2017, Vol. 48
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2017.04.014 |
2. 江苏省中药高效给药系统工程技术研究中心, 江苏 南京 210023;
3. 南京市中药微丸产业化工程技术研究中心, 江苏 南京 210023;
4. 雷允上药业有限公司, 江苏 苏州 215009
2. Jiangsu Engineering Research Center for Efficient Delivery System of TCM, Nanjing 210023, China;
3. Nanjing Engineering and Technology Research Center for TCM Pellets, Nanjing 210023, China;
4. Suzhou Leiyunshang Pharmaceutical Co. Limited, Suzhou 215009, China
六神丸由麝香、蟾酥、雄黄等6味药组成，具清凉解毒、消炎止痛等功效，常用于烂喉丹痧、咽喉肿痛[1]、单双乳蛾、小儿热疖等病症。其中蟾酥Bufonis Venenum为蟾蜍科蟾蜍属动物中华大蟾蜍Bufo bufo gargarizans Cantor或黑眶蟾蜍B. melanostictus Schneider的干燥分泌物，其主要活性成分为蟾蜍二烯内酯类化合物[2-3]，具有显著的洋地黄样作用，能够升压、兴奋呼吸和抗肿瘤[3-6]。蟾蜍二烯内酯类亦含一定心脏毒性，可引起心律失常、心功能障碍等[7-10]。因此，六神丸中蟾蜍二烯内酯类成分的定量测定对于六神丸质量控制具有重要的意义[11]。
文献报道中蟾酥的定量测定采用的方法有紫外分光光度法[12]、薄层色谱法[13]、二阶导数光谱法[14]、HPLC法[15-16]等，未见HPLC法对和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵等9种蟾酥二烯内酯类化合物同时测定的报道。因此，本研究建立HPLC-MS法同时测定该9种蟾蜍二烯内酯类化合物量的方法，为六神丸的质量控制提供参考。
1 仪器与材料 1.1 仪器与设备高效液相色谱系统，美国Waters e2695，包括在线脱气机，自动进样器Prominence SIL-20A，2998紫外可见光检测器和柱温箱CTO-20A；Q-TOF5600质谱仪，配电喷雾离子源(ESI)，美国AB公司；汉邦ODS-2(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱；Anke TGL-16C高速离心机，上海安亭科学仪器厂；FA1204B电子分析天平，上海精密科学有限公司；CPA225D电子天平，德国Sartorius公司；Milli-Q Synthesis 108超纯水仪，美国密理博公司；KQ-500DE超声机，昆山市超声仪器有限公司。
1.2 试剂与试药乙腈，色谱纯，美国TEDIA试剂公司；甲醇，色谱纯，江苏汉邦科技有限公司；重蒸水，由Milli-Q Synthesis 108超纯水仪制得；和蟾蜍他灵(gamabufotalin，批号465-11-2)、沙蟾毒精(arenobufagin，批号464-74-4)、远华蟾毒精(telocinobufagin，批号472-26-4)、去乙酰华蟾毒它灵(desacetylcinobufotalin，批号4099-30-3)、蟾毒它灵(bufotalin，批号471-95-4)、华蟾毒它灵(cinobufotalin，批号1108-68-5)、蟾毒灵(bufalin，批号11981-201501)对照品均购自宝鸡市辰光生物科技有限公司，经面积归一化法测定，质量分数均大于98.0%；华蟾酥毒基(cinobufagin，批号110803-201406，供定量测定用，质量分数99.6%)、脂蟾毒配基(resibufogenin，批号110718-201108，供定量测定用，质量分数98.9%)购自中国食品药品检定研究院。
1.3 样品六神丸，雷允上药业有限公司，批号分别为NA18003A、NA18008B、NA18018A、NA18021B、OA18019A、OA10005B、OA18025B、OA18009C、OA18004B、LA18012C。缺蟾酥阴性制剂(1批)由上海雷允上药业有限公司提供。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱为ODS-2(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，流动相为乙腈-0.15%磷酸水溶液，梯度洗脱：0～15 min，20%～25%乙腈；15～25 min，25%～40%乙腈；25～35min，40%乙腈；35～37 min，40%～55%乙腈；37～45 min，55%乙腈；45～47 min，55%～100%乙腈；47～52 min，100%乙腈；52～54 min，100%～20%乙腈；54～55 min，20%乙腈；体积流量1 mL/min；检测波长296 nm；柱温40 ℃；进样量10 μL。对照品、六神丸样品与阴性样品的HPLC色谱图见图 1。
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1-和蟾蜍他灵 2-沙蟾毒精 3-远华蟾毒精 4-去乙酰华蟾毒它灵 5-蟾毒它灵 6-华蟾毒它灵 7-蟾毒灵 8-华蟾酥毒基 9-酯蟾毒配基，图 2同 1-gamabufotalin 2-arenobufagin 3-telocinobufagin 4-desacetyl- cinobufotalin 5-bufotalin 6-cinobufotalin 7-bufalin 8-cinobufagin 9-resibufogenin,same as Fig. 2 图 1 对照品溶液 (A)、六神丸供试品溶液 (B)、阴性样品溶液 (C) 的HPLC Fig.1 HPLC of mixed reference solution (A),sample solution of Liushen Pill (B),and negative sample solution without toad venom (C) |
2.2 HPLC-MS条件
HPLC-MS联用的色谱条件与“2.1”项HPLC分离基本条件一致，流动相为乙腈-0.2%甲酸水溶液，梯度洗脱。ESI离子源，正离子模式；扫描范围m/z：50～1 500；喷雾电压(IS)：5 500 V；去簇电压(DP)：100 V；碰撞能量(CE)：35 V；辅助加热温度550 ℃；雾化器压强379 kPa；辅助加热气压强379 kPa；气帘气压强241 kPa。实验数据采用PeakView 1.2软件处理。对照品、样品总离子流图见图 2。蟾蜍二烯内酯类化合物的鉴定结果见表 1和2。
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图 2 混合对照品溶液 (A) 和六神丸供试品溶液 (B) 的总离子流图 Fig.2 HPLC-MS total ion chromatograms of mixed reference solution (A) and test sample solution of Liushen Pill (B) |
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表 1 9种蟾蜍二烯内酯类化合物对照品HPLC-MS鉴定结果 Table 1 Identification results of nine bufadienolides in reference solution by HPLC-MS |
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表 2 六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类化合物HPLC-MS鉴定结果 Table 2 Identification results of nine bufadienolides in Liushen Pill by HPLC-MS |
2.3 对照品溶液的制备
分别取和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基对照品适量，精密称定，以甲醇溶解并定容，制成质量浓度分别为蟾毒配基70.39 μg/mL、沙蟾毒精257.78 μg/mL、远华蟾毒精261.89 μg/mL、去乙酰华蟾毒它灵42.96 μg/mL、蟾毒它灵214.73 μg/mL、华蟾毒它灵366.44 μg/mL、蟾毒灵241.56 μg/mL、华蟾酥毒基468.11 μg/mL、脂蟾毒配基331.56 μg/mL的混合对照品储备液。
2.4 供试品溶液的制备取六神丸粉末约0.2 g，精密称定，精密加入甲醇10 mL，密塞，称定质量，超声(工作频率50 kHz，功率250 W)处理60 min，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，离心，取上清液进样分析。
2.5 阴性供试品溶液的制备取缺蟾酥的阴性样品，按供试品溶液制备法制备，进样测定。
2.6 线性关系考察精密吸取“2.3”项下对照品储备液，依次稀释2、4、8、16、32、64倍，制备包括母液在内的7份溶液。分别精密吸取系列质量浓度的混合对照品溶液10 μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程见表 3。
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表 3 蟾蜍二烯内酯类成分的回归方程 Table 3 Regression equations with correlation coefficients of nine bufadienolides |
2.7 检测限和定量限
在选定的色谱条件下，当信噪比为3时，测得和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的检测限分别为2.7、2.1、5.1、1.7、4.2、7.2、4.7、9.1、13.0 ng；当信噪比为10时，测得和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的检测限分别为11.0、8.5、10.2、3.4、8.4、14.3、9.4、36.6、25.9 ng。
2.8 精密度试验按照“2.1”项下色谱条件，分别取对照品溶液10 μL，重复进样6次，和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面积的RSD分别为1.36%、1.25%、1.44%、1.07%、1.08%、1.21%、1.20%、1.16%、1.11%，RSD均＜3%，结果表明仪器精密度良好。
2.9 稳定性试验取六神丸样品溶液，按“2.1”项色谱条件，在0、2、4、8、10、12、16、24 h进样10 μL，六神丸中和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基峰面积的RSD分别为1.70%、1.60%、1.80%、2.37%、1.83%、1.87%、1.93%、1.71%、1.75%，RSD均＜3%，结果表明六神丸溶液在 24 h内稳定。
2.10 重复性试验取同一批六神丸样品，按供试品溶液的制备方法制备6份，分别进样10 μL，六神丸中和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基质量分数的RSD分别为2.06%、2.28%、2.47%、2.09%、2.44%、2.36%、2.47%、2.45%、2.45%，RSD均＜3%，结果表明方法重复性良好。
2.11 回收率试验精密称取同一批蟾六神丸样品各6份，分别准确加入一定量的蟾酥二烯内酯类化合物，按供试品溶液的制备方法处理后，按“2.1”项色谱条件测定，计算回收率及RSD，结果和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基的平均回收率分别为101.7%、101.1%、97.7%、98.8%、98.2%、96.6%、99.4%、97.5%、95.9%，RSD分别为3.81%、3.81%、2.81%、3.40%、3.54%、3.88%、4.02%、3.77%、4.21%。
2.12 样品测定取六神丸按“2.4”项方法制成供试品溶液，按“2.1”项色谱条件进样分析，根据线性回归方程计算9种蟾蜍二烯内酯类成分的质量分数见表 4。
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表 4 六神丸中9种蟾蜍二烯内酯类成分的质量分数 (n = 3) Table 4 Contents of nine bufadienolides in toad venom and Liushen Pill (n = 3) |
定量测定结果表明，不同批次样品中9种蟾蜍二烯内酯类化合物的质量分数存在一定的差异，这可能与原药材的选取差异有关，这也与文献报道的不同产地蟾酥所含成分的种类和质量分数差异较大相一致[17-18]。
3 讨论取适量9种对照品以甲醇溶解，并稀释至适当质量浓度，经紫外光谱扫描测定，发现各对照品在296 nm处均接近最大吸收，故选择296 nm作为测定波长。
本实验对提取方法(超声提取、回流提取)、提取溶剂(甲醇、90%甲醇、80%甲醇、70%甲醇、乙醇)、超声时间(30、60、90、120 min)、料液比等单因素进行考察，筛选以甲醇作为六神丸的提取溶剂，料液比为1∶50，50 kHz频率下超声60 min，提取率最高。
本实验采用HPLC方法，同时测定六神丸中和蟾蜍他灵、沙蟾毒精、远华蟾毒精、去乙酰华蟾毒它灵、蟾毒它灵、华蟾毒它灵、蟾毒灵、华蟾酥毒基、脂蟾毒配基量，通过对方法学考察，结果表明，所建立的检测方法精密度、稳定性、重复性良好，加样回收率试验结果符合定量分析的要求，方法简便易行，可为六神丸质量标准的建立和完善提供科学依据。
蟾蜍二烯内酯类化合物具有显著的洋地黄样作用、升压、呼吸兴奋和抗肿瘤作用[19]，亦含一定心脏毒性，可引起心律失常、心功能障碍等。应用中要注意其有效剂量和安全范围，相关的药动学、毒理学和中毒机制等是进一步研究的方向。
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