千金子为大戟科植物续随子Euphorbia lathyris L. 的干燥成熟种子，具有泻下逐水、破血消癥的功效；用于二便不通、水肿、痰饮、积滞胀满、血瘀经闭；外治顽癣、赘疣等症^[1]。现代研究表明千金子的药理作用主要有利尿、致泻、抗肿瘤、抗菌、镇痛、抗炎等作用^[2]。千金子有小毒，对胃肠道有很强的刺激作用，可以产生峻泻，强度为蓖麻油的3倍，致泻成分为千金子甾醇^[3]，《中国药典》2010年版将千金子甾醇作为其定量测定指标^[1]，但其在肠道内的吸收和转运机制尚不明确，极大地限制了千金子在临床上的应用。

Caco-2细胞来源于人结肠癌上皮细胞，当其生长达到融合后细胞可自发分化形成极性，形成了具有紧密连接细胞单层，形态学上类似小肠吸收细胞。近几十年来，Caco-2细胞模型广泛用于研究药物在肠道中的吸收，是研究外源性化合物肠道吸收和毒性很好的体外模型^[4]。本实验首次采用Caco-2细胞模型研究千金子甾醇的吸收机制，并研究时间、浓度、抑制剂对千金子甾醇转运的影响。

Caco-2细胞购于中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。

MEM/EBSS培养液、0.25%胰蛋白酶（含EDTA）、0.01 mol/L磷酸盐缓冲盐（PBS）、胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸（NEAA），均来源于Cellgro（美国Mediatech公司），青霉素-链霉素（Amresco，美国），二甲基亚砜（DMSO，Sigma，美国）；碱性磷酸酶检测试剂盒（碧云天生物技术研究所）；盐酸维拉帕米（中国食品药品检定研究院，批号100223-200102）；千金子甾醇对照品（中国食品药品检定研究院，批号111789-200901）；汉黄芩素（质量分数＞98%，上海源叶生物科技有限公司，批号YS0925SA13），噻唑蓝（MTT，Sigma公司，美国）；甲醇、乙腈为质谱纯；醋酸乙酯为分析纯，千金子甾醇样品（自提，质量分数＞95%）。

3111 CO₂培养箱（Thermo公司，美国）；HFease 1800生物安全柜（上海力康医疗设备有限公司）；IX71倒置荧光显微镜（Olympus公司，日本），Eppendorf5810R高速冷冻离心机（Eppendorf公司，德国）；Millicell-ERS跨膜电阻仪（Millipore公司，美国）；M5多功能酶标仪（SpectraMax公司，美国），Transwell板3460（Corning公司，美国）；DW—86L728医用低温保存箱（青岛海尔特种电器有限公司）；UPLC-MS/MS（Waters公司，美国），Milli-Q纯水机（Millipore公司，美国）。

Caco-2细胞接种于25 cm²的细胞培养瓶中，加入5 mL MEM/EBSS培养基，含10%胎牛血清、1%非必需氨基酸、1%青霉素-链霉素（100 U/mL）双抗液。于37 ℃的5% CO₂恒温培养箱中培养。隔3天换1次液，每4～7天用胰蛋白酶消化传代。

采用MTT法检测不同浓度千金子甾醇对Caco-2细胞的毒性。取对数生长期的Caco-2细胞以1×10⁵/mL的密度接种于96孔培养板，每孔体积为200 μL，按“2.1”项培养条件培养3 d。细胞分为实验组、阴性对照组和空白组，实验组加入不同浓度的千金子甾醇，使其终浓度为10、20、50、80、100、150、200 μmol/L（DMSO终体积分数＜1%），空白组不加细胞仅加培养基，阴性对照组加入细胞、培养基和DMSO（终体积分数1%）。按“2.1”项下培养条件培养4 h后，每孔加入MTT（5 g/L）溶液20 μL，PBS溶液180 μL，37 ℃继续培养4 h，终止培养，小心吸弃上清液，每孔加入100 μL DMSO，振荡10 min，使结晶物溶解。用酶标仪在570 nm和630 nm处测定各组吸光度（A）值，实验重复3次。选取细胞存活率≥90%的药物浓度作为非细胞毒剂量，确定剂量范围，用于下一步实验^[5]。

将消化后的Caco-2细胞混悬液接种于Transwell培养板的多聚碳酸酯膜中，细胞种植密度为4×10⁴/mL，单层细胞于21～23 d分化形成，用跨膜电阻仪检测跨膜电阻，各孔跨膜电阻值均大于700 Ω·cm^{2[6],符合实验要求。}

精密称取样品千金子甾醇5.5 mg，用DMSO溶解至1 mL，配制成10 mmol/L的千金子甾醇储备液。用空白培养液稀释，配制成浓度为10、20、30、40、50 μmol/L（DMSO终体积分数＜1%）的千金子甾醇溶液。

实验前测定每孔跨膜电阻值，弃去电阻值不符合要求的孔。对于药物从细胞绒毛面（AP）侧到基底（BL）侧的转运：移取含药培养液0.5 mL加入AP侧作为供给池，同时BL侧加入1.5 mL空白培养液作为接收池；对于药物从BL侧到AP侧的转运：将含药培养液1.5 mL加入BL侧作为供给池，空白培养液0.5 mL加入AP侧作为接收池。分别用10、20、30、40、50 μmol/L的千金子甾醇作为供试药物，将加好药物溶液和空白接收液的Transwell板置于37 ℃的5% CO₂恒温培养箱中培养，分别在0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h从接收池中吸取200 μL接收液，同时补足相同体积的空白培养液，转运完后，测量各孔电阻，各孔跨膜电阻值均无明显差异，实验平行3次。

取接收液200 μL，加入5 μg/L汉黄芩素内标溶液50 μL，涡旋混匀3 min，加入500 μL醋酸乙酯涡旋3 min，12 000 r/min离心10 min，吸取上层醋酸乙酯400 μL，再加入500 μL醋酸乙酯涡旋3 min，12 000 r/min离心10 min，吸取上层醋酸乙酯500 μL，合并2次萃取液，氮气吹干，加200 μL流动相复溶，12 000 r/min离心15 min，用UPLC-MS/MS进行分析，计算表观渗透系数（P_app）。

实验前测定每孔跨膜电阻值，弃去电阻值不符合要求的孔。将含20 μmol/L盐酸维拉帕米的培养液0.5 mL加入AP侧孵育30 min，弃去盐酸维拉帕米溶液。AP侧加入药物浓度为30 μmol/L的培养液0.5 mL作为供给池，BL侧加入1.5 mL空白培养液作为接收池。其余操作同“2.4.2”项。

ACQUITY UPLC^TM BEH C₁₈柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为甲醇（A）-0.1%甲酸（B），梯度洗脱程序：0～0.5 min，30% A；0.5～0.8 min，30%～80% A；0.8～2.5 min，80% A；2.5～3.0 min，80%～30% A；体积流量0.4 mL/min，检测波长为275 nm，检测柱温度30 ℃，进样室温度4 ℃，色谱图见图 1。

图 1 对照品＋内标 (A) 和样品＋内标 (B) 的总离子流图Fig. 1 Total ion chromatogram of reference substance + internal standard (A) and sample + internal standard (B)

离子源为电喷雾电离源（ESI）；离子化方式为正离子模式；扫描方式为多离子反应检测（MRM）；千金子甾醇用于定量分析离子对为m/z 553→297，内标汉黄芩素定量分析离子对为m/z 285→270。

精密称取千金子甾醇对照品5.5 mg，用DMSO溶解至1 mL，配制成10 mmol/L的千金子甾醇对照品储备液。

精密称取汉黄芩素5.0 mg，用DMSO溶解至1 mL，配制成5 mg/mL储备液。精密吸取10 μL储备液，于10 mL量瓶中用甲醇定容至刻度，得5 mg/L内标溶液。吸取5 mg/L内标溶液10 μL，于10 mL量瓶中用甲醇定容至刻度，得5 μg/L内标溶液，备用。

取千金子甾醇对照品储备液适量，用细胞培养液稀释至10、100、200、400、600、800、1 000 nmol/L（DMSO终体积分数＜1%），取上述溶液200 μL与50 μL内标溶液混匀，按“2.4.1”项下处理。以浓度为横坐标，对照品与内标峰面积比为纵坐标，计算得线性方程Y＝49.609 X－10.469，r＝0.995 5；结果表明千金子甾醇在10～1 000 nmol/L线性关系良好。

分别配制10、400、1 000 nmol/L低、中、高浓度对照品溶液，重复进样6次，结果浓度的RSD值分别为2.8%、3.4%、2.1%。分别配制低、中、高浓度样品溶液各6份，进样测定，结果浓度的RSD值分别为5.2%、3.5%、8.7%。

分别制备低、中、高浓度样品溶液各3份，在0、2、4、8、24 h进样测定，结果RSD值均在15%以内，表明千金子甾醇溶液在24 h内稳定^[7]。

取空白培养液，用醋酸乙酯萃取，得醋酸乙酯萃取液，分别配制加有5 μg/L汉黄芩素内标的低、中、高浓度千金子甾醇样品（n＝6），于30 ℃氮吹仪下吹干，加入流动相200 μL涡旋溶解，12 000 r/min离心10 min，取上清液进样测定，根据标准曲线获得浓度C₁。用培养液分别配制低、中、高浓度千金子甾醇样品（n＝6），按“2.4.2”项下方法处理，进样测定，根据标准曲线获得浓度C₂。另取流动相配制低、中、高浓度的千金子甾醇溶液，按“2.4.2”项下方法处理，进样测定，根据标准曲线获得浓度C₃。计算基质效应（C₁/C₃）和回收率（C₂/C₁）。低、中、高浓度千金子甾醇样品基质效应分别为109.0%、105.9%、102.1%，回收率分别为88.1%、89.2%、90.7%。

Caco-2细胞模型P_app值越大，通透率越高，按以下公式计算P_app和表观渗透率（PDR）^[8]。

采取SPSS软件进行数据处理，用t检验对两组数据进行处理比较，结果均以x±s表示。

千金子甾醇浓度为10～50 μmol/L时，培养4 h后细胞存活率均大于90%，表明千金子甾醇的安全浓度是0～50 μmol/L。

不同浓度千金子甾醇在Caco-2细胞模型上累积透过量随时间变化曲线见图 2和3。由AP侧→BL侧转运的变化曲线可以看出，千金子甾醇的初始浓度越高转运时间越长，其转运量也越高，即千金子甾醇的转运量与初始浓度和时间呈正相关，具有浓度和时间依赖性，表明千金子甾醇的跨膜转运机制至少有被动转运的存在。图 3为低、中、高浓度千金子甾醇由BL侧→AP侧转运的变化曲线，可以看出千金子甾醇10、30 μmol/L时，随时间的增加，累积透过量增加，而浓度为50 μmol/L时，在1.5 h后有趋于饱和的趋势，表明在由BL侧→AP侧转运的外排过程中可能有主动转运的参与。分别计算10、30、50 μmol/L浓度下的P_app值和PDR值，见表 1。结果表明10 μmol/L浓度时PDR值为1.35，小于1.5，而在30和50 μmol/L浓度时PDR值均小于1，表明此时以被动转运为主。综合上述结果千金子甾醇在Caco-2细胞模型中的转运以被动转运为主，并且可能有载体介导的药物外排。

图 2 时间和浓度对千金子甾醇从AP侧到BL侧转运的影响Fig. 2 Effectsof time and concentration on transport of euphobiasteroid from AP side to BL side

图 3 不同浓度千金子甾醇从BL侧到AP侧透过量随时间变化趋势Fig. 3 Trends of euphobiasteroid with different concentration from BL side to AP side over time

表 1(Table 1)

表 1 千金子甾醇Papp和PDR测定结果 Table 1 Determination of Papp and PDR values of euphobiasteroid. 千金子甾醇 / (μmol·L−1) Papp / (×10−7 cm·s−1) PDR AP→BL BL→AP 10 30.03±6.27 40.42±0.55 1.35 30 29.85±3.93 24.66±0.78 0.83 50 23.99±1.86 15.61±0.36 0.65

表 1 千金子甾醇Papp和PDR测定结果 Table 1 Determination of Papp and PDR values of euphobiasteroid.

图 4为加入P-gp抑制剂盐酸维拉帕米后30 μmol/L千金子甾醇的累积透过量随时间变化的曲线，加入盐酸维拉帕米后，千金子甾醇跨膜转运速率和转运量明显上升，表明在P-gp抑制剂盐酸维拉帕米的作用下，P-gp的外排功能受到了抑制，外排作用减弱，千金子甾醇由AP侧→BL侧转运增加，表明千金子甾醇可能为P-gp的底物。表 2为2种情况下在150 min内整个转运过程的P_app值和PDR值，统计分析表明2种情况下PDR值无明显差异。

图 4 盐酸维拉帕米对千金子甾醇累积透过量的影响Fig. 4 Effectsof verapamil hydrochloride on cumulative permeation volume of euphobiasteroid

表 2(Table 2)

表 2 盐酸维拉帕米对千金子甾醇Papp和PDR的影响 Table 2 Effectsof verapamil hydrochloride on Papp and PDR values of euphobiasteroid. 组 别 Papp / (×10−7 cm·s−1) PDR AB→BL BL→AB 千金子甾醇 29.85±3.93 24.66±0.78 0.83 盐酸维拉帕米＋ 千金子甾醇 41.13±1.27 31.19±0.03 0.76

表 2 盐酸维拉帕米对千金子甾醇Papp和PDR的影响 Table 2 Effectsof verapamil hydrochloride on Papp and PDR values of euphobiasteroid.

吸收是药物发挥药效和产生毒性的关键环节，Caco-2细胞模型是目前国内外公认的研究药物肠吸收较理想的体外模型，该模型上存在多种药物代谢酶和部分主动转运蛋白，其中P-gp被普遍认为是药物转运的生化屏障，在药物的体内处置过程中发挥着重要的作用，可以更可靠真实地反映药物的吸收情况^{[9, 10, 11]}。因此本实验通过Caco-2细胞模型研究千金子甾醇的吸收机制，对全面阐释千金子肠道毒性的作用机制有一定的借鉴意义。

不同浓度千金子甾醇的P_app均介于1×10⁻⁵～1×10⁻⁶，表明其在肠道中的吸收为中等吸收^[12]。随着浓度的增加由AP侧→BL侧的转运量也增加，具有浓度依赖性。而对于由BL侧→AP侧的转运，低浓度时PDR＞1，较高浓度时PDR＜1，可以推测在千金子甾醇的转运过程中有主动转运的参与，此时主动转运和被动转运同时影响着千金子甾醇的吸收，随着浓度的增大，主动转运逐渐趋于饱和，此时千金子甾醇的吸收主要以被动转运主导。在加入外排转运蛋白P-gp抑制剂盐酸维拉帕米后，由AP侧→BL侧转运的P_app明显增加，进一步证实了千金子甾醇转运过程中主动转运的存在，而且这种主动转运的载体可能为P-gp。因而千金子甾醇在肠道中的吸收转运以被动转运为主，一定程度上又受到主动转运体的外排作用，但其主动转运机制还有待进一步研究。