2017, Vol. 48
表 1(Table 1)
秦七风湿方HPLC指纹图谱研究
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2017.05.014 |
杨莎, 周瑞, 唐志书, 宋忠兴, 刘妍如, 史鑫波, 白宏博, 钱大玮. 秦七风湿方HPLC指纹图谱研究[J]. 中草药, 2017, 48(5): 924-929.
YANG Sha, ZHOU Rui, TANG Zhi-shu, SONG Zhong-xing, LIU Yan-ru, Shi Xin-bo, Bai Hong-bo, QIAN Da-wei. HPLC fingerprint of Qinqi Rheumatism Formula[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2017, 48(5): 924-929 .
秦七风湿方HPLC指纹图谱研究
1. 陕西中医药大学/陕西省中药资源产业化协同创新中心/陕西省中药基础与新药研究重点实验室, 陕西 咸阳 712083;
2. 南京中医药大学, 江苏 南京 210023
2. 南京中医药大学, 江苏 南京 210023
摘要:
目的
建立秦七风湿方的HPLC指纹图谱，为其质量评价及药效物质基础研究提供依据。
方法
采用Inert Sustain C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；以0.1%磷酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱；检测波长为203 nm；柱温为30℃；体积流量为1 mL/min；测定10批秦七风湿方样品，利用中药色谱相似度评价系统（2004A版）建立秦七风湿方HPLC指纹图谱，并通过对照品对共有峰进行指认。
结果
建立了秦七风湿方HPLC指纹图谱，10批样品的相似度均在0.99以上，共标定19个共有峰，8个峰来源于珠子参，8个峰来源于秦艽，5个峰来源于山茱萸（其中1号峰为珠子参、秦艽和山茱萸共有），并通过与对照品比较指认了其中8个色谱峰，分别为马钱苷酸（2号峰）、莫诺苷（3号峰）、龙胆苦苷（5号峰）、马钱苷（6号峰）、人参皂苷Ro（12号峰）、人参皂苷F1（13号峰）、竹节参皂苷IVa（14号峰）、人参皂苷F2（17号峰）。
结论
所建立的方法稳定、准确、重复性好，可为秦七风湿方的质量控制及药效物质基础研究提供依据。
关键词:
秦七风湿方
HPLC
指纹图谱
质量评价
药效物质基础
相似度
珠子参
秦艽
山茱萸
马钱苷酸
莫诺苷
龙胆苦苷
马钱苷
人参皂苷Ro
人参皂苷F1
竹节参皂苷IVa
人参皂苷F2
HPLC fingerprint of Qinqi Rheumatism Formula
YANG Sha1
, ZHOU Rui1
, TANG Zhi-shu1, SONG Zhong-xing1, LIU Yan-ru1, Shi Xin-bo1, Bai Hong-bo1, QIAN Da-wei2
, ZHOU Rui1, TANG Zhi-shu1, SONG Zhong-xing1, LIU Yan-ru1, Shi Xin-bo1, Bai Hong-bo1, QIAN Da-wei2
1. Shaanxi University of Chinese Medicine/Shaanxi Collaborative Innovation Center of Chinese Medicinal Resources Industrialization/Shaanxi Province Key Laboratory of New Drugs and Chinese Medicine Foundation Research, Xianyang 712083, China;
2. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China
2. Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, China
Abstract:
Objective
To establish an HPLC fingerprint of Qinqi Rheumatism Formula (QRF) for its quality control and effective components determination.
Methods
HPLC method was performed on Inert Sustain C18 (150 mm×4.6 mm, 5 μm) column with gradient elution composed of acetonitrile-aqueous solution containing 0.1% phosphoric acid at the flow rate of 1.0 mL/min. The column temperature was set at 30℃, while the detective wavelength was set at 203 nm. The common mode of HPLC fingerprint for 10 batches of QRF was established with Similarity Evaluation System for Chromatographic Fingerprint of Traditional Chinese Medicine (2004 A edition) and the common peaks were identified by reference compounds.
Results
Fingerprints of QRF were established. The similarities of the 10 batches of samples were above 0.99. A total of 19 common peaks were found. Eight mutual peaks were from Panacis Majoris Rhizoma, eight mutual peaks were from Gentianae Macrophyllae Radix, and five mutual peaks were from Corni Fructus (Peak 1 was the common peak from Panacis Majoris Rhizoma, Gentianae Macrophyllae Radix, and Corni Fructus). Based on the retention time of reference substances, eight constituents including loganic acid (peak 2), morroniside (peak 3), gentiopicroside (peak 5), loganin (peak 6), ginsenoside Ro (peak 12), ginsenoside F1 (peak 13), panax japonicus IVa (peak 14), and ginsenoside F2 (peak 17) were indentified.
Conclusion
The method is stable, specific, and reproducible, and can be used for the quality control of QRF and the study of its effective components.
Key words:
Qinqi Rheumatism Formula
HPLC
fingerprint
quality evaluation
pharmacodynamic material basis
similarity
Panacis Majoris Rhizoma
Gentianae Macrophyllae Radix
loganic acid
morroniside
gentiopicroside
loganin
ginsenoside Ro
ginsenoside F1
panax japonicus IVa
ginsenoside F2
类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种累及周围关节为主的多系统性炎症性自身免疫疾病[1-2]。目前临床上用于治疗RA的药物长期服用普遍会引起较大的毒副作用[3]。中药治疗RA表现出多层次、多靶点及毒副作用小等优点[4-6]。
组方自陕西太白“七”药的秦七风湿方是由珠子参、秦艽、山茱萸所组成[7]，是陕西中医药大学杨秀清教授的临床经验方，在临床以汤剂应用多年，已被证实具有散寒除湿、益气养阴、祛风止痛之功效，对寒湿阻络所致的痹病如RA，症见身困乏力、关节肌肉疼痛、重着麻木、屈伸不利或关节肿胀疼痛等具有显著疗效，并且具有较高的安全性和有效性。该方中珠子参、秦艽及山茱萸含有丰富的化学成分，并具有广泛的药理活性[8-12]。课题组前期基于分离技术对秦七风湿方的制备[13]、指标性成分差异[7]及不同分离技术对该方水提液物理化学参数的影响[14]进行了研究。目前，对于秦七风湿方的有效化学成分和HPLC指纹图谱没有明确的分析。指纹图谱可以全面地反映复方中药所含化学成分的种类和数量，并能有效地控制和评价复方中药的质量[15-18]。本研究建立了秦七风湿方HPLC指纹图谱，并对其共有峰来源进行了指认，以期为秦七风湿方的质量控制及药效物质基础研究提供实验依据。
1 仪器与材料Agilent 1260高效液相色谱仪系统包括自动进样装置，二元梯度泵，柱温箱，DAD检测器，美国安捷伦科技公司；色谱柱为Inert Sustain C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent5 TC-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；TGL-20B低速离心机，上海安亭科学仪器厂；CPA225D电子天平，北京赛多利斯科学仪器有限公司；SY-2000旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；KQ-300DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。
甲醇、乙腈均为色谱纯，上海霍尼韦尔贸易有限公司；磷酸，分析纯，批号20120312，购于天津市科密欧化学试剂有限公司；水为娃哈哈纯净水。对照品马钱子苷（批号111640-201606，质量分数98.3%）、龙胆苦苷（批号110770-201515，质量分数99.1%）、马钱苷酸（批号111865-201403，质量分数94.7%）、竹节参皂苷IVa（批号111861-201102，质量分数77.6%）均购于中国食品药品检定研究院；对照品人参皂苷Ro（批号20151025，质量分数98.0%）、莫诺苷（批号20160324，质量分数98.0%）、人参皂苷F1（批号20150916，质量分数98.0%）、人参皂苷F2（批号20150621，质量分数98.0%）均购于宝鸡市辰光生物科技有限公司。珠子参10批（批号20160401、20160302、20160201、20151003、20150901、20150801、20140802、20140701、20140603、20140502）、秦艽10批（批号20160402、20160301、20160202、20151201、20151101、20151002、20150901、20140502、20140401、20140302）、山茱萸10批（批号20160403、20160301、20151201、20151102、20150902、20150701、20140901、20140801、20140702、20140601）饮片均购于陕西兴盛德药业有限公司，经陕西中医药大学刘世军高级工程师鉴定均为正品，珠子参为五加科人参属假人参亚属植物珠子参Panax japonicus C. A. Mey. var. major (Burk.) C. Y. Wu et K. M. Feng的干燥根茎，秦艽为龙胆科龙胆属植物秦艽Gentiana macrophylla Pall.的干燥根，山茱萸为山茱萸科山茱萸属植物山茱萸Cornus officinalis Sieb. et Zucc.的干燥成熟果肉，均符合《中国药典》2015年版相关规定，取10批珠子参、秦艽、山茱萸饮片制备得秦七风湿方（批号160601、160602、160603、160701、160702、160703、160705、160801、160802、160803，依次编号为S1~S10）。
2 方法与结果 2.1 色谱条件[19]色谱柱为Inert Sustain C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为0.1%磷酸水溶液-乙腈；梯度洗脱：0~16 min，6%~10%乙腈；16~21 min，10%~16%乙腈；21~32 min，16%~20%乙腈；32~45 min，20%~32%乙腈；45~50 min，32%~45%乙腈；50~60 min，45%~65%乙腈；60~70 min，65%~100%乙腈；70~72 min，100%~6%乙腈；72~75 min，6%乙腈；体积流量1 mL/min；进样量20 μL；柱温30 ℃；检测波长203 nm。
2.2 样品的制备 2.2.1 秦七风湿方样品的制备分别称取珠子参10 g、秦艽15 g、山茱萸15 g，加16倍量的水煎煮3次，每次2 h，滤过，合并滤液进行浓缩，并经旋转蒸发仪蒸干后制成干粉，备用。
2.2.2 单味药样品的制备分别准确称取珠子参10 g、秦艽15 g、山茱萸15 g，按“2.2.1”项下方法制备各单味药材粉末，备用。
2.2.3 阴性样品的制备按“2.2.1”项下配比制备缺各药材的阴性样品干粉，备用。
2.3 溶液的制备 2.3.1 对照品溶液的制备精密称取8种对照品竹节参皂苷IVa、马钱子苷、龙胆苦苷、马钱苷酸、人参皂苷Ro、莫诺苷、人参皂苷F1、人参皂苷F2各适量，加甲醇溶解，制成质量浓度均为1 mg/mL的混合对照品溶液，摇匀即得。
2.3.2 供试品溶液的制备精密称取秦七风湿方的药材粉末0.5 g，置10 mL量瓶中，精密加入2 mL水溶解，再加80%甲醇定容至10 mL，超声20 min，3 000 r/min离心10 min，吸取上清液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得供试品溶液。
2.3.3 各单味药材溶液的制备分别准确称取珠子参、秦艽、山茱萸药材样品粉末各0.3 g，置10 mL量瓶中，精密加入2 mL水溶解，再加80%甲醇定容至10 mL，超声20 min，3 000 r/min离心10 min，吸取上清液，经0.22 μm微孔滤膜滤过，即得各单味药材溶液。
2.3.4 阴性样品溶液的制备分别准确称取缺各味药材的阴性样品干粉0.3 g，按“2.3.2”项下的方法制备，即得阴性样品溶液。
2.4 方法学考察 2.4.1 精密度试验精密称取同一批秦七风湿方样品粉末适量，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，连续进样6次，按“2.1”项下方法测定，结果表明，6张谱图相似度均＞0.99，各共有峰的相对保留时间及峰面积的RSD值均＜1.75%，说明仪器的精密度良好。
2.4.2 重复性试验精密称取同一批秦七风湿方样品粉末适量，按“2.3.2”项下方法平行制备供试品溶液6份，按“2.1”项下的色谱条件分别进样，结果表明，6张色谱图相似度均＞0.99，各共有峰的相对保留时间及峰面积的RSD值均＜2.20%，表明方法的重复性良好。
2.4.3 稳定性试验精密称取同一批秦七风湿方样品粉末适量，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，依据“2.1”项下的色谱条件在0、2、4、6、8、10、12、24 h取样测定，结果表明，8张色谱图相似度均＞0.99，各共有峰的相对保留时间及峰面积的RSD值均＜1.65%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
2.5 指纹图谱的建立及相似度计算 2.5.1 10批秦七风湿方HPLC指纹图谱的建立取秦七风湿方10批，分别按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，记录色谱图（图 1）。对10批样品数据进行分析，采用多点校正方式（时间窗宽度为0.1 min），用平均数法生成指纹图谱和对照指纹图谱（图 1）。
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图 1 10批秦七风湿方HPLC指纹图谱及其对照指纹图谱 (R) Fig.1 HPLC fingerprint of 10 batches of QRF and reference fingerprint (R) |
2.5.2 主要色谱峰的指认
共标定19个色谱峰，通过与混合对照品对照（图 2），分别指认了8个色谱峰，其中2号峰为马钱苷酸，3号峰为莫诺苷，5号峰为龙胆苦苷，6号峰为马钱苷，12号峰为人参皂苷Ro，13号峰为人参皂苷F1，14号峰为竹节参皂苷IVa，17号峰为人参皂苷F2，保留时间分别为12.371、14.305、21.026、22.169、50.672、51.711、52.145、54.585 min。12号峰（人参皂苷Ro）峰形好，分离度良好，其量稳定，选此峰为参照峰（S）。以12号峰人参皂苷Ro为参照峰，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积见表 1和2。
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2-马钱苷酸3-莫诺苷5-龙胆苦苷6-马钱苷12-人参皂苷Ro 13-人参皂苷F1 14-竹节参皂苷IVa 17-人参皂苷F2 2-loganic acid 3-morroniside 5-gentiopicroside 6-loganin 12-ginsenoside Ro 13-ginsenoside F1 14-chikusetsu saponin IVa 17-ginsenoside F2 图 2 混合对照品HPLC图 Fig.2 HPLC of mixed reference substances |
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表 1 秦七风湿方19个共有峰的相对保留时间 Table 1 Relative retention time of common peaks of QRF |
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表 2 秦七风湿方19个共有峰的相对峰面积 Table 2 Relative peak areas of 19 common peaks of QRF |
2.5.3 共有峰的归属
按照“2.3.2”项下方法分别制备秦七风湿方供试品溶液、各单味药材供试品溶液、混合对照品溶液和阴性样品溶液，按“2.1”项色谱条件进样分析，得到各样品的HPLC图谱（图 3）。通过各共有峰的保留时间与色谱图进行比较分析，结果显示，秦七风湿方指纹图谱的19个共有峰中，其中1、3、6、8、11号峰来源于山茱萸，1、2、4、5、7、9、10、15号峰来源于秦艽，1、12、13、14、16、17、18、19号峰来源于珠子参。
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图 3 秦七风湿方、各单味药材及阴性样品的HPLC图 Fig.3 HPLC fingerprint of QRF, single herb, and negative control decoction solution |
2.5.4 相似度分析
采用国家药典委员会的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，将测定的10批样品指纹图谱数据与生成的对照指纹图谱进行相似度分析，结果显示10批样品的指纹图谱与对照图谱的相似度均在0.99以上（表 3），说明本品的质量稳定性良好。
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表 3 10批秦七风湿方指纹图谱相似度计算结果 Table 3 Similarities of 10 batches of QRF |
3 讨论 3.1 样品溶液制备方法考察
本实验考察了供试品溶液直接加水超声溶解经微孔滤膜滤过进样、加甲醇超声溶解过滤进样、先加水超声溶解，再加甲醇离心滤过进样，共3种制备秦七风湿方供试品溶液方法，分别比较了3种方法所得的样品谱图，结果显示，先加水超声溶解，再加甲醇离心滤过进样所得的谱图检测的成分相对较多，各峰高比例适中，峰形和分离效果较好，基线平稳，因此采用先加水超声溶解，再加甲醇离心滤过作为秦七风湿方供试品溶液的制备方法。
3.2 色谱条件选择本实验考察了Inert Sustain C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent5 TC-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）2种不同类型的色谱柱，结果表明Inert Sustain C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）色谱柱分离效果好，柱效高，因此选用该色谱柱。
考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%磷酸水溶液、乙腈-0.2%磷酸水溶液等不同体系流动相，结果表明乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相色谱峰出峰率较多，各峰之间分离度良好，柱效较好，基线较平稳。
考察了25、30、35 ℃柱温对分离效果的影响，结果显示温度过低或升高，对色谱峰的分离效果变差，因此确定柱温为30 ℃。
本实验比较了203、238、254、272 nm波长下的样品谱图，结果显示在203 nm波长下检测到的图谱出峰较多，因此确定检测波长为203 nm。
3.3 小结本实验首次建立了秦七风湿方HPLC指纹图谱，共标定19个共有峰，并指认了其中8个色谱峰。采用相似度分析对不同批次的秦七风湿方指纹图谱进行评价。该方法稳定，精密度、重复性好，为秦七风湿方的质量控制及其下一步的药效物质基础研究提供依据。
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