 聚类分析图Fig. 2 Cluster analysis of Gardeniae Fructus

PCA也称主分量分析，它在尽可能保留原有信息的基础上将高维空间中的样本映射到较低维的主成分空间中，使数据矩阵简化，降低维数，寻找少数几个由原始变量线性组合的主成分（也称潜变量），以揭示数据结构特征，提取化学信息，已经广泛应用于中药材的品质综合评价与分类^[7]。本实验将67批样品16个共有峰峰面积导入SPSS 19.0软件，进行PCA。对栀子共有峰峰面积Z标准化处理后，进行了相关系数矩阵、方差分解主成分提取分析和初始因子载荷矩阵的计算，由方差分解主成分提取结果可知，共有3个主成分特征值大于1，故提取3个主成分，且3个主成分的累积方差贡献率

大于85.6%，所以提取的3个主成分足以评价栀子的品质。将得到的特征向量与标准化后的数据相乘，得到主成分表达式，再以每个主成分所对应的特征值占提取主成分总的特征值之和的比例作为权重得到了主成分综合模型，根据主成分综合模型计算67批样品的综合主成分值，并按综合主成分值进行系统聚类，综合主成分值聚类结果见图 3。从聚类图结果可将67批样品聚为3类，样品1、2、3、4、5、6、7、8、10、16、17、18、19、20、21、22、23、28、29、32、34、35、37、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、55、57、58、59、60、61、62、64为一类，样品12、13、14、24、25、26、27、30、31、33、36、38、39、54、

图 3 综合主成分值聚类分析图Fig. 3 Cluster analysis of principal component values

56、63、65、66为一类，样品9、11、15、67为一类。根据综合主成分值判断，前2类栀子药材质量较优。即江西、四川、广西、浙江、湖南、湖北、安徽产栀子质量普遍较优，其余产地质量较为一般。栀子质量栀子的主成分分析结果与聚类结果类似，但仍存在一定的差异。

从以往的栀子指纹图谱研究文献可以发现，大多采用254 nm或者其他单一波长作为栀子成分的检测波长，由于中药成分复杂，采取单一检测波长会出现峰组成单一、峰面积普遍偏小以及特征峰数量少等情况，后续的栀子指纹图谱相似度的计算也无法客观地反映栀子药材的成分体系，也就无法客观地对栀子品质进行评价。栀子中主要含有环烯醚萜苷类、有机酸类、西红花苷等类型化合物，本实验使用DAD检测器对样品进行190～500 nm全波长扫描，并对各波长下的色谱进行分析比较。结果发现3类化合物的最佳检测波长分别是238、330、440 nm，由于中药成分的复杂性决定了单一成分或指标难以客观评价中药质量，如果只选取单一波长进行检测，可能造成峰面积信息的丢失或残缺，所以本实验选择238、330、440 nm为检测波长，各峰分离良好，特征峰明显且峰形较好，3波长图谱最大可能地获取了色谱组分信息以反映栀子化学成分组成的全貌。

比较相似度评价、聚类分析和PCA方法发现其结果不完全相同。分析原因可能是中药本身是个多成分复杂体系，在进行中药指纹相似度计算时，由于人工的多点矫正，可能会出现特征峰矫正不完全导致信息缺失，再者由于采用了夹角余弦和相关系数法来计算指纹图谱相似度，无法检测峰面积的线性波动，而聚类分析和PCA就是在峰面积信息的基础上进行计算的。另外，聚类分析和PCA的结果也存在差异，其原因可能是在PCA时只提取了特征值大于1的3个主成分，虽然3个主成分的累计方差贡献率≥85.6%，但被忽略的特征值小于1的成分仍然会对聚类结果有贡献，所以势必会出现聚类分析和主成分分析结果有差异的情况。

从栀子指纹图谱相似度结果可以看出，各样品238、330、440 nm图谱相对于对照图谱的相似度均＞89%，聚类分析与PCA结果也将67批药材归为不同的3类，数据表明栀子药材的化学成分组成较为相似，但各批次药材仍存在差异，表现为不同批次药材化学组成和同一成分不同批次之间存在差异，分析原因可能是不同地区的土壤、气候、水分、矿物质分布情况、药材的采收期及药材种源等，都对中药材的质量产生一定的影响。自然生态环境与中药资源的质量（有效成分的形成和积累）、数量密切相关，是其生态适宜性评价的客观基础，也是药材生产区划的关键所在；同时本实验还进一步发现，不同产地的栀子样品仍能部分聚成一类。这说明栀子药材具有一定的产地适应性。综上所述，将聚类分析与PCA相结合评价栀子指纹图谱的差异性及相似性，不仅可以进行栀子药材质量控制，还可以为下一步栀子全国生产区划研究提供理论支持。