补骨脂为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L. 的干燥成熟果实，具有温肾助阳、纳气平喘、温脾止泻功效；外用消风祛斑。用于肾阳不足、阳痿遗精、遗尿尿频、腰膝冷痛、肾虚作喘、五更泄泻；外用治白癜风，斑秃^[1]。补骨脂主要含有香豆素类、黄酮类、单萜酚类（主要有补骨脂酚等）等成分，各成分之间相互作用，才能形成多样的生理作用，如光敏作用、扩张冠状动脉、抑菌、抗肿瘤、抗病毒、增强免疫、抗哮喘^[2-3]等。

药物炮制前后化学成分的变化一直是炮制研究的热点问题。有学者建立了同时测定补骨脂中多种成分的方法及炮制工艺^[4-5]，研究了补骨脂炮制前后香豆素类、黄酮类、单萜酚类成分的变化^[6-7]，但分析时间长，方法较复杂，且尚未探讨炮制时间与成分量的关系。《中国药典》2015年版收载补骨脂测定指标性成分仅为补骨脂素和异补骨脂素^[1]，质量控制标准有待进一步提高。为此，本实验建立了快速测定补骨脂中10种成分（香豆素类：补骨脂素、异补骨脂素、补骨脂定；黄酮类：补骨脂二氢黄酮、新补骨脂异黄酮、异补骨脂查耳酮、补骨脂宁、异补骨脂二氢黄酮、补骨脂二氢黄酮甲醚；酚萜类：补骨脂酚）量的方法，并探讨不同盐炙程度补骨脂中成分的变化情况。

补骨脂药材产自亳州，由河南中医药大学李凯副教授鉴定为豆科植物补骨脂Psoralea corylifolia L. 的干燥成熟果实；Waters 1525高效液相色谱仪（Waters 2489紫外检测器，Breeze2色谱管理系统）；Agilent，ZORBAX SB-C₁₈色谱柱（50 mm×4.6 mm，1.8 μm）；AUW120D型十万分之一分析天平（岛津）；KDM型电热套（山东菏泽石油化工学校仪器设备厂）；FW-200型万能粉碎机（北京中兴伟业仪器有限公司）；微孔滤膜（津腾，0.45 μm）；移液枪（Dragon Laboratory Instruments Limited，1 000 μL）；甲醇（天津市四友精细化学品有限公司，色谱纯）；乙腈（天津市致远化学试剂有限公司，色谱纯）；超纯水（Milli-Q Advantage A10自制）；补骨脂素（批号110739-200814）、异补骨脂素（批号110738-200511）购自中国食品药品检定研究院，补骨脂二氢黄酮（即补骨脂甲素）购自南京泽朗植物提取物有限公司，新补骨脂异黄酮（批号14042521，质量分数98%）、异补骨脂查耳酮（即补骨脂乙素，批号14121331，质量分数97%）、补骨脂宁（批号15021931，质量分数98%）、异补骨脂二氢黄酮（批号15031022，质量分数98%）、补骨脂二氢黄酮甲醚（批号15031023，质量分数98%）、补骨脂定（批号15021831，质量分数97%）、补骨脂酚（批号15031024，质量分数97%）购自同田生物有限公司。

流动相为乙腈-水，梯度洗脱：0～3 min，35%乙腈；3～3.5 min，35～45%乙腈；3.5～8 min，45%乙腈；8～13 min，45%～90%乙腈；13～15 min，90%～35%乙腈；体积流量1 mL/min，检测波长250 nm，柱温30 ℃，进样量4 μL。

分别精密称取补骨脂素（2.07 mg）、异补骨脂素（2.08 mg）、补骨脂定（1.21 mg）、补骨脂二氢黄酮甲醚（1.02 mg）、补骨脂二氢黄酮（1.58 mg）、异补骨脂二氢黄酮（0.97 mg）、异补骨脂查耳酮（1.10 mg）、补骨脂宁（1.03 mg）、新补骨脂异黄酮（1.00 mg）、补骨脂酚（2.75 mg），置同一个10 mL棕色量瓶中，加甲醇溶解，并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液，于4 ℃条件下保存，备用。

取补骨脂生品，分别加盐水拌匀，闷润4 h^[5]，置炒炙容器中，以文火（130±20）℃加热，分别炒制0、2.5、4.5、6.5、8.5、10.5、12.5 min，取出，放凉，至40 ℃减压干燥箱中连续干燥24 h，测定含水量，备用。每100千克补骨脂用食盐2 kg。

取上述补骨脂粉末（过3号筛）约0.5 g，精密称定，置索氏提取器中，加甲醇70 mL，加热回流2 h，放冷，提取液移至100 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液置离心管中，于4 ℃条件下保存，备用^[1]。

取“2.2”项下的混合对照品储备液1 mL，置2 mL（2号）、5 mL（3号）、10 mL（4号）、50 mL（5号）、100 mL（6号）量瓶中，用甲醇稀释至刻度，得系列混合对照品溶液，测定峰面积。以质量浓度为横坐标（X）、峰面积积分值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程，结果见表 1，色谱图见图 1。

表 1(Table 1)

表 1 10种成分的线性回归方程 Table 1 Linear regression equations of 10 components 对照品 标准曲线 r 线性范围/(μg∙mL-1) 补骨脂素 Y＝26 554 X＋13 109 0.999 3 2.07～207.00 异补骨脂素 Y＝28 742 X＋9 518 0.999 3 2.08～208.00 异补骨脂二氢黄酮 Y＝1 219 X－826 0.998 4 0.97～ 97.00 新补骨脂异黄酮 Y＝17 700 X－7 062 0.998 2 1.00～100.00 补骨脂二氢黄酮 Y＝5 477 X＋292 0.999 0 1.58～158.00 补骨脂宁 Y＝31 986 X－19 053 0.998 6 1.03～103.00 补骨脂定 Y＝10 270 X－11 070 0.998 9 1.21～121.00 异补骨脂查耳酮 Y＝6 938 X－4 599 0.997 7 1.10～110.00 补骨脂二氢黄酮甲醚 Y＝4 754 X－1 005 0.999 1 1.02～102.00 补骨脂酚 Y＝4 621 X＋24 947 0.998 4 2.36～236.00

表 1 10种成分的线性回归方程 Table 1 Linear regression equations of 10 components

1-补骨脂素 2-异补骨脂素 3-异补骨脂二氢黄酮 4-新补骨脂异黄酮 5-补骨脂二氢黄酮 6-补骨脂宁 7-补骨脂定 8-异补骨脂查耳酮 9-补骨脂二氢黄酮甲醚 10-补骨脂酚 1-psoralen 2-isopsoralen 3-isobavaenin 4-neobavaisoflavone 5-corylifolin 6-corylin 7-psoralidin 8-isobavachalcone 9-bavachinin 10-bakuchiol 图 1 混合对照品溶液 (A) 和供试品溶液 (B) UPLC图谱 Fig.1 UPLC chromatograms of mixed reference substance (A) and test sample (B)

4号混合对照品溶液连续进样6次，记录补骨脂中所测成分的峰面积积分值，计算得补骨脂中补骨脂素、异补骨脂素、异补骨脂二氢黄酮、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮、补骨脂宁、补骨脂定、异补骨脂查耳酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂酚质量分数的RSD值分别为1.48%、1.81%、1.65%、2.34%、1.74%、2.48%、2.95%、1.90%、2.02%、0.48%。

取称取同一炮制品（炒4.5 min）溶液分别在0、2、4、6、8、10、24 h进样，按照“2.1”项分别测定各指标成分的峰面积，各成分峰面积的RSD值均＜2.0%。

称取同一炮制品（炒4.5 min）6份，按“2.3”项制备供试品溶液，按照“2.1”项测定并计算各指标成分质量分数，各成分峰面积的RSD值均＜2.5%。

分别称取同一炮制品（炒4.5 min）（过3号筛）0.5 g，精密称定，分别精密加入同等质量的各对照品，按“2.3”项制备供试品溶液，按“2.1”项中色谱条件考察结果，同时测定补骨脂中补骨脂素、异补骨脂素、异补骨脂二氢黄酮、新补骨脂异黄酮、补骨脂二氢黄酮、补骨脂宁、补骨脂定、异补骨脂查耳酮、补骨脂二氢黄酮甲醚、补骨脂酚的量，计算回收率。结果平均回收率分别为97.6%、99.4.0%、96.2%、104.3%、101.5%、101.1%、96.4%、102.3%、103.2%、103.7%，RSD分别为1.24%、0.97%、0.58%、2.11%、1.56%、1.18%、0.94%、2.25%、2.31%、1.09%。各成分的加样回收率在96%～105%，RSD值＜3%。

用上述方法测定不同炮制时间补骨脂中的10种成分的峰面积，以干燥品计质量分数。色谱图见图 1，各成分质量分数见表 2，补骨脂中香豆素类、黄酮类、补骨脂酚及10种成分总量变化曲线见图 2。

图 2 不同炮制时间下补骨脂中香豆素类、黄酮类 (A) 和补骨脂酚及各成分总量 (B) 变化曲线 Fig.2 Change curves of coumarins and flavones (A),bakuchiol and total components (B) in Psoralea Fructus by different processing time

表 2(Table 2)

表 2 不同泡制时间补骨脂中10种成分的质量分数 (n = 3) Table 2 Determination of 10 components in Psoralea Fructus with salt solution by different processing time (n = 3) 炮制时间/min 质量分数/% 补骨脂素 异补骨脂素 异补骨脂二氢黄酮 新补骨脂异黄酮 补骨脂二氢黄酮 补骨脂宁 补骨脂定 异补骨脂查耳酮 补骨脂二氢黄酮甲醚 补骨脂酚 0 0.63 0.63 0.22 0.42 0.20 0.09 0.38 0.40 0.63 9.12 2.5 0.55 0.57 0.26 0.42 0.22 0.10 0.41 0.40 0.62 8.51 4.5 0.56 0.55 0.11 0.4 0.19 0.09 0.39 0.38 0.57 8.50 6.5 0.56 0.53 0.13 0.39 0.17 0.09 0.38 0.35 0.53 8.15 8.5 0.62 0.54 0.16 0.42 0.15 0.10 0.43 0.34 0.47 8.13 10.5 0.78 0.62 0.22 0.41 0.13 0.10 0.42 0.30 0.43 8.21 12.5 0.70 0.56 0.24 0.38 0.10 0.09 0.39 0.27 0.39 7.42

表 2 不同泡制时间补骨脂中10种成分的质量分数 (n = 3) Table 2 Determination of 10 components in Psoralea Fructus with salt solution by different processing time (n = 3)

根据所测定10种化学成分的性质，本实验考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-冰醋酸、乙腈-磷酸水溶液等流动相系统，结果显示甲醇-水系统柱压变化较大，基线漂移，流动相加酸后对色谱峰的分离效应以及峰型影响不大，故采用乙腈-水溶液作为梯度洗脱流动相，并优化流动相比例，使10种化学成分色谱峰在15 min内分离度、对称性和理论塔板数均符合要求。

本实验中补骨脂中香豆素类成分量（以干燥品计）变化较为明显：炒制0～6.5 min质量分数逐渐减少，6.5～10.5 min质量分数增加，10.5～12.5 min质量分数又有所降低，呈现“先降后升再降”的趋势，该研究结果与杨滨等^[8]的研究结果有相似之处。前期他人研究认为：补骨脂炮制后种皮破裂，更易溶出，黄酮和补骨脂酚量升高^[4]。本实验在制备供试品溶液时采用补骨脂粉末提取，消除了种皮破裂对成分含量的影响。结果显示，黄酮类、补骨脂酚成分随着炒制时间的增加，质量分数逐渐降低，这种下降趋势特别是油脂类成分量降低，是否与补骨脂盐炙后“缓和燥性”有关，还需要确证。综合分析香豆素类、黄酮类成分量之和，也呈现与香豆素类成分相似的“先降后升再降”的趋势。

整体而言，随着炒制时间的延长，指标成分含量最终总体呈现下降趋势，提示随着加热时间的延长和程度的加深，补骨脂中化学成分会受到破坏。值得注意的是，香豆素类、香豆素＋黄酮类成分在炒制一定时间内其量上升，可能原因是加热促进了补骨脂中香豆素糖苷类成分与香豆素类成分互相转化；此外，黄酮类成分与香豆素类成分结构有相似之处，黄酮类成分加热后是否可以先生成其他物质，在进一步加热炒制逐渐生成香豆素类成分，还有待确证。另外，这种化学成分的变化趋势与补骨脂盐炙后可以引药入肾，即增强补肾助阳、纳气止泻作用^[6]有何联系也需要进一步研究。

从本实验研究结果看，如仅考虑化学成分量高低，补骨脂“文火炒干”即可（本实验中炒制8.5 min及之后样品含水量低于9%），时间太短含水量较高，太长成分损失较大。这与炙法药物一般应“文火炒干”^[9]，以利于储存和保存药效的观点一致。