板蓝根Radix Isatidis为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort. 的干燥根，作为著名的传统中药，在《神农本草经》中记载已超过2千年。板蓝根味苦，性寒，具有清热解毒、凉血利咽的功能。现代药理实验证明板蓝根临床上常用于治疗流行性感冒、咽喉肿痛、口咽干燥、急性扁桃体炎等病症，具有抗病毒^[1]、抗菌^[2]、抗内毒素^[3]、抗炎、镇痛^{[4, 5, 6]}以及增强免疫等药理作用；但板蓝根发挥抗炎镇痛活性的有效部位以及物质基础仍不明确。本实验应用大孔吸附树脂分离纯化的制备方法获得板蓝根提取物水洗部位及30%、50%、70%乙醇提取4个部位，并对其抗炎、镇痛活性进行考察，以期初步筛选板蓝根抗炎镇痛的有效部位，为明确其物质基础提供依据。

清洁级ICR雌性小鼠，144只，体质量18～22 g，由浙江省实验动物中心提供，生产许可证号SCXK（浙）2008-0033，动物质量合格证号0003659。

小鼠巨噬细胞系RAW 264.7，来源于中国医学科学院基础医学研究所细胞资源中心。

板蓝根药材购自安徽亳州，经南京中医药大学李祥教授鉴定为十字花科植物菘蓝Isatis indigotica Fort. 的干燥根。散利痛（批号1204016），山东新华制药股份有限公司；塞来昔布（批号0204M4704V），Sigma公司；雷公藤甲素（批号111567-200502），中国食品药品检定研究院；DMEM培养基，Gibco公司；胎牛血清，浙江天杭生物有限公司；脂多糖（LPS），南京百康生物科技有限公司；冰醋酸（以生理盐水配制成0.5%的溶液），国药集团化学试剂有限公司。小鼠前列腺素E₂（PGE₂）ELISA检测试剂盒，Enzo Life Science公司；小鼠肿瘤坏死因子-α（TNF-α）ELISA检测试剂盒，eBioscience公司。其他试剂均为市售分析纯。

METTLER—AL—204电子天平，梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；DK—8B型电热恒温水槽，上海精宏实验设备有限公司；ThermoScientific 3111型CO₂细胞培养箱，赛默飞世尔科技公司；XDS—1B型倒置显微镜，重庆光学仪器厂；M2e酶标仪，Molecular Devices公司。

板蓝根药材分别用10、8倍量水提取2次，1 h/次，合并提取液，滤过，减压回收浓缩至适当浓度，加乙醇调节乙醇体积分数为60%，静置过夜，滤过，取滤液减压浓缩至适当浓度，经D101大孔树脂吸附后，依次用水及30%、50%、70%乙醇洗脱，收集水洗及30%、50%、70%乙醇提取部位，各部位的得膏率分别为12%、0.28%、0.53%、0.37% [含(R,S)-告依春的量分别为0.14%、7.7%、0.013%、0.010%]。依次取上述4个部位的干浸膏适量，用无血清DMEM培养基配制成2 500、1 000、500、100 μg/mL浸膏溶液进行体外细胞模型筛选，以蒸馏水配制成生药剂量112 g/kg浸膏溶液进行体内模型筛选。

调整RAW264.7细胞密度至5×10⁴/mL，接种于96孔细胞培养板中，每孔100 μL，置于37 ℃、5%CO₂细胞培养箱中培养24 h。培养结束后吸出细胞板中的培养基，处理组中加入终质量浓度分别为2 500、1 000、500 μg/mL的200 μL含药培养基，空白对照组加入等体积的无血清培养基，继续孵育24 h，每组3个复孔。24 h后每孔加入20 μL的MTT溶液（终质量浓度为0.5 mg/mL），继续孵育4 h后，取出96孔板，吸出孔内液体，加入150 μL的DMSO，振荡5 min后于490 nm处测定吸光度（A）值，计算细胞存活率。

存活率＝药物组平均A值/空白对照组平均A值

实验分为7组，分别为对照组（无血清培养基），模型组（终质量浓度为1μg/mL的LPS），雷公藤甲素阳性对照组（25 nmol/L的雷公藤甲素及1 μg/mL的LPS），板蓝根水洗部位及30%、50%、70%乙醇提取部位给药组（500 μg/mL的板蓝根提取物及1 μg/mL的LPS）。调整RAW264.7细胞密度至1×10⁵/mL，接种于24孔细胞培养板中，每孔500 μL，置于37 ℃、5%CO₂细胞培养箱中培养24 h。24h后弃去上清，将500 μL质量浓度为500 μg/mL的板蓝根提取物分别加入培养板，预处理1 h，每组3个复孔。1 h后，再加入LPS（终质量浓度为1 μg/mL）。LPS刺激18 h后收集细胞上清，按ELISA试剂盒说明书操作要求进行TNF-α检测，计算抑制率。

抑制率＝(模型组TNF-α水平－给药组TNF-α水平) / (模型组TNF-α水平－对照组TNF-α水平)

实验分为7组，分别为对照组（无血清培养基），模型组（1 μg/mL的LPS），塞来昔布阳性对照组（3 μmol/L的塞来昔布及1 μg/mL的LPS），板蓝根水洗及30%、50%、70%乙醇提取部位给药组（100 μg/mL的板蓝根提取物及1 μg/mL的LPS）。细胞培养与给药方法同“2.2.2”项，于LPS刺激18h后收集细胞上清，按ELISA试剂盒说明书要求进行PGE₂检测，抑制率计算方法同“2.2.2”项。

取ICR小鼠72只，体质量18～22 g，随机分为6组：模型组（蒸馏水），阳性对照组（散利痛0.17 g/kg），板蓝根水洗部位（生药112 g/kg）、30%乙醇提取部位（生药112 g/kg）、50%乙醇提取部位（生药112 g/kg）、70%乙醇提取部位（生药112 g/kg），每组12只。适应性饲养3 d，各组按20mL/kg给药体积分别ig给予各受试药物，每日1次，给药3 d。于末次给药前禁食12 h，末次给药后1 h，各组小鼠ip 0.5%冰醋酸0.2 mL/只，观察注射冰醋酸后15 min内各组小鼠出现扭体反应的时间（扭体潜伏期）和扭体反应次数。

小鼠分组与给药方法同“2.3.1”项，于末次给药前禁食12 h，末次给药后1 h，将各组小鼠尾下部垂直浸入（55±0.5）℃热水中恒温水浴（浸入长度为3 cm），用秒表计时，以尾回缩出水面的潜伏期为测痛指标。测甩尾时间以30 s为限，超过30 s以30s计。

实验所得数据用SPSS 16.0统计软件分析，结果均用表示，组内比较采用ANOVA（one-wayanalysis of variance）单因素方差分析，组间比较采用LSD法。

500 μg/mL的板蓝根水洗部位及30%、50%、70%乙醇提取部位作用于RAW264.7细胞，存活率分别为114.32%、104.95%、95.00%、100.02%，因此在500 μg/mL的质量浓度下，各受试药物对RAW264.7细胞基本无细胞毒作用，见图 1。

图1 板蓝根不同提取部位对RAW264.7细胞增殖的影响(,n=3)Fig. 1 Effects of different fractions from Isatidis Radixon proliferation of RAW264.7 cells(,n=3)

与对照组相比，模型组TNF-α水平显著升高（P＜0.05）；阳性药雷公藤甲素可显著降低TNF-α水平（P＜0.05）；板蓝根水洗及30%、50%、70%乙醇提取部位均可显著降低TNF-α水平（P＜0.05），见表 1。结果提示板蓝根水洗部位及30%、50%、70%乙醇提取部位对LPS刺激RAW264.7细胞释放TNF-α均具有抑制作用，其中70%乙醇提取部位作用最佳。

表 1(Table 1)

表 1 板蓝根不同提取部位对LPS刺激RAW264.7细胞释放TNF-α的影响(,n=3) Table 1 Effects of different fractions from Isatidis Radix on TNF-α release in LPS-stimulated RAW264.7 cells(,n=3) 组别 ρ / (μg∙mL-1) TNF-α / (pg∙mL-1) 抑制率 / % 对照 — 3.18± 0.50 — 模型 — 891.34±34.96# — 板蓝根水洗 500 248.89±45.73 72.33 板蓝根30%醇提 500 228.24±57.44 74.66 板蓝根50%醇提 500 438.18±49.04 51.02 板蓝根70%醇提 500 201.11±21.64 77.71 雷公藤甲素 25 nmol∙L-1 239.90±27.60 73.35 与对照组比较：#P＜0.05；与模型组比较：*P＜0.05 #P < 0.05 vs control group; *P <0.05 vs model group

表 1 板蓝根不同提取部位对LPS刺激RAW264.7细胞释放TNF-α的影响(,n=3) Table 1 Effects of different fractions from Isatidis Radix on TNF-α release in LPS-stimulated RAW264.7 cells(,n=3)

与对照组相比，模型组PGE₂水平显著增加（P＜0.01）；阳性药塞来昔布组的PGE₂释放量减少，与模型组比较差异显著（P＜0.01）；板蓝根水洗部位和30%乙醇提取部位组PGE₂的水平增加，对LPS刺激RAW264.7细胞释放PGE₂无抑制作用；板蓝根50%及70%乙醇提取部位组的PGE₂的释放量均减少，与模型组比较差异均显著（P＜0.01），见表 2。结果提示板蓝根提取物50%及70%乙醇提取部位对LPS刺激RAW264.7细胞释放PGE₂具有明显的抑制作用。

表 2(Table 2)

表 2 板蓝根不同提取部位对LPS刺激RAW264.7细胞释放PGE2的影响(,n=3) Table 2 Effects of different fractions from Isatidis Radix on PGE2 release in LPS-stimulated RAW264.7(,n=3) cells 组别 ρ / (μg∙mL-1) PGE2 / (pg∙mL-1) 抑制率 / % 对照 — 6.64± 0.03 — 模型 — 2 599.88±13.17## — 板蓝根水洗 100 3 361.26±45.89 -29.36 板蓝根30%醇提 100 2 758.83±29.93 -6.13 板蓝根50%醇提 100 1 253.08±5.60** 51.94 板蓝根70%醇提 100 1 587.34±9.19** 39.05 塞来昔布 3 μmol∙L-1 7.49±0.03** 99.98 与对照组比较：##P＜0.01；与模型组比较：*P＜0.05**P＜0.01，下同 ##P < 0.01 vs control group; P < 0.05 **P< 0.01 vs model group,same as below

表 2 板蓝根不同提取部位对LPS刺激RAW264.7细胞释放PGE2的影响(,n=3) Table 2 Effects of different fractions from Isatidis Radix on PGE2 release in LPS-stimulated RAW264.7 cells (,n=3)

冰醋酸注射后，小鼠呈现较明显的扭体反应，阳性对照散利痛组与模型组比较，扭体潜伏期延长、扭体次数降低，差异显著（P＜0.01）；板蓝根水洗组及50%乙醇提取部位、70%乙醇提取部位组对扭体潜伏期也体现出良好的延长作用，扭体次数明显下降，与模型组比较差异显著（P＜0.05、0.01）；板蓝根30%乙醇提取部位组扭体次数明显下降，与模型组比较差异显著（P＜0.01）。见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 板蓝根不同提取部位对醋酸致小鼠扭体反应和热水缩尾反应的影响(,n=12) Table 3 Effects of different fractions from Isatidis Radix on writhing response induced by acetic acid and tail-immersion response induced by hot water in mice(,n=12) 组别 剂量 / (g∙kg-1) 扭体潜伏期 / s 扭体次数 缩尾潜伏期 / s 模型 — 207.75± 69.39 31.00±18.81 2.432±0.759 散利痛 0.17 367.83±178.31** 9.00± 5.01** 4.179±1.392** 板蓝根水洗 112 378.00±178.86** 10.67± 7.09** 3.337±0.739** 板蓝根30%醇提 112 323.08±133.82 11.33± 8.30** 2.853±0.958 板蓝根50%醇提 112 336.25±190.88 13.92± 7.83** 3.208±0.755 板蓝根70%醇提 112 289.92± 73.99 13.67± 5.68** 3.581±1.157**

表 3 板蓝根不同提取部位对醋酸致小鼠扭体反应和热水缩尾反应的影响(,n=12) Table 3 Effects of different fractions from Isatidis Radix on writhing response induced by acetic acid and tail-immersion response induced by hot water in mice(,n=12)

阳性对照散利痛组的缩尾潜伏期延长，与模型组比较差异显著（P＜0.01）；板蓝根水洗及70%乙醇提取部位组小鼠缩尾潜伏期延长，与模型组比较差异非常显著（P＜0.01）；板蓝根50%乙醇提取部位组小鼠缩尾潜伏期延长，与模型组比较差异显著（P＜0.05）。见表 3。

伤害性疼痛信号最早始于外周感觉神经元末梢的伤害性感受器，伤害性感受器对酸性物质、热、剧烈的机械压力等外界的直接压力启动应答反应。外周伤害性感受器通过表达包括电压门控通道，酸敏感离子通道以及温度感受器的瞬时受体电位通道等一系列的分子来检测外界的有害刺激。当组织的完整性被破坏后，受损组织对于外伤、高热、感染、毒素等的敏感性增加，因此产生炎性疼痛。一旦发生组织损伤，受损细胞以及多种免疫细胞将释放各种化学介质（如TNF-α、PGE₂、NO等），影响痛阈及痛感受^{[7, 8]}。

LPS作为革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分，具有广泛的生物学活性。LPS与之相应的受体结合后，通过激活核因子-κB（NF-κB）等信号通路，启动一系列细胞因子及生物活性分子如TNF-α、PGE₂、IL-1β、IL-6、NO等的级联反应，引发炎症^[9]。PGE₂是环氧化酶-2（COX-2）作用于花生四烯酸后的主要代谢产物，PGE₂不仅是炎症介质，还是一类重要的疼痛介质，在机体发生炎症、发热以及疼痛等病理生理过程中起着重要的作用^{[10, 11]}。实验结果显示，板蓝根水洗部位及30%、50%、70%乙醇提取部位对LPS刺激RAW264.7细胞释放TNF-α均具有抑制作用。板蓝根50%及70%乙醇提取部位对LPS刺激RAW264.7细胞释放PGE₂具有抑制作用。根据上述结果，板蓝根水洗部位及30%乙醇提取部位主要对TNF-α具有一定的抑制作用，而板蓝根50%及70%乙醇提取部位对TNF-α及PGE₂因子均具有较强的作用。上述结果表明，板蓝根抗炎的有效部位可能集中在50%及70%乙醇提取部位。板蓝根50%乙醇提取部位主要含苯丙素类成分，70%乙醇提取部位主要含生物碱类成分^[12]，因此苯丙素及生物碱类成分可能是板蓝根发挥抗炎作用的主要活性成分。

醋酸是一种刺激性化学物质，注入体内可刺激脏层和壁层腹膜，引起深部较大面积、较长时间的炎性疼痛。醋酸介导的伤害性反应可能由于腹腔pH值降低而直接刺激传入神经和炎症介质合成共同作用导致^[13]。热水缩尾实验是一种常用的热刺激致痛模型。本研究采用了醋酸致小鼠扭体及热水致小鼠缩尾反应考察了板蓝根不同提取部位的镇痛作用。实验结果显示，在小鼠扭体实验中，板蓝根水洗部位及30%、50%、70%乙醇提取部位均表现出不同程度的镇痛作用，其中水洗部位的镇痛效果最强，能够极其显著地改善醋酸致小鼠扭体次数及扭体潜伏期；在小鼠热水缩尾实验中，板蓝根提取物水洗部位及50%、70%乙醇提取部位均表现出一定的镇痛作用，其中水洗部位以及70%乙醇提取部位的镇痛效果较强，能够极其显著的延长缩尾潜伏期。上述结果表明，板蓝根镇痛的有效部位可能集中在水洗部位以及70%乙醇提取部位，板蓝根水洗部位主要含板蓝根多糖类成分，70%乙醇提取部位主要含生物碱类成分^[12]，因此板蓝根多糖以及生物碱类成分可能是板蓝根发挥镇痛作用的主要活性成分。

综合板蓝根不同提取部位体内外的抗炎、镇痛活性研究结果，板蓝根抗炎的有效部位集中在50%及70%乙醇提取部位；板蓝根镇痛的有效部位集中在水洗部位以及70%乙醇提取部位；并且板蓝根70%乙醇提取部位在抗炎、镇痛活性上均显示了较强的作用，其机制可能与抑制炎性因子PGE₂及TNF-α释放有关。本研究提示，板蓝根70%乙醇提取部位可能是抗炎镇痛作用的主要有效部位，其活性成分及作用机制正在进行深入研究。