凹叶厚朴Magnolia officinalis subsp. Biloba Rehd. et Wils. Law.为厚朴Magnolia officinalis Rehd. et Wils. 的亚种，是中国特有的木兰科木兰属植物。在中药生产中，厚朴及凹叶厚朴均统称为厚朴，是中国传统的大宗中药材，其根皮以及茎皮都可入药，具有燥湿消痰等功效，用于食积气滞，腹胀便秘，痰饮喘咳^[1]。厚朴酚（magnolol）与和厚朴酚（honokiol）是其主要活性成分，具有多种药理作用，包括抗炎、抗心律失常、抗癫痫、抗血小板、抑制肌肉收缩和抗菌等。在20世纪80年代，凹叶厚朴已被列为国家二级珍稀保护植物。正是由于资源的不断减少，大批生长年限不足的厚朴被提前砍伐，造成药材整体质量下降，《中国药典》2010年版对其含总酚的量规定也由3%降到了2%^[2]。目前，关于凹叶厚朴的组织培养，刘贤旺等^[3]对凹叶厚朴愈伤组织的超低温保存进行了相关研究，但凹叶厚朴愈伤组织难以分化成苗，不利于扩大繁殖；宋荣等^[4]、王志毅等^[5]对凹叶厚朴茎段进行了腋芽诱导培养及离体胚培养研究，由于凹叶厚朴内富含多酚类化合物，极易褐化，没有建立完整的再生体系。

植物快繁是珍稀药用植物实现规模化生产，解决资源不足的有效途径^[6,7,8,9]，本研究采用湖南永州市道县洪营塘乡优质凹叶厚朴植株的种子为材料，建立离体快繁再生体系，为凹叶厚朴进一步规模化生产优质苗奠定基础。

1 材料

样品采自湖南省永州市道县洪营塘乡凹叶厚朴种植基地，经选育的优株所结的成熟饱满的种子。由湖南省林业科学院王晓明研究员鉴定为凹叶厚朴Magnolia officinalis subsp. biloba Rehd. et Wils. Law.种子。

2 方法 2.1 外植体消毒

将种子洗净后，先用质量分数为0.2%的高锰酸钾浸泡5 min，再用水冲洗24 h，晾干，备用。在无菌操作台上，用体积分数为75%乙醇浸泡15 s，无菌水冲洗3～4次，再用质量分数为0.1% HgCl₂处理8 min，无菌水冲洗5～6次，用无菌滤纸或纱布吸干后夹破种皮后剥去种皮，接种。

2.2 初代启动培养

将种胚接种到有无菌水的经过灭菌消毒的纸桥瓶中进行暗培养，每瓶接种3粒，7 d后观察统计，将没有污染的无菌材料接种到启动培养基中，启动培养基的组合：选择MS、B₅、WPM 3种基本培养基，加入细胞分裂素6-BA（0.1、0.5、1.0 mg/L），生长素NAA（0.05、0.1、0.2 mg/L），进行L₉(3³) 正交设计，每种处理接种30瓶。培养条件：光照强度为1 500～2 000 lx，12 h/d（以下培养条件相同），温度为25 ℃，30 d后观察生长状况，并统计发芽率^[10]。

2.3 继代增殖培养 2.3.1 植物生长调节剂的单因素试验

在B₅培养基中，分别添加植物生长调节剂的种类和质量浓度如下：6-BA（1.0、3.0、5.0、6.0 mg/L）、KT（1.0、3.0、5.0、6.0 mg/L）、IBA（0.05、0.1、0.5、1.0 mg/L）、NAA（0.05、0.1、0.5、1.0 mg/L），共16个处理，每种处理接种20瓶，每瓶接3株，重复3次，30 d后统计出芽率，记录生长状况。

2.3.2 最适增殖培养基的选择

通过单因素植物生长调节物质的选择，得知6-BA和NAA对出芽率的影响较大。以基本培养基（3/4 MS、B₅、MS），6-BA（2.0、2.5、3.0 mg/L），NAA（0.1、0.3、0.5 mg/L），蔗糖质量浓度（20、25、30 g/L）为因素，设计L₉(3⁴)正交设计，共9个处理，每个处理接种20瓶，每瓶接3株，重复3次，30 d后统计丛芽诱导率和增殖系数，记录生长状况。

诱导率＝增殖后丛生芽总数/产生丛生芽外植体总数

增殖系数＝增殖的丛生芽数/接种丛生芽的外植体总数

2.4 试管苗的生根培养 2.4.1 基本培养基筛选

凹叶厚朴增殖苗经过壮苗培养后，选择 1/4 MS、1/3 MS、1/2 MS、MS 4种基本培养基，添加0.1 mg/L NAA，每个处理接种30瓶，30 d后记录根的生长状况，计算生根率和生根系数^[8]。

生根率＝生根株数/接种的总株数

生根系数＝生根条数/有生根现象数

2.4.2 单因素试验选择生长调节剂

选择NAA、IBA、IAA及KIBA为生根试验生长调节剂，质量浓度设计为0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mg/L，基本培养基选择1/2 MS，蔗糖为20 g/L。每种处理接种20瓶，30 d后统计生根率、平均根数、观察根的生长状况，选择生根效果较好的生长素种类。

2.4.3 生长调节剂组合对生根的影响

以1/2 MS为基本培养基，经单因素试验结果最好的生长调节剂NAA（0.05、0.1、0.2、0.4 mg/L）与IBA（0.5、1 mg/L）组成8个处理，每个处理接种20瓶，重复3次，30 d后统计各处理的生根率、平均根条数，考察两种生长素组合对生根的影响。

3 结果与分析 3.1 初代培养基的选择

将无菌种胚接种到初代启动培养基中，30 d后观察结果，从表 1中可以看出，以B5为基本培养基，添加6-BA 0.5 mg/L及NAA 0.1 mg/L的配方，种胚萌芽率最高，可达87%。

采用SPSS 19.0对初代培养各处理下发芽率进行统计学分析，极差分析表明，NAA、6-BA和基本培养基在一定程度上对发芽率均有影响，影响大小依次为：NAA＞6-BA＞基本培养基；方差分析表明（表 2），NAA、6-BA各个水平之间存在显著差异（P＜0.05）；基本培养基各水平之间无显著差异（P＞0.05）。在3种因素中，极差分析及方差分析都表明基本培养基对种胚萌芽的影响最小，其原因是因为种胚萌发初期，种胚的子叶内贮存了丰富的营养物质，可以在短期内供给萌芽的营养。从植株的生长状况来看，NAA质量浓度为0.1 mg/L的植株长势明显比0.05 mg/L强，B5培养基培养的组培苗长势优于MS和WPM培养基所培养的。因此，综合考虑正交结果和苗的生长状况，初代培养最佳方案：B5＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.1 mg/L。

3.2 丛芽诱导增殖培养 3.2.1 植物生长调节物质种类的选择

实验中发现，凹叶厚朴愈伤组织分化成苗率很低，且分化的苗长势弱（图 1），不利于增殖培养。将初代培养获得的凹叶厚朴无菌苗，剪成长度1.0～1.5 cm的离体带叶茎段，转入继代增殖培养基中，期望能够诱导获得丛生苗^[11]。

植物生长调节剂的种类和质量浓度对丛生芽诱导增殖影响很大，为了筛选合适的生长调节剂种类和质量浓度，首先进行单因素试验，发现不同种类的细胞分裂素和生长素对凹叶厚朴丛生芽诱导增殖效果差异明显。从图 2中可知，分裂素6-BA的丛生芽诱导率在56%～73%，KT的诱导率在63%～76%，但KT诱导的丛芽成簇状，长势较慢，苗颜色发黄，而6-BA诱导的丛生芽，颜色亮绿，生长势旺盛；生长素IBA的腋芽诱导率在19%～24%，NAA的诱导率在20%～29%，且生长良好，因此，分裂素选择6-BA，生长素选择NAA有利于试管苗的增殖培养。

3.2.2 适宜增殖培养基的筛选

经过单因素筛选出合适的植物生长调节物质种类：6-BA和NAA，为了确定合适的浓度范围，结合基本培养基种类和蔗糖浓度两因素，设计L₉(3⁴) 正交试验，结果见表 3。

正交试验结果表明，4种因素对丛生芽诱导率的影响依次为蔗糖＞基本培养基＞6-BA＞NAA。蔗糖浓度对凹叶厚朴丛生芽诱导的效果影响较大，且差异显著（P＜0.05），基本培养基对凹叶厚朴丛生芽诱导的效果影响仅次于蔗糖质量分数，但是差异不显著（P＞0.05），其次对丛生芽诱导影响较大的是6-BA，差异显著（P＜0.05），生长素NAA在丛生芽诱导阶段影响最小，差异不显著（P＞0.05）。

4种因素对丛生芽增殖系数的影响次序：基本培养基＞NAA＞6-BA＞蔗糖。基本培养基影响仍然最大，差异显著（P＜0.05），生长素NAA对丛生芽增殖影响较大，差异极显著（P＜0.05），分裂素对丛芽增殖影响差异也显著（P＜0.05），蔗糖浓度对丛生芽增殖影响小，差异不显著（P＞0.05）。因此，综合考虑，最佳增殖培养基组合为MS＋6-BA 2.5 mg/L＋NAA 0.5 mg/L。

3.3 试管苗生根培养 3.3.1 生根基本培养基选择

查阅文献，可知植物试管苗生根的基本培养基大多为MS及其改良的培养基^{[6,7,8,9,10,11]}。将0.1 mg/L的NAA添加到1/4 MS、1/2 MS、1/3 MS、MS中，其结果为1/4 MS培养基中无不定根的形成；1/3 MS培养基中有少量不定根形成，但不定根短，细弱；1/2 MS培养基中，不定根形成较多，且生长良好；MS中几乎无不定根形成。因此，生根基本培养基选择1/2 MS。

3.3.2 生长调节剂单因素选择试验

以1/2 MS为基本培养基，分别添加NAA、IBA、IAA、KIBA 4种生长调节剂进行单因素的试验，结果发现，IAA、KIBA处理的试管苗生根率低，且苗长势弱，明显不适合凹叶厚朴试管苗生根；NAA和IBA均可以诱导不定根的形成，诱导结果见表 4。

NAA和IBA是植物组织培养中广泛用于诱导不定根的生长素^[7]，且植物生长调节剂的质量浓度也起着决定性作用，单因素试验结果表明，0.5 mg/L NAA对凹叶厚朴试管苗生根有显著促进作用，生根率30 d后可达84%，且试管苗叶色浓绿，长势好；其次为1 mg/L IBA，生根率达67%，但IBA诱导的试管苗，茎基部有愈伤组织，且叶色有发黄现象。

3.3.3 生长素双因素组合对生根影响

为了研究2 种生长素组合是否对试管苗生根有叠加效应，以1/2 MS为基本培养基，对不同质量浓度的NAA和IBA进行组合试验，结果见表 5，IBA 0.5 mg/L＋NAA 1.0 mg/L组合最佳，生根系数可达8.3，生根率达到76%。但综合株高及叶片长势等考虑，仍没有单独使用NAA 0.5 mg/L的效果好。

NAA和IBA的双因素试验表明，2种生长素同时添加时并没有出现叠加效应，反而有相互消长作用。结合试管苗的生长状况综合考虑，适宜的生根培养基为1/2 MS＋NAA 0.5 mg/L，30 d生根率可达84%。

4 讨论

本实验采用优质凹叶厚朴种胚为初始外植体，外植体消毒后先用纸桥法接种，然后将无菌种胚接种于启动培养基中，这种方法不仅节约了试验成本，而且在种胚萌发的早期，接在纸桥上的水分量高，能促进种胚的萌发，从而缩短了萌芽时间。初代培养中，分裂素及生长素的质量浓度对苗的生长有较大的影响，分裂素6-BA过高时，幼苗不长根，苗粗壮短小，生长缓慢；而生长素NAA过高时，根系过于发达，影响苗的生长，不利于进一步的增殖培养。蔗糖质量浓度对丛芽诱导有较大影响，在30 g/L的质量浓度范围内，丛芽诱导随着蔗糖质量浓度的增大而增高。生根培养表明，高盐质量浓度的MS培养基对凹叶厚朴的离体生根有抑制作用，这与全妙华等^[8]的研究结论相同；1/2 MS培养基中，无机盐质量比例适中，能满足植物的生长^[12]，生根效果好。试管苗的离体生根与扦插生根的原理相同，凹叶厚朴插扦生根的解剖学研究表明，其茎的皮层内具有潜伏型根原基和诱导型根原基^[13]，因此，本实验中添加合适浓度的生长素能诱导凹叶厚朴根原基的生长。有研究表明，活性炭的添加对于试管苗生根有促进作用^[14]，但本研究中也曾添加活性炭，生根率反而降低，这可能是由于活性炭的吸附作用降低了植株周围的生长素质量浓度，影响了生长素对根原基的诱导生根作用^[15]。

凹叶厚朴植株含有大量的多酚类物质，在培养过程中极易被氧化引起褐化，一直是凹叶厚朴组织培养的最大障碍。研究中发现，尚未生根的试管苗在培养过程中需要精心管理，温度要控制在24～25 ℃，如果温度偏高，试管苗对环境变化会产生应激反应^[16,17]，植株体内会形成大量的次生代谢产物，同时高温也加速了次生代谢产物多酚类物质的氧化，从而加速褐化，一旦植株受损就很难恢复。