中草药  2014, Vol. 45 Issue (20): 2987-2992
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引用本文doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2014.20.022
武嫚, 肖超妮, 张欢, 张亚军, 于洁, 郑晓晖. 不同生长时期丹皮的品质评价[J]. 中草药, 2014, 45(20): 2987-2992.
WU Man, XIAO Chao-ni, ZHANG Huan, ZHANG Ya-jun, YU Jie, ZHENG Xiao-hui. Quality evaluation of Moutan Cortex at different growth stages[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2014, 45(20): 2987-2992.
不同生长时期丹皮的品质评价
武嫚, 肖超妮, 张欢, 张亚军, 于洁, 郑晓晖     
西北大学生命科学学院, 陕西 西安 710069
收稿日期: 2014-5-30;
基金项目： 国家自然科学基金资助项目（21005062）；高等学校博士学科点专项科研基金（20106101120024）；陕西省教育厅专项科研计划项目（12JK1011）；陕西省重点科技创新团队项目（2013KCT-24）
作者简介：武 嫚（1990—），女，在读硕士，研究方向为代谢组学。E-mail: wu_man@163.com
通讯作者：郑晓晖，男，博士，教授，博士生导师，研究方向为药物代谢及分析。Tel: (029)88302686 E-mail: zhengxh@nwu.edu.cn
摘要：目的 运用植物代谢组学方法对一年、二年和三年生长时期的丹皮提取液进行分析，评价丹皮的品质。方法 高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱（HPLC/Q-TOF-MS）技术与代谢组学方法相结合用于寻找丹皮中与生长时期相关的代谢物。结果 根据准分子离子和二级质谱信息共归属了丹皮中的46种代谢物，主成分分析结果表明不同生长期的丹皮存在明显差异，发现了与生长时期相关的13种重要代谢物。一年生长期丹皮中苹果酸和没食子酸的量较高，表明丹皮在生长初期需要大量的能量物质以及合成复杂次生代谢物的原料；在二年和三年生长期丹皮中，丹皮酚以及一类结构相似的单萜苷类活性成分的含量不断增加，由此推断三年生长期内，丹皮的生长期越长其品质越好。结论 本研究为不同生长时期丹皮的品质评价提供依据，而且证实基于HPLC-MS技术的代谢组学方法是一种有效的中药品质评价方法。
关键词： 丹皮     高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱     代谢组学     品质评价     苹果酸     没食子酸    
Quality evaluation of Moutan Cortex at different growth stages
WU Man, XIAO Chao-ni, ZHANG Huan, ZHANG Ya-jun, YU Jie, ZHENG Xiao-hui    
College of Life Sciences, Northwest University, Xi'an 710069, China
Abstract: Objective To evaluate the quality of Moutan Cortex at different growth stages. Methods Metabonomics based on high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry (HPLC/Q-TOF-MS) was applied to find the variation of different growth stages. Results Forty-six metabolites were identified by MS molecular ions and major fragments in conjugation with literature data. The results of principal component analysis showed that the constituent of Moutan Cortex at three growth stages were obviously different. The levels of 13 metabolites were related to the growth time of Moutan Cortex. One-year-old Moutan Cortex contained higher levels of malic acid and gallic acid, suggesting the requirement of sufficient materials for growth and synthesis of complicated secondary metabolites at the first stage. However, in two- and three-years-old Moutan Cortex the levels of some important active compounds such as paeonol and monoterpene glucosides increased. It could be deduced that within three years grouth, good quality of Moutan Cortex was associated with the longer growth time. Conclusion These results provide the evidence for the quality evaluation of Moutan Cortex at different growth stages, and demonstrate that metabonomics is a powerful approach for the quality evaluation of traditional Chinese malera medica.
Key words: Moutan Cortex     high performance liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry     metabonomics     quality evaluation     malic acid     gallic acid    

丹皮为毛茛科植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr. 的干燥根皮，具有清热凉血、活血化瘀的功效[1]，在抗炎、止痛、降血糖和保护心脏等方面疗效显著[2, 3]，属于常用中药材。丹皮市场需求量大，但质量良莠不齐，其化学成分易受生长环境等因素的影响[4]。目前对丹皮的品质评价已从单个或多个指标性成分检测发展到指纹图谱的综合分析[5, 6]。基于HPLC技术的指纹图谱具有选择性，相似度评价软件侧重评价相似性而忽略非共有峰，用于中药材质量评价逐渐显示出一定的局限性。在现代中药研究中，代谢组学在质量控制研究方面具有重要的理论意义和应用价值[7]。

植物代谢组学是代谢组学的一个重要分支，研究不同物种、不同基因类型或不同生态类型的植物在不同生长时期或受某种刺激前后的所有小分子代谢产物，其进行定性、定量分析并找出代谢变化的规律[7, 8]。高效液相色谱-质谱联用技术（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）具有强大的分离能力以及高通量、高分辨率和高检测灵敏度[9]，且能够得到代谢物的结构信息。HPLC-MS技术与代谢组学方法相结合已经成为一种有力的中药品质评价新方法。本实验基于HPLC/Q-TOF-MS技术的植物代谢组学方法，研究道地药材丹皮不同生长时期的代谢组学差异，从而为丹皮的品质评价提供科学依据。

1 仪器与材料

G6520 LC/MS Q-TOF型高效液相-质谱联用仪（美国安捷伦公司）包括1200系列高效液相色谱仪（G1322A真空脱气机、G1312A二元高压泵、G1329A自动进样器和G1316A柱温箱）和四级杆飞行时间质谱仪（ESI电喷雾离子源），该仪器配有采集与处理数据的软件（MassHunter Workstation Software Version B.04.00）。其他仪器有KQ5200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

甲醇、乙腈均为色谱纯试剂（美国Fisher公司），乙酸铵为分析纯（天津恒兴试剂公司），Q-TOF/MS质谱使用的参比液和校准液由安捷伦公司提供。

牡丹植株（赵粉）于2012年10月经高级农艺师赵弟行采自山东菏泽信军园艺公司栽培基地（山东菏泽牡丹北路国花社区1 189号），在一年、二年和三年生长期种植区内各随机采集5株新鲜牡丹根，经西北大学中药系房敏峰副教授鉴定为毛茛科芍药属植物牡丹Paeonia suffruticosa Andr. 的鲜根。将新鲜根部除去细根，洗涤，刮去粗皮，除去木心，晒干制成刮丹皮（按《中国药典》2010年版规定），经粉碎后过40目筛制成丹皮粉末备用。

2 方法 2.1 样品制备

各取3组丹皮（一年、二年和三年生长期）中的5个样品，平行制样。精密称取1.0 g丹皮粉末置100 mL具塞锥形瓶中，加入甲醇-水（1∶3）的混合溶剂50 mL，加盖后用封口膜密封，将锥形瓶放入超声波振荡仪中冰水浴超声提取30 min（频率：40 kHz，功率：200 W），称定质量，用甲醇-水（1∶3）的混合溶剂补足减失的质量，静置，滤过。取续滤液用0.45 μm有机微孔滤膜滤过，即得。

2.2 HPLC/Q-TOF-MS条件

样品采用梯度洗脱以期分开样品中的复杂成分，改善分离效果，提高检测灵敏度。对色谱条件进行优化，最终确定色谱条件：色谱柱为Agilent Extend-C18 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为2 mmol/L乙酸铵水溶液（A）-乙腈（B）；体积流量为0.6 mL/min；柱温为30 ℃；梯度洗脱程序为0～13 min，15%～28% B；13～22 min，28% B；22～37 min，28%～58% B；37～45 min，58% B；进样量为20 μL。

对质谱的主要参数进行优化，获得了更好的灵敏度和分辨率，质谱的主要参数：电喷雾离子源，负离子模式下检测样品，N2干燥气温度为350 ℃、体积流量为10 L/min，喷雾器压力为275.8 kPa，毛细管电压为4 000 V，溶剂化离子去簇电压为170 V，锥孔电压为65 V。高纯N2作为二级质谱碰撞气，为获取更丰富的二次碎片，二级质谱碰撞能量设置为10、20、30、40 eV 4个能量级，一级质谱的离子采集范围为m/z 100～1 000，二级质谱的离子采集范围为m/z 50～1 000，使用棒状图记录总离子流图（TIC），采集速率均为1张/s。在分析过程中选用m/z 112.985 5和1 033.988 1作为数据采集过程中的参比离子，以实时监测仪器的运行情况。

2.3 精密度、稳定性和重复性试验

按“2.1”项下的方法制备三年生长期丹皮的供试品溶液，按“2.2”项下HPLC/Q-TOF-MS条件连续进样5次，选取特征峰芍药苷与丹皮酚计算峰面积的RSD分别为1.21%、2.65%；另取该样品供试品溶液，按“2.2”项下HPLC/Q-TOF-MS条件每3 小时进样1次，选取特征峰芍药苷与丹皮酚计算峰面积的RSD分别为1.45%、2.44%；按“2.1”项下的方法平行制备5份样品，分别按“2.2”项下HPLC/Q-TOF-MS进样，选取特征峰芍药苷与丹皮酚计算峰面积的RSD分别为1.77%、2.86%。

2.4 数据处理

采用MassHunter Workstation软件分析处理丹皮的代谢谱，利用分子特征提取法（MFE）寻找丰度随时间先升高后降低的离子，精确提取TIC中的准分子离子信息，以CEF文件格式导入MPP（Mass profiler professional，美国安捷伦）软件。

在MPP软件中进行数据处理，首先使用精确相对分子质量和保留时间对化合物进行数据对齐（设定保留时间最大误差为0.5 min、相对分子质量最大误差为1.5×10-5），然后保留绝对丰度＞5 000且至少有2个同位素峰的化合物，接着对数据进行归一化处理和频率筛选（任意一组超过80%样品中能检测到此化合物），筛选后得到用于代谢组学分析的数据矩阵。

首先进行非监督模式下的主成分分析（PCA），然后进行数据分析：使用ANOVA进行统计学分析，同时计算倍数（FC值）的变化。选择P＜0.05同时质量分数在两组间变化大于2倍的化合物（FC值＞2），得到一个15×598的数据矩阵。

为了保证统计学结果的准确性，将此数据矩阵再次导入质谱MassHunter Workstation软件中，保留峰形对称的化合物，并结合此化合物的FC值，确定出差异性物质。

3 结果与分析 3.1 成分分析与鉴定

图 1是不同生长时期丹皮提取液的总离子流图。根据全扫描模式下的准分子离子峰及选择离子扫描模式下的二级质谱信息，与美国安捷伦PCDL数据库和MTELIN数据库进行比对（相对分子质量偏差＜1×10-5），共归属了46个代谢物（表 1），这些代谢物包括了单萜苷类、丹皮酚类、水解鞣质类、缩合鞣质类等。从图 1可以看出，不同生长时期丹皮提取液中没有新代谢物出现，而只表现在代谢物量的不同，例如，12号峰（原花青定二聚体）在三年生长期的TIC谱中峰最高，19号峰（牡丹酚原苷）在二年生长期的总离子流图谱中峰最低。为寻找不同生长时期丹皮的代谢组差异，采用MPP软件进行统计分析。

图 1 不同生长时期丹皮提取液的总离子流图Fig. 1 Mass spectrometry-totalion current chromatogram of extract of Moutan Cortex at different growth stages

表 1 丹皮提取液的中代谢物归属 Table 1 Characterization of major metabolites from Moutan Cortex extract
3.2 代谢组学分析及品质评价

图 2为不同生长时期丹皮提取液的PCA得分图。可以看出一年、二年和三年生长时期的丹皮提取液组内聚集，组间明显分离，这说明不同生长时期丹皮的代谢物存在明显差异。为了表达生长时间对丹皮品质的影响，选定一年生长期丹皮中的化合物为对照，并结合统计学软件计算出的差异性物质，共确定了与生长时期有关的13个重要代谢物（图 3）。

图 2 不同生长时期丹皮提取液的PCA得分图Fig. 2 Score plots of Moutan Cortex extract at different growth stages

图 3 13种重要代谢物随丹皮生长时期的变化趋势Fig. 3 Changes of 13 metabolites in Moutan Cortex with increasing growth stages

由图 3可知，丹皮中的苹果酸和没食子酸在一年生长期时量最高，但随着生长时期增长有降低的趋势。由于苹果酸是三羧酸循环的中间产物，在植物代谢中发挥着重要作用，为植物体的生长发育提供能量，也是C4和景天酸植物的光合作用产物，可以保护植物免受病原体侵害[19]。而没食子酸具有抗炎、抗突变和抗氧化等多种生物学活性[20]，且在植物代谢通路中为没食子酰芍药苷和没食子酰氧化芍药苷等复杂单萜苷类物质的合成提供没食子酰基原料，更是合成水解鞣质的必需原料。这些物质在一年生长期时量较高，表明在植物在生长发育初期需要大量的能量物质，而且为生成结构更复杂的次生代谢物提供物质基础。

原花青定二聚体和山柰酚二糖苷在二年和三年生长时期的丹皮中量较高。其中，原花青定二聚体属于原花色素低聚物，具有抗氧化、清除自由基、保护心血管、抗肿瘤和抗诱变等多种生物活性[11]，现已在医药、保健和化妆品行业被开发成多种产品。山柰酚二糖苷属于黄酮类成分，牡丹中的这些黄酮类成分有很强的抗氧化活性，对DPPH•、ABTS•+、OH•基团具有自由基清除作用并可显著减少三价铁的氧化[12]。

更为重要的是，随着生长时期的增长，丹皮标志性成分丹皮酚的量不断增加（图 3），由此推断丹皮酚是丹皮生长成熟的指标性成分之一，这与文献中报道的丹皮酚随生长期增长呈累积趋势相一致[4]。另外，一类具有相同蒎烷骨架和不同芳香酸取代基的没食子酰氧化芍药苷、苯甲酰氧化芍药苷、牡丹皮苷E和牡丹皮苷J单萜苷类物质的量也随着生长时期增长而逐渐增高。这些单萜苷中的芳香酸基团在抑制细菌感染产生的血小板聚集和炎症等方面发挥重要作用[15]。值得注意的是，二年、三年生长期丹皮中没食子酸氧化芍药苷的量上升，而其前体物没食子酸量相应下降，说明在生长后期没食子酸更多地转化为带有没食子酰基的次生代谢产物。存在于丹皮水提物和醇提物中的丹皮酚及单萜苷类，是丹皮发挥降糖、抗炎、抗肿瘤和保护心血管作用的活性物质，通常作为丹皮质量控制的指标性成分。根据这些物质量的增加，可初步推断丹皮的生长期越长，其品质越好。

4 讨论

本实验基于HPLC/Q-TOF-MS联用技术的代谢组学研究方法，对一年、二年和三年不同生长时期的丹皮提取液代谢物进行分析。研究结果表明，代谢组学方法可以实现不同生长时期丹皮的质量评价，发现与生长时期有关的13种重要代谢物。在丹皮的生长初期，苹果酸和没食子酸的量较高，表明植物在生长发育初期需要大量的能量物质，并为生成更复杂的次生代谢物提供原料。而随着生长时期增长，丹皮酚以及一类结构相似的单萜苷类活性物质不断增加，由此可初步推断，三年生长期内，丹皮的生长期越长，其品质越好。

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