痛宁凝胶是由醋延胡索、川芎、威灵仙、伸筋草等12味中药经提取、浓缩并加一定的赋形剂制成的凝胶剂，具有活血理气止痛、祛风通络除湿的作用，用于膝关节骨性关节炎属筋脉瘀滞，风湿注节证，症见关节疼痛，胫软膝酸，关节活动不利，局部肿胀，畏风恶寒，舌质偏红或边有积斑苔薄白，脉弦或滑。目前该制剂的质量控制方法主要为生物碱类成分^[1]和冰片、薄荷脑的含量测定^[2]，难以全面控制制剂的内在质量。为更好地控制痛宁凝胶的质量，本实验采用HPLC-MS法进行指纹图谱研究，并将18个共有峰在药材中进行归属，使得有关该制剂的质量控制能够深入到相关药材。

Agilent 1260高效液相色谱仪、DAD紫外检测器（安捷伦公司）；Agilent 1290超高压液相色谱仪、Agilent 6538 Q-TOF/MS质谱检测器、电喷雾（ESI）离子源（美国安捷伦公司）；KQ-250DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Mettler AE240电子分析天平（瑞士梅特勒公司）；BP211D电子分析天平（德国赛多利斯公司）；Milli-Q超纯水仪（密理博公司）；Centrifuge 5415D高速离心机（德国Eppendrof公司）。

5-O-甲基维斯阿米醇苷（批号111523-201007，质量分数以96.5%计）、升麻素苷（批号111522- 201210，质量分数以93.7%计）、阿魏酸（批号110773- 201313，质量分数以99.6%计）、绿原酸（批号110753-201415，质量分数以96.2%计）、延胡索乙素（批号110716-201414，质量分数以99.9%计）对照品均购自中国食品药品检定研究院，隐绿原酸（批号MUST-11112203，质量分数≥98%）、新绿原酸（批号MUST-11112202，质量分数≥98%）、木兰花碱（批号MUST-12022901，质量分数≥98%）对照品均购自成都曼斯特生物科技有限公司；乙腈（色谱纯，美国天地公司），甲酸（色谱纯，赛默飞世尔科技有限公司），水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

痛宁凝胶（规格15 g/支，批号130201、130202、130203、130301、130302、130303、140401、140402、140403、140404，）均由江苏南星药业有限责任公司生产。

Kromasil 100-5 C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脱，0～10 min 5%→14% A，10～20 min 14%→18% A，20～40 min 18%→35% A，40～60 min 35%→95% A；检测波长：240 nm；体积流量：1.0 mL/min；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。进行质谱分析时，流动相B用0.1%甲酸溶液替代。

ESI离子源，正、负离子模式，毛细管电压3 500 V（负离子模式）、4 000 V（正离子模式），雾化气压力310 kPa，干燥气体积流量10 L/min，加热毛细管温度350 ℃，源内裂解电压145 V，质量数扫描范围m/z 100～1 000。

分别取5-O-甲基维斯阿米醇苷、升麻素苷、阿魏酸、绿原酸、隐绿原酸和新绿原酸对照品适量，加甲醇制成15 μg/mL溶液；分别取延胡索乙素和木兰花碱对照品适量，加甲醇制成5 μg/mL溶液。

取痛宁凝胶约1.5 g，精密称定，加70%甲醇25 mL，超声（250 W，40 kHz）提取30 min，放冷，离心，取上清液，即得。

取批号130401痛宁凝胶供试品溶液，连续进样6次进行测定。以5-O-甲基维斯阿米醇苷为参照峰，计算指纹图谱中各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。结果18个共有峰的相对保留时间RSD值＜0.5%，相对峰面积RSD值＜2.4%，6次测定的色谱图相似度＞0.996。

取批号130401痛宁凝胶供试品溶液，分别于0、3、6、9、12、15、18 h测定指纹图谱。以5-O-甲基维斯阿米醇苷为参照峰，计算指纹图谱中各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。结果18个共有峰的相对保留时间RSD值＜1.9%，相对峰面积RSD值＜3.4%，色谱图相似度＞0.994，表明供试品溶液在18 h内稳定性良好。

取批号130401痛宁凝胶6份，制备供试品溶液，进样测定，记录色谱图。以5-O-甲基维斯阿米醇苷为参照峰，计算指纹图谱中各共有峰的相对保留时间、相对峰面积。结果表明，18个共有峰的相对保留时间RSD值＜0.7%，相对峰面积RSD值＜2.9%，色谱图相似度＞0.993。

取不同批次的痛宁凝胶样品，制备供试品溶液，进样测定，分别得到10批痛宁凝胶样品的指纹图谱，见图 1。

图 1

Fig. 1

图 1 不同批次痛宁凝胶指纹图谱 Fig. 1 Fingerprints of Tongning Gel for ten batches

将10批痛宁凝胶色谱图采用《中药色谱指纹图谱相似度评价系统A版》进行分析，生成痛宁凝胶共有模式的对照指纹图谱，标定18个共有峰，见图 2。样品色谱图与对照指纹图谱相似度见表 1，结果表明10批痛宁凝胶样品的相似度均在0.90以上。

图 2

Fig. 2

图 2 痛宁凝胶对照指纹图谱 Fig. 2 HPLC reference fingerprint of Tongning Gel S-5-O-甲基维斯阿米醇苷 S-4'-O-β-D-glucosyl-5-O-methylvisamminol

表 1 (Table 1)

表 1 痛宁凝胶指纹图谱相似度结果 Table 1 Similarity degrees of Tongning Gel 批 号 相似度 批 号 相似度 130201 0.964 130303 0.993 130202 0.970 140401 0.977 130203 0.966 140402 0.993 130301 0.991 140403 0.983 130302 0.930 140404 0.995

表 1 痛宁凝胶指纹图谱相似度结果 Table 1 Similarity degrees of Tongning Gel

取痛宁凝胶处方中12味药材及痛宁凝胶制备供试品溶液，进样测定，对比各吸收峰的紫外吸收光谱和相对保留时间，得到痛宁凝胶指纹图谱中的18个特征峰，结果表明1、2、3、15、16号峰来自花椒，4、5、6、10、11、17、18号峰来自海桐皮，12、13号峰来自延胡索，5、8、14号峰来自防风，7号峰来自川芎，9号峰来自威灵仙。提示6味药材对所建立的痛宁凝胶指纹图谱有贡献，其他药味如路路通、冰片和薄荷脑中主要化学成分无紫外吸收或响应较低，在该指纹图谱中无体现。

采用对照品比对，结合保留时间、MS数据和相关文献报道^{[3, 4, 5, 6]}对痛宁凝胶指纹图谱中共有峰进行指认，共指认12个共有峰。结果见表 2。

表 2 (Table 2)

表 2 12个共有峰通用名称、分子式和质谱数据 Table 2 The common name,molecular formula,and mass spectral data of 12 mutual peaks 峰号 tR/min 一级离子 实测值（m/z） 理论值（m/z） 偏差 分子式 化合物 1 10.2 [M－H]- [2M－H]- 353.088 7 707.185 0 353.087 8 707.182 9 -2.55 -2.97 C16H18O9 隐绿原酸 2 13.2 [M－H]- [2M－H]- 353.089 4 707.185 2 353.087 8 707.182 9 -4.61 -3.25 C16H18O9 绿原酸 3 14.0 [M－H]- [2M－H]- 353.088 5 707.184 4 353.087 8 707.182 9 -2.06 -2.10 C16H18O9 新绿原酸 4 16.9 [M＋H]+ 342.170 7 342.170 0 -2.09 C20H23NO4 木兰花碱 5 19.5 [M＋H]+ [M－H＋HCOOH]- 469.172 7 513.160 8 469.170 4 513.161 4 -4.83 1.10 C22H28O11 升麻素苷 7 27.4 [M－H]- 193.051 3 193.050 6 -3.46 C10H10O4 阿魏酸 8 28.1 [M＋H] + [M－H＋HCOOH]- 453.177 1 497.168 4 453.175 5 497.166 4 -3.48 -3.92 C22H28O10 5-O-甲基维斯阿米醇苷 12 31.3 [M＋H]+ 356.187 0 356.185 6 -3.83 C21H25NO4 延胡索乙素 13 38.3 [M＋H]+ 366.171 2 366.170 5 -1.82 C22H24NO4 脱氢紫堇碱 15 50.5 [M＋H]+ 264.196 4 264.195 8 -2.28 C16H25NO2 羟基-α-山椒素 16 50.8 [M＋H]+ 264.196 3 264.195 8 -2.26 C16H25NO2 羟基山椒素异构体 17 53.8 [M＋H]+ [M＋Na]+ [2M＋Na]+ 259.097 1 281.079 0 539.169 3 259.096 5 281.078 4 539.167 6 -2.37 -2.03 -3.08 C15H14O4 美花椒内酯 *为用对照品比对的化合物 * means compounds identified by reference substances

表 2 12个共有峰通用名称、分子式和质谱数据 Table 2 The common name,molecular formula,and mass spectral data of 12 mutual peaks

分别以不同体积分数的乙醇和甲醇为提取溶剂，并比较超声和回流两种提取方式，结果表明70%甲醇提取时，供试品色谱图中色谱峰最多且峰型较好；超声和回流两种提取方式得到的色谱图无明显差别。为操作简便，选择70%甲醇为提取溶剂进行超声提取。

比较了乙腈-水、乙腈-0.01%磷酸、乙腈-10 mmo/L乙酸铵溶液等不同流动相体系对痛宁凝胶指纹图谱的影响，结果流动相为乙腈-0.01%磷酸时，供试品色谱图中色谱峰分离最好。通过DAD检测器在190～400 nm进行全扫描，结果240 nm下的信息较全面，色谱峰较多且各色谱峰分离较好，因此选择240 nm作为检测波长。选用4根不同厂家色谱柱进行实验，比较分离度和峰型，结果表明Kromasil 100-5 C₁₈色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 µm）较合适。

痛宁凝胶处方由醋延胡索、川芎、威灵仙、伸筋草、东北透骨草、路路通、海桐皮、防风、花椒、牛膝、薄荷脑和冰片共12味药组成，根据对各药味的分析，其主要有效可测成分为延胡索乙素、阿魏酸、升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷等，其中5- O-甲基维斯阿米醇苷含量较高，分离较好，保留时间较为适中，含量较稳定，因此选择其5- O -甲基维斯阿米醇苷作为参照物。

10批痛宁凝胶指纹图谱结果表明不同批次样品整体质量差异较小，处方中6味药材对该指纹图谱做出贡献，能较好的控制产品质量。在后续的研究中将结合HPLC-ELSD和GC法继续对其他成分进行考察，并建立质控方法，为全面控制痛宁凝胶质量提供依据。