2017, Vol. 48
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2017.05.008 |
2. 云南省三七资源可持续利用重点实验室, 云南 昆明 650500;
3. 国家中医药管理局三七资源可持续发展利用研究室, 云南 昆明 650500;
4. 昆明市道地药材可持续发展利用重点实验室, 云南 昆明 650500;
5. 云南白药集团中药资源有限公司, 云南 昆明 650502
, ZHU Jun-xiao1,2,3,4, CUI Xiu-ming1,2,3,4, LIN Ya-meng5, YANG Ye1,2,3,4, QU Yuan1,2,3,4, WANG Cheng-xiao1,2,3,4
, YANG Xiao-yan1,2,3,4
2. Yunnan Provincial Key Laboratory of Panax notoginseng, Kunming 650500, China;
3. Key Laboratory of Panax notoginseng Resources Sustainable Development and Utilization of State Administration of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, China;
4. Kunming Key Laboratory of Sustainable Development and Utilization of Famous-Region Drug, Kunming 650500, China;
5. Yunnan Baiyao Group Chinese Medicinal Resources Co., Ltd., Kunming 650502, China
天然多糖由于具有良好的物理性能和生物可降解性，在药物递送系统（drug delivery system，DDS）和组织修复工程中具有广阔的应用前景[1]，并受到高度重视。白及多糖（Bletilla striata polysaccharides，BSP）为兰科植物白及Bletilla striata (Thunb.) Reichb. f.的主要活性成分，具有促进伤口愈合[2-3]、抗老化[4]和抗菌[5]等活性。其相对分子质量大小为1.35×105[6]，由α-甘露糖、β-甘露糖和β-葡萄糖组合而成，其中，甘露糖与葡萄糖的物质的量之比约为2.4:1。BSP可作为一种理想的止血敷料基质。王爱民等[7]以维生素K1为参照，建立了白及药材的止血生物效价；王玮[8]和王巍等[9]分别制备了白及止血粉和白及止血海绵，并进行了止血活性的评价。本研究以BSP为原料，成功制备了一种具有皮肤促渗活性和止血活性的水凝胶[10-11]基质。该水凝胶流变学特性良好，兼具经皮促渗和止血的生理活性，在医用敷料和经皮药物传递系统中具有潜在的应用价值。
1 仪器与试剂DFY-500粉碎机，中国上海大德仪器有限公司；DEAE-cellulose（3 cm×45 cm），英国美特斯通公司；UV-2600分光光度计，日本岛津公司；Sephadex G-200（1.4 cm×75 cm），美国Pharmacia公司；TENSOR 27傅里叶变换红外光谱（FTIR）仪，德国卡尔斯鲁厄Bruker公司；DTG-60热重分析仪，日本岛津公司；DMAX-2250衍射仪，日本东京日本理学公司；MCR501流变仪，奥地利AntonPaar公司；Vapor meter经皮水分散失速率测定仪，芬兰Delfin公司；XN06-IV半自动血浆凝血分析仪，武汉景川诊断技术股份有限公司。
白及药材购于中国云南省昆明市菊花村药材市场，经昆明理工大学杨野副教授鉴定为兰科白及属植物白及Bletilla striata (Thunb.) Reichb. f.的块茎；卡波姆940，美国克利夫兰Noveon化学工业公司；水为超纯水；其他试剂均为市售分析纯。
2 方法与结果 2.1 提取与提纯 2.1.1 BSP的提取将干燥后的白及块茎粉碎，取白及粉末100 g和4 000 mL蒸馏水加入至5 000 mL烧杯中，80 ℃水浴3.5 h。提取液3 000 r/min离心2 min，加热至60 ℃，放入5 g/L活性炭脱色1.5 h并滤过。滤液浓缩至700 mL成稠状液体，冷却，将一定体积的95%乙醇缓慢加入到溶液中，以达到70%的体积分数。完全沉淀呈絮状多糖后，将混合物3 000 r/min离心20 min，收集沉淀物并45 ℃真空干燥72 h。最后，获得约16 g粗BSP产物[12-13]。
2.1.2 BSP的提纯使用酶解和Sevag反应除去蛋白质。取粗BSP溶解在水中，加入5 g/L木瓜蛋白酶40 ℃酶解3 h。以Sevag法除去多糖中的蛋白质，以透析膜（截留相对分子质量3 500）透析除去小分子并以紫外分光光度仪进行检测（400~200 nm）。使用DEAE-cellulose（3 cm×45 cm）柱和Sephadex G-200（1.4 cm×75 cm）柱色谱，最后真空干燥得到BSP纯化产物[13-14]。
2.2 BSP的表征 2.2.1 红外光谱用FTIR光谱仪进行BSP的红外表征。测试条件：干燥的样品2 mg，KBr压片，在500~4 000 cm−1进行FTIR光谱扫描，记录红外图谱，见图 1。红外光谱图中，895.8 cm−1处的特征吸收峰表明多糖中有β-葡萄糖基存在。810.2 cm−1处的特征吸收峰表明单糖分子的存在。在1 031.7和1 148.5 cm−1的强吸收峰显示了吡喃型糖基。1 650和1 550 cm−1处无显著吸收，表明多糖中无氨基基团残留，纯度较高。该红外光谱与文献报道一致[6]。
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图 1 BSP的红外光谱表征 Fig.1 FTIR Spectroscopy of BSP |
2.2.2 热分析
使用DTG-60热重分析仪进行测试。升温速度10 ℃/min；温度范围20~500 ℃，填充气体为氮气。BSP的热重分析（thermogravimetric analysis，TGA）曲线见图 2。BSP的热降解分2步进行。在50~100 ℃，BSP有1个小的失重过程，失重约为10%，这是物料所含的结合水和结晶水产生的。在250~350 ℃，BSP发生剧烈降解，失重约60%。随后，BSP在测试温度内失重趋势变缓。
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图 2 BSP的TGA曲线 Fig.2 TGA curve of BSP |
图 3为BSP的差热分析（differential thermal analysis，DTA）曲线，在100 ℃之前，有1个小的吸热峰，与BSP的失水过程相关；在250~300 ℃有1个强烈的放热峰，峰值为300 ℃左右，该峰与BSP的剧烈降解相关。DTA曲线显示结果与TGA结果相符。
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图 3 BSP的DTA曲线 Fig.3 DTA curve of BSP |
由热分解行为可知，BSP的降解行为具有典型的多糖特征，BSP的热降解分2步进行，首先是BSP内部的结合水损失；在250 ℃之后为多糖的自身降解失重。BSP的降解行为与文献报道一致[6]。
2.2.3 X射线衍射分析使用DMAX-2250衍射仪对BSP粉末进行X射线衍射分析。操作条件为Kα射线，测量电压36 kV，电流26 mA，扫描速率为0.05°/min，扫描角度为10°~100°（2θ），扫描间隔0.02°。其结果见图 4。由图 4可知，样品的曲线无尖锐峰，仅有少量小峰存在，表明该BSP是非晶体无定形材料[6]。
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图 4 BSP的XRD分析 Fig.4 XRD analysis of BSP |
2.3 BSP水凝胶的制备
精确称取一定量提纯后的BSP完全溶解于18.0 mL蒸馏水中制备成BSP溶液。取0.1 g卡波姆940加入到该溶液中加热至80 ℃持续5 h，然后加入2.0 mL甘油继续搅拌3 min，后使用一定量的三乙醇胺调节pH值至7.4。制备出5个不同质量浓度的BSP水凝胶制剂（表 1）。
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表 1 BSP水凝胶配比组成 Table 1 Composition of BSP hydrogel |
2.4 BSP水凝胶的流变学测试
采用旋转流变仪测定BSP水凝胶的流变学特性。测试模式：频率扫描模式。测试参数：温度32 ℃（皮肤温度面），频率0.01~100 Hz[15]。分别以频率为横坐标，以存储模量（G′）、损耗模量（G″）以及动态复数黏度（η′）为纵坐标绘制水凝胶的流变学特征图，见图 5。通常，材料的G′与其固态特性有关，G″与其液态特性有关。空白对照水凝胶的谱图中，在线性黏弹范围（频率0.01~100 Hz）内，G′的值高于G″，且二者都表现出了明显的频率无关性，是典型的水凝胶行为[16]。
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a-G′随频率变化曲线b-G″随频率变化曲线c-η′随频率变化曲线 a-curves of G′ vs frequency variation b-curves of G″ vs frequency variation c-curves of η′ vs frequency 图 5 不同配比的BSP水凝胶的流变性能 Fig.5 Rheological properties of BSP hydrogels |
与空白对照凝胶相比，BSP水凝胶在测试范围内表现出更高的G′和G″值（图 5-a和图 5-b）。且随BSP质量分数的增加，G′和G″均出现升高趋势，处方5（BSP质量分数2%）的G′和G″均明显高于处方2（BSP质量分数0.5%）。与之相对应地，BSP水凝胶的η′值也高于空白对照（图 5-c），且与BSP质量分数呈现正相关。水凝胶中加入BSP后，黏度显著提高。
2.5 BSP水凝胶皮肤通透性评价经皮水分散失速率（trans-epidermal water loss，TEWL）指单位时间单位面积内水分经由皮肤角质层向外扩散的量，是衡量皮肤角质层屏障作用的重要参数[17]。本实验以经皮水分散失速率为指标，考察BSP水凝胶对受试动物皮肤角质层屏障作用的影响。实验开始时，将30只小鼠（雌雄各半）根据表 1中水凝胶的配比随机分为5组，每组6只。在实验前24 h，小心剃除小鼠背部的体毛（1 cm×1 cm）作为给药部位。根据分组，在每组小鼠背部给药部位均匀涂抹供试凝胶或空白凝胶0.3 mL，每只小鼠隔离饲养。参考文献方法[17]，给药前1.0 h和给药后1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0 h时分别用经皮水分散失仪测定给药部位的TEWL值。计算增渗比（enhancement ratio，ER）。
ER=TEWLt/TEWL0
TEWL0为给药前的TEWL值，TEWLt为BSP水凝胶给药后t时的TEWL值
各组受试动物的TEWL值见表 2。由表 2可知，正常小鼠皮肤的TEWL值为27 g/(m2∙h) 左右，给药前各组组间相比无显著差异（P＞0.05）。给药1 h后，空白对照组（凝胶1）小鼠的TEWL值从（27.15±3.62）g/(m2∙h) 升高到（32.30±3.97）g/(m2∙h)，且随着给药时间的延长逐渐降低。BSP水凝胶组给药1 h后的TEWL值出现了大幅提升。且提升幅度与水凝胶中BSP质量分数呈现正相关。其中，水凝胶组5（BSP质量分数2%）在给药1 h后的TEWL值最高，为（53.00±4.08）g/(m2∙h)，显著高于给药前的对应值（P＜0.01）。
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表 2 给药后小鼠皮肤的TEWL值变化 (x±s, n=6) Table 2 Changes in TEWL values of mouse skin after administration of BSP gel (x±s, n=6) |
图 6描述了各组动物ER值随时间变化的曲线。给药1 h后，各组动物的ER值根据水凝胶中BSP质量分数的增加都出现了不同程度的提高。其中，凝胶5的ER值最高，为1.84，与表 2中的结果相对应。值得注意的是，在1 h后，各组受试动物的ER值都显著下降，到3 h时ER值已接近1。
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图 6 给药后小鼠皮肤ER值随时间变化图 (x±s, n=6) Fig.6 Percentage changes of ER in mice after administration (x±s, n=6) |
2.6 BSP水凝胶的生物活性评价 2.6.1 止血时间（bleeding time，BT）测定
参考文献方法进行BT测定[8]。将30只小鼠（雌雄各半）根据表 1中的水凝胶配比随机分为5组，每组6只。用无菌刀片将距小鼠尾端5 mm处割破，立即于伤口涂抹100 μL相应水凝胶并开始计时。每15秒观察1次，伤口不再出血视为出血停止。从开始出血至出血停止的时间为小鼠BT。另取6只小鼠作为自然止血组（雌雄各半），自然止血组不加任何样品，其余处理方法同实验组，同样待伤口不再渗血后记录BT。
各组实验动物的BT测定值见表 3。自然止血组与凝胶1组相比较，2组实验动物的BT值并无明显区别（P＞0.05）。而BSP水凝胶可降低动物的BT值，具有止血效果。且止血效果与BSP质量分数呈正相关。其中，凝胶3、4和5组受试动物的BT值显著低于凝胶1组（P＜0.05）。
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表 3 BSP水凝胶对小鼠BT的影响 (x±s, n=6) Table 3 Effects of BSP hydrogels on bleeding time in mice (x±s, n=6) |
2.6.2 凝血4项测定
参考文献方法进行凝血4项测定[18]。将大鼠断颈取全血，存储在预涂3.8%肝素钠的试管内，在室温下10 000 r/min离心分离10 min，小心吸取上层血浆，在2 h内进行实验。
取上述血浆100 μL，分别加入25 μL不同BSP质量分数的凝胶样品（同体积生理盐水作为阴性对照），混匀后，37 ℃孵育，用XN06-Ⅳ半自动血浆凝血分析仪进行凝血酶原时间（prothrombin time，PT）、凝血酶时间（thrombin time，TT）、活化部分凝血酶时间（activated partial thromboplastin time，APTT）、纤维蛋白原量（fibrinogen，FIB）测定。每种凝胶平行4次实验。
由表 4可知，与凝胶1组相比，BSP水凝胶组的PT并未发生明显改变，而APTT和TT值出现不同程度地降低，降低程度与BSP质量分数直接相关。另一方面，FIB值随着BSP质量分数的增加显著上升。上述结果表明BSP水凝胶对血浆凝固起到促进作用[19]。
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表 4 BSP水凝胶对小鼠凝血4项指标的影响 (x±s, n=4) Table 4 Effects of BSP hydrogels on plasma coagulation time of mice (x±s, n=4) |
3 讨论
本实验通过水提醇沉法从白及中提取得到了BSP，并通过酶解和Sevag法进行纯化。通过FTIR、TGA、DTA、XRD等方法对BSP进行表征，将特征谱图与相关文献比较后发现，实验制备的BSP纯度较高且结构完整。
本实验设计了一系列BSP质量分数梯度（0~2%），将其和卡波姆交联制备得到水凝胶。通过流变学考察发现，BSP与卡波姆分子之间通过分子链穿插缠结形成网状结构，强化了凝胶的黏度。且由于BSP中的强氢键之间的相互作用，水凝胶表现出了良好的物理强度。
BSP水凝胶对皮肤屏障的通透性也具有一定的改善作用。通过在体TEWL考察发现，BSP水凝胶可以显著提升受试动物的TEWL值，从而增加了皮肤通透性，且该改善作用是可逆的，当给药3 h后，TEWL值恢复到正常水平。
BSP已被证明具有止血、凝血功能、促进伤口愈合等活性[3, 20-21]。通过进一步研究发现，BSP水凝胶在经皮给药后，表现出了明显的止血活性。结合其皮肤促渗活性，BSP水凝胶的在伤口敷料和经皮给药载体领域具有广阔的应用前景。
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