中医认为，姜黄Curcuma longa L. 性温，味辛、苦，归脾、肝经，具有破血行气、通经止痛之功效。当代药理学研究表明，姜黄素（curcumin）是姜黄的主要活性成分，具有显著的抗炎、抗氧化、抗肿瘤活性，且其毒性较低，临床研究表明每人每天口服12 g姜黄素仍无毒副作用^[1]。姜黄素用于治疗胰腺癌、多发性骨髓瘤等疾病已进入了临床试验阶段，研究表明其抗肿瘤作用可能与诱导凋亡有关。然而姜黄素不稳定、易降解，对其进行质量控制有一定难度，也大大降低了其生物利用度，限制其临床应用。研究发现加入一定量的去甲氧基姜黄素或十二烷基硫酸钠，可提高姜黄素的稳定性^[2]。但添加剂的使用不仅增加了生产成本，而且带来了各种不安全的隐患。因此，本课题组对姜黄素不稳定部分进行结构改造^[3]，获得姜黄素的结构类似物1～19（图 1），通过抗耐药肿瘤活性筛选，拟获得稳定性较高且能够保留优势活性的姜黄素结构类似物。

图 1

Fig. 1

图 1 姜黄素及姜黄素结构类似物的结构 Fig. 1 Chemical structures of curcumin and its analogues

链霉素、青霉素、MTT、2′,7′-二氯荧光黄双乙酸盐（DCF-DA）、姜黄素（质量分数95%）为TCI公司产品；姜黄素类似物1～19均为自制，质量分数＞98%。胎牛血清购于杭州四季青公司，PRMI 1640培养基为Gibco公司产品，Annexin V/PI凋亡检测试剂盒、线粒体膜电位检测试剂盒、caspase-3活性检测试剂盒、细胞周期检测试剂盒、蛋白定量检测试剂盒均为南京凯基生物科技有限公司产品；P-糖蛋白（P-gp）、β-actin抗体和IgG-HRP二抗为美国Santa Cruz公司产品；所用化学试剂均为市售分析纯。阳性药阿霉素、长春新碱及紫杉醇均为阳性对照药品，为Sigma公司产品。

人红细胞系白血病细胞K562及其耐药株K562/A02细胞购自天津血液病研究所。

TACS Calibur流式细胞仪（Becton Dickinson）；Agilent 1100型高效液相色谱仪（Agilent）；高内涵活细胞成像系统（Thermo Scientific）；LDZX立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；Thermo Barnstead NANO pure DlamondUV/UF超纯水系统（Thermo Scientific）；PB—21型pH计（Sartorious AG）；TGL—18B—C高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；高速低温台式离心机（Thermo Scientific）；3121型二氧化碳培养箱（Thermo Scientific）；ZHJH—C1112型超净工作台（上海智诚分析仪器制造有限公司）；倒置生物显微镜（宁波舜宇仪器有限公司）；QL—861型旋涡混合器（海门其林贝尔仪器制造有限公司）。

K562及其耐药株K562/A02细胞接种至96孔板（每孔3 000个细胞），阳性药组加入相应浓度（1、10、100 μmol/L）的阿霉素、长春新碱及紫杉醇，受试药物组分别加入不同浓度（1、10、100 μmol/L）的姜黄素及其结构类似物1～19，对照组加入等体积的生理盐水。48 h后，每孔加入0.5 mg/mL MTT反应4 h，离心、弃去培养液，加入二甲基亚砜（DMSO）100 μL溶解结晶，酶标仪570 nm波长处测定吸光度（A）值，计算细胞生长抑制率，每个浓度设3个复孔，实验重复3次。

抑制率=1－A_实验 / A_对照

对结构改造获得的化合物1～19采用紫外分光光度法检测其水解稳定性^[4]，结果表明各化合物48 h降解率均在15%以内。根据MTT细胞毒性实验结果发现，仅有类似物3、4基本保留了姜黄素对耐药细胞的抑制活性，其他化合物尽管稳定性高，但并无进一步研究开发的价值。因此，采用HPLC法进一步验证姜黄素类似物3、4的水解稳定性^[5]。精确称量姜黄素及结构类似物3、4用DMSO溶解，配制10 mmol/L备用母液。每种样品配制A、B、C 3种溶液：A，取10 μL母液，用无水乙醇定容至5 mL，配制终浓度为20 μmol/L乙醇溶液，作为对照溶液；B，取10 μL母液，用50%无水乙醇和50%磷酸缓冲溶液（pH 7.4）定容至5 mL，配制终浓度为20 μmol/L的50%乙醇溶液；C，配制方法同B，配制完成后再经37 ℃、48 h降解即得。实验需先配制C溶液，置于37 ℃细胞培养箱内放置48 h，样品取出前配制B溶液，HPLC法测定，计算降解率。色谱条件：色谱柱为Diamonsil C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为甲醇-异丙醇-水-冰醋酸（20∶27∶48∶5）；体积流量0.5 mL/min，柱温为室温；进样量20 μL；姜黄素、姜黄素衍生物3、4的检测波长分别为426、380、374 nm。

降解率＝ (B组溶液的峰面积－C组溶液的峰面积) / B组溶液的峰面积

将10 μmol/L姜黄素及筛选出的水解稳定性高且具有较好抗耐药肿瘤细胞活性、对正常细胞无毒性的姜黄素结构类似物3、4处理K562/A02细胞48 h，离心，收集细胞，弃上清液，用冰PBS洗2遍，离心后，加入500 μL结合缓冲液重悬。分组置于不同EP管中，先加入5 μL Annexin V/FITC，再加入5 μL PI，振荡混匀，避光放置于37 ℃条件下30 min，转移至流式细胞检测管后上流式细胞仪检测。使用BD FACSDiva Software软件采集样本并进行数据分析。

取对数生长期的K562/A02细胞，以1×10⁵/mL密度接种于50 mL培养瓶中，受试化合物组中加入10 μmol/L的姜黄素及姜黄素类似物3、4，对照组给予等体积的PBS。培养48 h后离心收集细胞，用PBS洗涤后个样本加入50 μL冰冷的Lysis 缓冲液，置冰上裂解，经4 ℃，10 000 r/min离心10 min，取上清BCA法测定蛋白浓度；吸取含200 μg蛋白的细胞裂解液，并用Lysis 缓冲液补足至50 μL，加入50 μL 2×Reaction 缓冲液，再加入5 μL caspase-3的底物于37 ℃避光孵育4 h，用酶标仪在405 nm波长处测定吸光度（A）值。实验重复3次。

通过JC-1染色法检测线粒体膜电位（MMP）。参照线粒体膜电位检测试剂盒操作，将K562/A02细胞按照1×10⁶/mL的密度接种于50 mL培养瓶中，10 μmol/L的姜黄素及姜黄素类似物3、4孵育48 h后胰酶消化、离心收集细胞，收集的细胞用新鲜配制终质量浓度为5 μg/mL的JC-1工作液于37 ℃孵育30 min。用PBS洗涤细胞清除多余的染料，流式细胞术检测细胞偶联的荧光强度。

取对数生长期的K562/A02细胞以1×10⁶/mL的密度接种于50 mL培养瓶中，10 μmol/L的姜黄素及姜黄素类似物3、4分别作用48 h后收集细胞，加入终浓度为100 μmol/L的荧光探针DCF-DA，避光、37 ℃孵育15 min。细胞用PBS洗涤3次，并用1 mL PBS重悬。流式细胞仪在激发波长为488 nm和发射波长为530 nm下检测荧光强度，指示细胞内ROS的量。

取对数生长期细胞，经10 μmol/L的姜黄素及姜黄素类似物3、4作用48 h后，离心收集细胞，将细胞在70%的冰乙醇中于4 ℃固定12 h，然后离心除去乙醇，PBS洗涤2次，重悬于100 μg/mL RNA酶溶液150 μL中，37 ℃孵育30 min，加入终质量浓度为100 μg/mL的PI溶液室温避光孵育15 min，用流式细胞仪分析，激发波长488 nm，发射波长615 nm。使用软件根据细胞FL2-A的荧光道数进行DNA倍体分析，分析时通过设门法去除细胞碎片和细胞团块的干扰。

以10 μmol/L的姜黄素及姜黄素类似物3、4处理K562/A02细胞48 h，收集细胞PBS洗涤2次，加100 μL含PMSF的裂解液冰上裂解30 min，其间反复吹打3～4次，4 ℃、12 000 r/min离心10 min，取上清按照BCA蛋白测定试剂盒说明书检测蛋白质的量。样品与等体积2×加载缓冲液混匀，100 ℃变性5 min，6% SDS-PAGE电泳，转移蛋白至PVDF膜，将PVDF膜浸润在含5%脱脂奶粉的TBST中1 h，加入特异性一抗4 ℃过夜，加入HRP标记的二抗室温孵育2 h，最后加入发光底物X射线曝光显示目的蛋白条带。

取对数生长期的K562/A02，以5×10³/mL密度接种于预先处理过的96孔培养板中，每孔100 μL，受试化合物组中分别加入10 μmol/L姜黄素及姜黄素类似物3、4，药物作用48 h后，离心去除药物，再加入终浓度为10 μmol/L阿霉素和Hoechst 33342（1 μg/mL）染色30 min，用PBS洗3次，应用高内涵活细胞成像系统的Target Activation BioApplication软件进行分析^[6]。

实验数据以±s表示，应用SPSS 12.0统计软件处理数据，两样本均数比较采用t检验，多组间均数比较采用方差分析。

姜黄素对K562细胞的生长抑制率高于等浓度阿霉素的作用，但弱于长春新碱与紫杉醇的作用；姜黄素结构类似物1～5、8、10～11、16～17对K562细胞的生长抑制率高于姜黄素组，见表 1。对多药耐药细胞K562/A02，姜黄素及其类似物在10、100 μmol/L时对细胞生长的抑制率强于阿霉素的作用，但稍弱于长春新碱的作用，其中姜黄素结构类似物3、4作用较强，与各浓度下姜黄素的抗耐药肿瘤活性相似，见表 2。此外，撤药1周后，显微镜观察发现姜黄素组细胞逐渐恢复生长，类似物3、4组则出现细胞生长的持续抑制效应。

表 1(Table 1)

表 1 姜黄素及其类似物对K562细胞生长的抑制作用(±s，n=3) Table 1 Inhibition of curcumin and its analogues on growth of K562 cells (±s，n=3) 组别 C / (μmol∙L−1) 生长抑制 率 / % 组别 C / (μmol∙L−1) 生长抑制 率 / % 阿霉素 10 23.47±1.22 9 10 32.27±1.33 长春新碱 10 88.32±2.33## 10 10 43.26±1.03## 紫杉醇 10 74.53±3.45## 11 10 49.45±2.10## 姜黄素 10 33.98±1.09 12 10 35.09±0.89 1 10 42.93±1.67## 13 10 33.67±1.21 2 10 38.92±0.89## 14 10 29.94±0.77 3 10 49.87±2.11## 15 10 33.33±2.46 4 10 52.12±2.12## 16 10 56.65±1.57## 5 10 49.66±1.37## 17 10 61.38±3.11## 6 10 29.89±0.77 18 10 24.98±1.89 7 10 15.02±0.52 19 10 26.05±1.52 8 10 39.31±2.12## 与姜黄素组比较：##P＜0.01 ##P < 0.01 vs curcumin group

表 1 姜黄素及其类似物对K562细胞生长的抑制作用(±s，n=3) Table 1 Inhibition of curcumin and its analogues on growth of K562 cells (±s，n=3)

表 2(Table 2)

表 2 姜黄素及其类似物对K562/A02细胞的生长抑制作用 (±s，n=3) Table 2 Inhibition of curcumin and its analogues on growth of K562/A02 cells (±s，n=3) 组别 C / (μmol∙L−1) 生长抑制率 / % 组别 C / (μmol∙L−1) 生长抑制率 / % 组别 C / (μmol∙L−1) 生长抑制率 / % 阿霉素 1 31.95±1.22## 5 1 31.74±1.44## 13 1 37.51±0.57## 10 28.91±1.11 10 31.57±1.39 10 42.55±0.44## 100 34.96±0.91 100 46.07±2.11 100 83.44±2.83 长春新碱 1 29.47±1.62## 6 1 23.20±1.56## 14 1 37.96±0.46## 10 48.24±2.44## 10 35.66±3.24 10 33.75±0.48 100 96.43±4.47 100 38.69±1.82 100 22.89±3.12 紫杉醇 1 22.95±0.47## 7 1 16.28±0.67 15 1 26.65±2.32## 10 43.32±1.09## 10 20.67±2.19 10 29.53±3.22 100 79.77±2.12 100 32.48±2.77 100 30.90±2.04 姜黄素 1 18.85±0.32 8 1 21.35±0.89 16 1 25.92±1.75## 10 33.27±2.31 10 32.40±2.17 10 27.76±2.48 100 93.48±3.77 100 44.62±0.64 100 38.87±1.93 1 1 26.26±0.89## 9 1 34.12±2.14## 17 1 25.33±1.87## 10 63.65±3.22## 10 36.53±1.88 10 33.66±3.12 100 71.48±2.32 100 45.42±2.78 100 26.49±2.64 2 1 30.16±2.11## 10 1 26.54±0.99## 18 1 40.88±2.03## 10 41.05±2.12## 10 26.65±1.53 10 39.99±3.01 100 51.58±3.39 100 41.00±1.99 100 35.58±2.35 3 1 30.70±1.76## 11 1 25.80±1.43## 19 1 34.19±1.46## 10 46.56±0.78## 10 25.61±0.66 10 41.31±1.99## 100 92.97±3.55 100 40.69±2.78 100 42.06±2.45 4 1 29.01±2.01## 12 1 33.68±2.22## 10 35.65±0.57 10 26.21±1.82 100 94.52±2.89 100 44.14±1.92 与同浓度姜黄素比较：##P＜0.01 ##P < 0.01 vs curcumin group at same concentration

表 2 姜黄素及其类似物对K562/A02细胞的生长抑制作用 (±s，n=3) Table 2 Inhibition of curcumin and its analogues on growth of K562/A02 cells (±s，n=3)

实验结果显示，姜黄素在有水溶剂中易分解，经结构改造后，姜黄素结构类似物分解率极显著下降（P＜0.001），提示结构改造成功。HPLC法测得姜黄素及其结构类似物3、4的降解率分别为（30.59±1.09）%、（5.24±0.77）%、（2.01±0.58）%。此外，姜黄素、姜黄素结构类似物3、4在无水乙醇（溶液A）中最大吸收波长分别为426、380、374 nm，而在50%乙醇溶液（溶液B、C）中最大吸收红移至430、384、376 nm，这与溶剂极性增强有关。

3.3 姜黄素及其类似物的凋亡诱导作用

如表 3所示，双染结果表明10 μmol/L的姜黄素及其类似物3、4对耐药细胞K562/A02主要通过凋亡诱导作用产生细胞毒性，晚期凋亡及坏死的细胞比例较晚期凋亡比例低。在同样浓度下，类似物3、4的作用均优于姜黄素的作用。

表 3(Table 3)

表 3 姜黄素及其类似物对K562/A02细胞的凋亡诱导作用 (±s，n=3) Table 3 Induction of curcumin and its analogues on apoptosis of K562/A02 cells (±s，n=3) 组别 凋亡率 / % 正常活细胞 / % 早期凋亡 晚期凋亡与坏死 对照 2.32±0.78 1.57±0.21 96.11±1.12 姜黄素 15.90±1.20** 6.75±1.10** 77.35±1.58** 3 29.37±2.93** ## 10.97±1.30**# 59.66±3.85**## 4 25.54±3.68** # 8.09±1.34** 66.37±4.27**# 与对照组比较：**P＜0.01；与姜黄素组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01 **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 ##P < 0.01 vs curcumin group

表 3 姜黄素及其类似物对K562/A02细胞的凋亡诱导作用 (±s，n=3) Table 3 Induction of curcumin and its analogues on apoptosis of K562/A02 cells (±s，n=3)

图 2结果表明，姜黄素与其类似物3、4对K562/A02细胞有较强的caspase-3激活作用（图 2-A），其诱导的凋亡作用与细胞内MMP显著下降有关（图 2-B），但姜黄素作用细胞后细胞内ROS并未发现显著升高（图 2-C），提示姜黄素并不通过增加细胞内ROS发挥促凋亡作用。而姜黄素类似物3、4对细胞内ROS反而有一定的降低作用，推测此作用可能与其抗氧化能力有关。

图 2

Fig. 2

与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01 *** P＜0.001，下同 *P < 0.05 **P < 0.01 *** P < 0.001 vs control group,same as below图 2 姜黄素及其类似物3、4诱导K562/A02细胞凋亡与细胞内caspase-3活性 (A)、MMP (B) 和ROS (C) 水平的相关性 Fig. 2 Correlation between induction of curcumin and its analogues 3 and 4 on apoptosis in K562/A02 cells and intracellular caspase-3 activation (A),MMP level (B),and ROS generation (C)

如表 4所示，10 μmol/L的姜黄素及其类似物3、4对K562/A02细胞G₀/G₁期无显著影响，但均能减少处于G₂/M期和S期的细胞比例，相应亚二倍体量增加，指示细胞凋亡增强，此结果与Annexin V/FITC-PI双染结果一致：姜黄素与其类似物3、4均可显著增加细胞凋亡，且类似物3、4作用较强。

表 4(Table 4)

表 4 姜黄素及其类似物对K562/A02细胞周期的影响 (±s，n=3) Table 4 Effect of curcumin and its analogues on cell cycle in K562/A02 cells (±s，n=3) 组别 细胞周期分布 / % G0/G1期 G2/M期 S期 亚二倍体 对照 57.42±1.26 21.14±1.42 18.97±0.46 2.46±0.69 姜黄素 57.79±1.60 16.54±0.69** 18.22±1.03 7.45±1.94 3 58.57±1.54 13.58±0.69** 15.56±0.92** 12.30±2.00** 4 58.10±1.86 14.96±0.86** 15.38±0.51*** 11.56±2.03**

表 4 姜黄素及其类似物对K562/A02细胞周期的影响 (±s，n=3) Table 4 Effect of curcumin and its analogues on cell cycle in K562/A02 cells (±s，n=3)

Western blotting 检测显示，与对照组相比，经10 μmol/L姜黄素或其类似物3、4分别作用48 h后，K562/A02细胞P-gp蛋白表达显著降低（P＜0.01），姜黄素与其类似物3、4的作用效果相似，结果见图 3。

图 3

Fig. 3

图 3 姜黄素及其类似物降低K562/A02细胞P-gp蛋白表达(±s，n=3) Fig. 3 Decreasing effect of curcumin and its analogues on P-gp expression in K562/A02 cells (±s，n=3)

高内涵活细胞成像系统检测K562/A02细胞内阿霉素的累积，荧光强度扫描数据表明（图 4）：对照组的阿霉素在细胞中累积较少、荧光强度低，而预孵了姜黄素及其类似物3、4各组则均可显著增加阿霉素在细胞内的累积、荧光强度显著增加。此实验结果进一步验证了姜黄素及其类似物3、4对耐药细胞P-gp的抑制作用。

图 4

Fig. 4

图 4 姜黄素及其类似物对K562/A02细胞内阿霉素累积的影响 (±s，n=3) Fig. 4 Effectof curcumin and its analogues on intracellular adriamycin accumulation of K562/A02 cells (±s，n=3)

虽然姜黄素具有显著的抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗菌、抗病毒等活性，但是姜黄素不稳定、易降解、代谢快的问题还是极大地限制了其制备、储存及应用。这与姜黄素的化学结构有关，它的分子结构高度对称、共轭，其中β-二酮中的一个酮常以烯醇的形式存在，分子中心部分的α，β-双不饱和的1,3-二酮是代谢不稳定的最大因素，在水溶液和磷酸缓冲溶液中姜黄素的β-二酮极易断裂。因此普遍认为姜黄素分子中心部分是导致姜黄素在体内迅速降解的原因^[7,8]。本课题组通过对其中心部分改造，设计合成了一系列姜黄素类似物，拟从中筛选获得稳定性高、活性优越的苗头化合物。因此，在实验设计中，姜黄素分子中心部分选取代谢不敏感的电子等排体嘧啶环替换原有结构，不仅使酮羰基还原和1,3-二酮的断裂难以进行，而且最大限度地保持了原中心基团的理化性质：嘧啶环维持了分子中心部分的共轭性和平面性；2个氮原子均含有孤对电子，是优势氢键受体；并且鉴于嘧啶环的缺电子性质，2个碳碳双键的Michael受体的性质也予以最大程度的保留。此外，尽量不改变姜黄素周边的芳环，同时以3,4-氧代和2-卤代对其进行合理取代。和已知的类似物相比，本课题组设计的类似物对姜黄素分子结构的继承性更强，因此更有可能保留姜黄素原有的优势活性。

肿瘤多药耐药（MDR）是临床肿瘤化疗的最大障碍，表现为肿瘤细胞对结构各异、机制不同的多种药物均产生耐药的特点。多药耐药的主要机制是P-gp的过度表达，使抗肿瘤药物难以在细胞内达到有效浓度^[9]。迄今为止，尚未探索出有效的治疗措施。近20年来研究显示姜黄素在抑制敏感肿瘤细胞的转移、增生和浸润的过程中有多个作用靶点，但对其抗耐药肿瘤的作用研究较少^[10]。本研究发现姜黄素对耐药细胞K562/A02表现出较好的生长抑制作用，部分经结构修饰后的姜黄素结构类似物也同样表现出较好的抗耐药肿瘤细胞活性。进一步研究表明，姜黄素结构类似物3、4抗耐药肿瘤作用与姜黄素近似，机制研究表明其抗耐药肿瘤的作用与激活细胞凋亡通路有关，表现为降低细胞MMP、增加caspase-3活性、促进细胞凋亡，但此过程并未伴随细胞内ROS的大量产生。此外经姜黄素和其类似物3、4处理的细胞G₂/M期和S期细胞比例均有显著下调，亚二倍体显著增加，也提示细胞凋亡的增加。Western blotting结果提示姜黄素及其类似物3、4抗耐药肿瘤的作用可能与其下调P-gp有关，这与以往文献报道的姜黄素作用一致^[11,12]。此外，在细胞毒实验中发现，类似物3、4在撤药1周后后仍对K562/A02细胞有持续的生长抑制作用，而姜黄素组撤药后细胞逐渐恢复生长，提示类似物3、4可能具有比姜黄素更为持久的潜在抗肿瘤作用，其作用机制有待进一步研究。