姜黄Curcuma longa L. 是我国传统中药，是姜科姜黄属多年生草本植物。姜黄属植物全世界有60多种，盛产于东南亚和澳大利亚北部^[1]，中国主要分布在东南至西南部。姜黄属植物主要包含挥发油和姜黄素类，其中姜黄素是姜黄的主要成分^[2]。研究表明，姜黄素具有抗炎、抗氧化、抗癌等药理作用^{[3, 4, 5]}，可以改善糖尿病、代谢性疾病、自身免疫疾病、动脉粥样硬化、关节炎、中风、外周神经病、肠炎和脑外伤等多种疾病症状^[6]。姜黄素对阿尔茨海默病等神经变性病具有很强的神经保护作用^[7]。

苯丙烷类代谢途径是一切含苯丙烷骨架物质的直接或间接合成途径。苯丙烷类代谢可生成类黄酮、木质素等多种次生代谢产物，这些次生产物在植物的生长发育、抗病、抗逆反应中起着重要的作用^[8]。姜黄素的生物合成是通过苯丙烷代谢途径进行的，苯丙氨酸解氨酶（PAL）是植物苯丙烷类代谢第一步反应的关键酶和限速酶，它催化L-苯丙氨酸解氨酶生成反式肉桂酸，再由反式肉桂酸生成香豆酸、阿魏酸、芥子酸等中间产物，进一步形成对香豆酸辅酶A和阿魏酸辅酶A，然后在姜黄素合成酶催化下与丙二酰辅酶A生成姜黄素^{[9, 10]}。

PAL基因与植物酚类、类黄酮、木质素等次生代谢产物的合成密切相关^[11]。植物PAL基因为多基因家族所编码，PAL基因的表达受发育和环境信号（如温度、光质、机械损伤、激素和营养等）的调节，表现出严格的组织和发育特异性^{[12, 13]}。目前已从多种植物中克隆到PAL基因并进行了表达分析^{[14, 15]}，但在姜黄中尚未见到包括PAL基因在内的苯丙烷类代谢途径中相关酶基因的报道。本研究以姜黄叶片为材料，开展姜黄PAL基因（CurPAL）全长cDNA的克隆，并进行序列分析和系统进化等生物信息学方面的研究，为PAL基因功能分析和遗传转化奠定基础，为姜黄次生代谢产物的生物合成机制提供理论依据。

姜黄叶片于2013年10月采自华侨大学温室，经唐源江副研究员鉴定为姜黄Curcuma longa L.，清洗干净后迅速放入液氮中冷冻，置于-80 ℃保存备用。

M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit，pMD19-T载体，LA Taq Polymerase，DH5α感受态，DNA标准相对分子质量DNA Marker DL2000，Takara 5’-Full RACE Kit with TAP，Takara 3’-Full RACE Core Set with PrimeScript^TM RTase均购于宝生物工程（大连）有限公司；各引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。柱式植物RNAout试剂盒购于北京天恩泽基因科技有限公司，TIANScript cDNA第一链合成试剂盒购自天根生化科技有限公司，逆转录引物为试剂盒提供的oligo (dT)₁₅。

取叶样品液氮中研磨，根据北京天恩泽基因科技有限公司的柱式植物RNAout试剂盒说明书提取姜黄总RNA，-80 ℃保存，分别用紫外分光光度计和电泳检测其浓度和纯度。以姜黄总RNA为模板，根据TIANScript cDNA第一链合成试剂盒进行反转录，合成cDNA第一链，反转录产物置于-80 ℃保存，备用。

根据小果野蕉Musa acuminata Colla、生姜Zingiber officinale Rosc等芭蕉目植物PAL基因的序列，设计一对保守序列引物PAL-F和PAL-R（表 1），以上述合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增。RT-PCR反应体系为0.4 μL的TaKaRa LA Taq（5 U/μL），引物PAL-F（10 μmol/L）和PAL-R（10 μmol/L）各1.0 μL，cDNA 1.0 μL，2.0 μL的dNTP（2.5 mmol/L），2.5 μL的10×缓冲液，17.1 μL 的ddH₂O。PCR反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸70 s，30个循环；72 ℃延伸7 min。

姜黄PAL全长cDNA的5’、3’端的克隆采用RACE的方法。根据测序得到的PAL片段序列信息设计RACE引物，在cDNA 5’和3’端分别设计2条特异性引物（表 1），并利用Takara 5’-Full RACE Kit with TAP和Takara 3’-Full RACE Core Set with PrimeScript^TM RTase分别进行2次巢式扩增获得姜黄PAL基因的5’和3’末端序列，按照试剂盒使用说明书进行实验操作。RACE反应体系为cDNA 1.0 μL、dNTP（2.5 mmol/L）2.0 μL、上、下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL、缓冲液（10×）2.5 μL、Dream Taq 酶0.15 μL 和ddH₂O 17.35 μL。PCR反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性35 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸2.5 min，35个循环，72 ℃延伸10 min。

根据拼接全长的ORF区域，设计一对保守序列引物ORF-F和ORF-R（表 1），以上述合成的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增。反应体系为0.75 μL的Trans Taq^TM HiFi DNA polymerase，引物ORF-F（10 μmol/L）和ORF-R（10 μmol/L）各1.0 μL，cDNA 2.0 μL，4.0 μL的dNTP（2.5 mmol/L），5.0 μL的10×Trans Taq^TM HiFi 缓冲液II，36.25 μL的ddH₂O。PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，30个循环；72 ℃延伸7 min。

用DNA纯化试剂盒回收PCR产物并与PMD19-T载体（Takara，日本）进行连接，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α，37 ℃过夜培养，通过在含有Amp的LB培养基上进行蓝白斑筛选，随机挑取白色菌落进行PCR鉴定，将获得的阳性克隆进一步提取质粒进行酶切鉴定后送上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序。

表 1(Table 1)

表 1 姜黄PAL基因克隆的引物序列 Table 1 Primer sequence for PAL cloing of C. longa 引物名称 引物序列 (5’-3’) PAL-F ATTGCAAAAGCCGAAGCAGGAC PAL-R ACCGGATTGCCCAGAAACTGG 3’-PAL-Outer ACACCCATCGGCGTCTCCAT 3’-PAL-Inner GCTTCGCCACCAAATCCATC 5’-PAL-Outer AGGGCAATCCGTTGTTGTAAAAGTCG 5’-PAL-Inner TGAGGGGATTATCGTTCACGGAGTTG ORF-F GCGCGGATCCATGGACAACACTCGTCTCGCGATC 下划线为BamHI酶切位点 ORF-R GCGCAAGCTTTTAGCAGATGGGAATTGGAGCGCC 下划线为HindIII酶切位点

表 1 姜黄PAL基因克隆的引物序列 Table 1 Primer sequence for PAL cloing of C. longa

用DNAstar进行基因片段拼接，利用NCBI-protein blast在线分析软件分析姜黄PAL基因与其他物种的同源性；用在线网站（http://isoelectric.ovh.-org/）预测基因编码氨基酸的等电点和蛋白质相对分子质量；利用NCBI/ORFfinder的ORF分析核酸序列的开放阅读框架，用ExPASy软件预测编码蛋白的基本性质和疏水性；应用TM-HMM软件分析编码蛋白的跨膜区；用SignalP软件预测编码蛋白信号肽；用COILS Server软件进行Coil区分析；用TargetP软件预测编码蛋白的亚细胞定位；用PORTER软件预测蛋白质二维结构；用SWISS-MODEL软件预测蛋白质三维结构；用Mega 5.0软件中的Clustal W软件对不同PAL氨基酸序列进行多重序列比对以后，再使用最大简约法构建系统发育树。

取5μL提取后的总RNA，在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，由图 1可以看出提取的姜黄叶片总RNA完整性好；总RNA在波长260 nm和280 nm处吸光度比值为2.0，纯度比较高。DNA污染少，可以进行后续的反转录反应。

M-Marker 1-姜黄总RNA的PCR产物 M-Marker 1-PCR product of total RNA图 1 姜黄叶片总RNAFig. 1 Total RNA of C. longa leaves

根据小果野蕉、生姜等姜科植物PAL基因的序列，设计一对引物，从姜黄叶片cDNA中扩增出一条250～500 bp长的特异性条带（图 2），经测序该片段长度为419 bp；Blastx比对分析表明其与多个PAL基因有较高的同源性，确认为姜黄PAL基因序列。

M-Marker 1-CurPAL基因的PCR产物 M-Marker 1-PCR product of CurPAL图 2 CurPAL基因保守序列Fig. 2 Conserved sequence of CurPAL

采用RACE技术进行cDNA两端序列的扩增，经过3’-RACE获得1条1 204 bp的片段（图 3-A），经过5’-RACE获得了1条在212 bp的片段（图 3-B），测序和拼接结果表明其为PAL基因的3’端和5’端序列。姜黄PAL基因的cDNA全长序列为1293 bp，Blastp比对结果表明，该基因推测的氨基酸序列与小果野蕉、菠萝Ananas comosus (Linn.) Merr. 的苯PAL有90%以上的相似性，推测其为姜黄的PAL基因。

M-Marker A-CurPAL基因3’-RACE产物 B-CurPAL基因5’-RACE产物 C-CurPAL基因ORF产物 M-Marker A-PCR product of 3’-RACE B-PCR product of 5’-RACE C-PCR product of ORF图 3 RACE扩增的CurPAL基因Fig. 3 Result of RACE amplification of CurPAL gene

姜黄PAL基因全长cDNA命名为CurPAL，经DNAstar及ORF finder软件分析表明，CurPAL的cDNA由243 bp的5’-UTR、123 bp的3’-UTR，包括12 bp的polyA结构及927 bp编码308个氨基酸的开放阅读框（ORF）组成（图 4）。244～246 bp的ATG及邻近序列（GCGATGG）符合真核生物起始密码ATG预测保守序（A/GXXTGG）；在3’-UTR处有典型的加尾信号“AATAAA”（图 4）；在CurPAL序列中，包含L6、V23、A7和L22 等脱氨基氨基酸残基（图 4）；它们催化活性位点N29、G30、N145、G146、N300、G301、HNQDV（78～82），这些活性位点与夹竹桃Nerium oleander L.^[16]中报道的相同，说明CurPAL是PAL蛋白质家族成员之一。该基因序列在GenBank数据库的登陆号为KJ780359。

粗、斜体表示起始密码子（ATG）；粗体加*表示终止密码子（TAA）；脱氨基位点为方框加粗体；催化激活位点为粗体加下划线；左侧数字为核苷酸序号 Start codon is in bold and italics,stop codon is indicated by an asterisk and bold,and the deamination site are boxed and in bold,the catalytic active sites are underlined and in bold,nubers on the left margins represent nucleotide sequences图 4 CurPAL基因的核苷酸序列和推测的氨基酸序列Fig. 4 Nucleotide and deduced amino acid sequences of CurPAL

通过NCBI上的蛋白序列Blastp和ClustalW软件分析表明，CurPAL的氨基酸与其他植物PAL编码的氨基酸序列具有较高的同源性（大于75%，图 5），如与中国李Prunus salicina Lindl.、浙江红山茶Camellia chekiangoleosa Hu和拟南芥Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. 氨基酸序列的一致性达到78%，与辣椒Capsicum annuum L. 的一致性达到79%，与小果野蕉的一致性达到84%。

AET 41698.1-中国李 NP_181241-拟南芥 AAN32867.1-中粒咖啡 AEX32790.1-葡萄 AFC372-浙江红山茶 AAC33966.1-辣椒 AFG2632-土肉桂 ACG56648.1-小果野蕉 KJ780359-姜黄 AET 41698.1-P. salicina NP_181241-A. thaliana AAN32867.1-C. canephora. AEX32790.1-V.vinifera AFC372-C. chekiangoleosa AAC33966.1-C. annuum AFG2632-C. osmophloeum ACG56648.1-M. acuminata KJ780359-C. longa 图 5 CurPAL与其他植物PAL氨基酸序列多重比对Fig. 5 Multiple alignments of amino acid sequence between CurPAL and PAL from other plants

为研究CurPAL与其他植物PAL之间的亲缘关系，用Clastal W 对氨基酸序列比对后，利用Mega 5.0 软件通过Neighbor-Joining（NJ）法构建氨基酸序列的进化树（图 6），结果显示，姜黄与野蕉Musa balbisiana Colla和小果野蕉聚为一支，均为芭蕉目，其与野蕉的亲缘关系最近；双子叶植物中罂粟目、大戟目、蔷薇目、管状花目、侧膜胎座目聚为另一支。从进化树上看，相同科或类群的植物聚为一类，但不同植物间PAL也有很高的同源性，这也可推测PAL在进化过程中是相当保守的，CurPAL与野蕉在结构和功能上具有一定的相似性。

图 6 CurPAL与其他植物PAL氨基酸序列的系统进化分析Fig. 6 Phylogentic relationship of amino acid sequences between CurPAL and PAL from other plants

运用ProtParam工具分析CurPAL编码蛋白的理化性质，结果表明，CurPAL编码蛋白相对分子质量约为33 000，理论等电点为5.76，总共包括4 728个原子，分子式为C₁₄₈₄H₂₃₇₆N₄₁₀O₄₄₅S₁₃。CurPAL的负电荷氨基酸残基（Asp＋Glu）数为38，正电荷氨基酸残基（Arg＋Lys）数为31；在组成CurPAL蛋白的20种氨基酸中，丙氨酸所占的比例最高，达到13%，色氨酸所占的比例最低。CurPAL蛋白的不稳定指数为29.55，脂肪指数为100.49，根据Guruprasad方法表明CurPAL蛋白稳定；Grand average of hydropathicity（GRAVY）值为-0.022，肽链表现为亲水性；TM-HMM预测结果显示该蛋白不是膜蛋白，无跨膜结构域，定位于细胞质中，且N端不含有蛋白定位信号肽，说明CurPAL是一个可溶性蛋白。

运用PORTER在线软件进行姜黄PAL蛋白二维结构的预测（图 7），由预测的结果来看，CurPAL蛋白二维结构组分中，α-螺旋（H）占65.91%＞45%，β-折叠（E）占0.65%＜5%，无规则卷曲（C）占34.44%，α-螺旋和无规则卷曲是其蛋白质二级结构中量最大的结构元件，故CurPAL属于全α型蛋白。运用SWISS-MODEL在线软件进行CurPAL蛋白三维结构的预测（图 8），由预测的结果来看，本实验中的姜黄PAL蛋白是基于荷兰芹 [Petroselinum crispum (Mill.) Hill] PAL蛋白原子结构1w27.1的A链建模的，两者序列一致性达到78.57%，CurPAL 蛋白由同源四聚体构成，与其他植物相同^[17]。表明本实验克隆得到的PAL基因是正确的。

C-无规则卷曲 H-α-螺旋 E-β-折叠 C-coil H-α-helix E-β-extend图 7 CurPAL蛋白二维结构预测Fig. 7 Forecast for 2D structure of CurPAL protein

图 8 CurPAL蛋白三维结构预测Fig. 8 Forecast for 3D structure of CurPAL protein

苯丙氨酸解氨酶广泛存在于各种植物和少数微生物中。它是连接生物初级代谢和苯丙烷类代谢、催化苯丙烷类代谢第一步反应的酶，是苯丙烷类代谢的关键酶和限速酶，也是苯丙烷类代谢途径中研究最多的酶。它在类黄酮、木质素、香豆素、水杨酸、鞣质等次生代谢产物的合成过程中也起着很重要的作用。这些次生物质对植物生长发育、抗病害、防御紫外线等方面都有帮助。近年来，有关PAL基因的研究也成为研究热点。

本研究以姜黄的近缘物种的PAL基因序列设计简并引物，从姜黄成熟叶片中克隆了1个PAL基因片段并结合RACE的方法获得了5’和3’端序列，首次从姜黄中获得了1个PAL基因全长的cDNA序列，命名为CurPAL基因。生物信息学分析表明，CurPAL基因推测的氨基酸序列与已报道植物的PAL基因氨基酸序列有很高的一致性（大于75%），基于推导氨基酸序列与其他已报道植物PAL基因氨基酸序列多重比对和系统进化树分析，CurPAL基因和小果野蕉聚为一支，CurPAL序列包含L180、V181、L230、A231等脱氨基氨基酸残基，其催化活性位点分别为N234、G235、N356、D357、N358、H370、HNQDV（460～464），这些活性位点与水稻和玉米的相同，说明它们在结构和功能上有一定的相似性。可见，克隆得到的CurPAL基因是苯丙氨酸解氨酶基因。通过预测二维和三维结构表明CurPAL与荷兰芹PAL蛋白的结构一致性达到78.57%，由同源四聚体构成，不存在导肽和信号肽，无跨膜结构域，定位于细胞质中，肽链表现为亲水性；α-螺旋和无规则卷曲是其蛋白质二级结构中量最大的结构元件，β-转角和延伸链散布于整个蛋白质中。

姜黄素是通过苯丙烷代谢途径生成的，而苯丙氨酸解氨酶是苯丙烷代谢途径的一个关键酶和限速酶，其表达强度和酶活性将会影响姜黄素的合成。因此，本研究结果可为姜黄素类化合物代谢的分子调控机制奠定基础，为提高姜黄素含量以及姜黄遗传改良提供理论依据。