2017, Vol. 48
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2017.04.012 |
2. 新疆医科大学公共卫生学院, 新疆 乌鲁木齐 830011;
3. 新疆医科大学 中心实验室, 新疆 乌鲁木齐 830011
2. School of Public Health, Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China;
3. Central Laboratory of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China
氧化槐果碱(oxysophocarpine，OSC)为苦豆子Sophora alopecuroides L. 种子中提取分离的生物碱[1-2]。近年研究证明，OSC能升高白细胞数、增强机体免疫力，从而起到抗痢疾杆菌、皮肤真菌、阿米巴原虫、滴虫等感染的作用，并有利尿、平喘、抗心律失常等作用[3]。苦豆子含有20余种喹诺里西啶(quinlizidine)类生物碱[4-6]，OSC的量较高，在一定条件下可与槐果碱相互转化[7]。
提取OSC的传统方法[8-14]有离子交换萃取法、溶剂萃取法、回流法和水蒸气蒸馏法等。现代方法有超临界流体萃取法、连续逆流液液萃取法、超声提取法[15-18]等。膜萃取为近年来发展迅速的一种萃取方法，包括支撑液膜萃取、微乳液膜萃取、中空纤维膜萃取[19-22]。逆三相膜循环分离萃取是中空纤维膜萃取的分支[23]，膜分离萃取和溶剂萃取过程具有较多相似之处，萃取原理基本相同，都由萃取与反萃取2步组成。但是，溶剂萃取中萃取与反萃取是分步进行的，之间的耦合是通过外部设备(循环泵与管线等)实现的，液膜过程的萃取与反萃取则分别发生在膜的两侧界面。而逆三相膜循环萃取分离[24-26]利用聚四氟乙烯膜固定酸碱相界面，酸相和碱相分别在膜的两侧搅拌，有机相在循环泵的作用下在酸碱相之间不停地循环。逆三相膜循环分离萃取与其他方法相比，具有溶剂消耗量低、萃取时间短、成本低、操作简单等优势。
为保证提取物的纯度，本实验利用紫外-可见分光光度法对OSC进行了理化鉴别和定量测定，并采用HPLC法[27-29]测定萃取后OSC的质量分数，为建立萃取物质量标准提供依据。为了提高OSC的萃取率，本实验以OSC的提取率为指标，考察逆三相膜循环萃取提取工艺，采用L16(45) 正交试验对OSC的提取工艺进行探讨，从而确定最佳提取工艺。
1 仪器与试药Agilent 1200-DAD高效液相色谱仪，安捷伦科技公司，包括DAD-G1315C检测器、G1312B脱气机、G1367C自动进样器、G1316B-TCC/SL柱温箱、G1322A二元输液泵；Shim-pack VP-ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；UV-2550紫外-可见分光光度计、PRR-2A循环泵，日本岛津公司；JJ-1增力电动搅拌器，金坛市医疗机械厂；KQ-250B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；聚四氟乙烯膜，PTFE膜(聚四氟乙烯膜，是一种膜材料，膜的一种类型)，厚度1.2 μm，九江奥泰橡塑有限公司；分液漏斗；三口瓶。
对照品OSC，批号JZ20140508，质量分数99%，购自南京景生物科技有限公司；苦豆子药材采自新疆吐鲁番市鄯善县鲁克沁乡，经新疆医科大学药学院帕丽达教授鉴定为豆科槐属植物苦豆子Sophora alopecuroides L. 的干燥成熟种子；氢氧化钠，天津永晟精细化工有限公司；硫酸，西安化学试剂厂；盐酸、硝酸，四川西陇化工有限公司；磷酸，天津市盛奥化学试剂有限公司；氯仿、石油醚、正丁醇、醋酸乙酯、冰乙酸，均为分析纯；甲醇，色谱纯；实验用水为2次蒸馏水。
2 方法与结果 2.1 提取物中OSC的定量测定 2.1.1 色谱条件Shim-pack VP-ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-0.2%磷酸水溶液(7∶93)，梯度洗脱，体积流量1 mg/mL，进样量5 μL，柱温30 ℃，检测波长221 nm。OSC提取液、OSC对照品溶液和苦豆子供试品溶液的色谱图见图 1。
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图 1 空白 (A)、苦豆子供试品 (B)、OSC对照品 (C) 和OSC提取液 (D) 的HPLC Fig.1 HPLC of blank (A),S. alopecuroides samples (B),oxysophocarpine reference substance (C),and oxysophocarpine extracts (D) |
2.1.2 对照品溶液的制备
精密称取OSC对照品50 mg，0.5 mol/L氢氧化钠水溶液溶解后移入50 mL量瓶内，定容至刻度，摇匀，制成1 mg/mL的对照品溶液，备用。
2.1.3 OSC提取物溶液的制备取苦豆子种子粉末(过40目筛，孔径0.4 mm)0.2 g，置于250 mL三口瓶中，加入0.3 mol/L盐酸水溶液75 mL和氯仿75 mL，在碱相放氢氧化钠溶液75 mL和氯仿75 mL搅拌循环60 min。精密移取提取液，滤过，取续滤液作为OSC提取物的供试品溶液。
2.1.4 苦豆子供试品溶液的制备苦豆子粉碎(过40目筛)，称取1 g，加甲醇10 mL，称定质量，超声提取30 min，补足减失的质量，上清液过0.45 μm膜，即为苦豆子供试品溶液。
2.1.5 线性关系考察精密量取OSC对照品溶液0.05、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50 mL，分别置于5 mL棕色量瓶中，以未加OSC为空白对照，以峰面积值为纵坐标(Y)，质量浓度为横坐标(X)，得线性回归方程为Y＝1 610.90 X－190.06，r＝0.997 8，结果表明OSC在0.01～0.7 mg/mL线性关系良好。
2.1.6 精密度试验精密配制0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg/L对照品溶液，每个样品重复进样6次，测得吸光度(A)值，计算RSD为0.93%，表明仪器精密度良好。
2.1.7 稳定性试验精密吸取OSC提取物溶液(-4 ℃保存)，分别在0、2、4、6、8、9 h进样分析，分别测定色谱峰峰面积。计算RSD为0.88%，表明OSC在9 h内稳定性良好。
2.1.8 重复性试验称取同一批苦豆子药材3份，按“2.1.3”项下方法制备OSC提取物溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，记录HPLC色谱图，测得OSC平均RSD为1.88%，表明方法重复性良好。
2.1.9 回收率试验精密称取苦豆子种子粉末1.00 g(40目)，按“2.1.3”项下制备OSC提取物溶液，分别精密加入0.05、0.1、0.3 mg/mL的对照品溶液。按“2.1.1”项下色谱条件进样测定，计算平均回收率为97.47%，RSD为1.95%。
2.2 逆三相膜循环萃取分离OSC的理论分析OSC由于分子结构中氮原子上有1对未共用电子，并且处于并合环之间，立体效应的影响比较小，所以碱性较强，在植物内以盐的形式存在。在酸相中OSC和其他成分都被盐酸萃取出来。在酸相中分子状态的OSC和H+接触时，OSC给出1个OH-而变成游离状态的OSC，见图 2。
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图 2 >OSC和酸相中H+的化学反应OSC和酸相中H+的化学反应 Fig.2 Reaction of OSC with H+ in acid phase |
OSC中N原子的未对称电子和氯仿中的H+形成氢键，OSC在氯仿中溶解度增加，促进游离态OSC从酸相转移到有机相。萃取OSC的同时也被萃取出来的蛋白质、果胶、纤维素和半纤维素类化合物不能通过PTFE膜，是因为PTFE膜只能通过分子，而不能通过离子。
氯仿在循环泵的作用下循环到碱相，接触碱相的OH-时，OSC和OH-发生缔合反应，反应速度快，而且离子状态的OSC不能通过PTFE膜，所以OSC在碱相中富集，见图 3。碱相中的氯仿在循环泵的作用下循环回酸相，在酸碱相中不停地循环而达到富集OSC的目的。
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图 3 OSC和碱相中OH-的化学反应 Fig.3 Reaction of OSC with OH- in acid phase |
2.3 逆三相PTFE膜循环萃取分离过程
在B瓶中加入OSC、盐酸溶液和75 mL氯仿的混合溶液。在A瓶中加入氢氧化钠溶液和氯仿各75 mL。A、B瓶同时搅拌5 min，使水相和氯仿充分混匀。将分离膜装置插入到A、B瓶中，开始同时搅拌并同步启动循环泵循环氯仿(体积流量6 mL/min)，OSC从B瓶中萃取到有机相，有机相通过分离膜和循环泵循环到A瓶。循环一定时间后，B瓶中OSC全部转移至A瓶，碱相中的氯仿在循环泵的作用下循环回到酸相，同时在酸碱相中OSC不停地循环萃取，A、B瓶达到新的萃取平衡。逆三相膜萃取系统示意图见图 4。
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A-碱相 B-酸相 S-PTFE膜 M-搅拌器 P-循环泵 A-alkali solution B-sulfuric acid solution S-PTFE membrane M-blender P-circulation pump 图 4 逆三相膜萃取系统 Fig.4 Inversephasemembrane extraction system |
2.4 单因素考察实验 2.4.1 水相和有机相体积比对OSC萃取率的影响
在B瓶中加入OSC、0.5 mol/L硫酸和氯仿的混合溶液。在A瓶中加入0.5 mol/L氢氧化钠溶液和氯仿的混合溶液。A、B瓶同时搅拌5 min，使水相和氯仿充分混匀，体积流量6 mL/min下循环35 min(考察循环时间之前，将循环时间设为35 min)。
水相和有机相体积比为0.5∶1、1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1、4∶1时，OSC的平均萃取率分别为36.65%、57.05%、52.56%、42.90%、41.19%、28.57%、20.49%(n＝3)。酸碱相和氯仿体积比0.5∶1时OSC提取率为37.97%。水相溶液越多，细胞内外的浓度差越大，传质推动力也越大，内扩散的速度也越大，有利于OSC的溶出。体积比增大到1∶1时萃取率达到57.05%，超过此比例后，OSC的萃取率逐渐下降，是由于水相溶液的增大导致杂质溶出量增多，而且有机相加入量过低，水相提取液不能与有机相充分接触，引起萃取物不能完全溶解。综合考虑各因素，将体积比1∶1作为萃取OSC的最佳实验条件。
2.4.2 酸相萃取剂在B瓶中加入OSC、不同的酸溶液和氯仿的混合溶液。在A瓶中加入0.5 mol/L氢氧化钠溶液和氯仿各75 mL。A、B瓶同时搅拌5 min，使水相和氯仿充分混匀，体积流量6 mL/min下循环35 min。0.50 mol/L盐酸、0.25 mol/L硫酸、0.50 mol/L硝酸溶液的平均萃取率分别为63.17%、57.48%、53.49%，结果见表 1。用0.50 mol/L盐酸时萃取率最高，因为0.50 mol/L盐酸对植物细胞的穿透能力强，更有利于生物碱的溶解。0.25 mol/L硫酸和0.50 mol/L硝酸的萃取率比盐酸低，可能因为硫酸、硝酸对植物细胞的穿透能力以及和OSC形成氢键的强弱不如盐酸强。所以将0.50 mol/L盐酸溶液作为最佳酸相萃取剂。
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表 1 酸相萃取剂种类对OSC萃取率的影响 (n = 3) Table 1 Effect of different stripping agents on extraction rate of OSC (n = 3) |
2.4.3 盐酸浓度
在B瓶中加入OSC、不同浓度的盐酸和氯仿的混合溶液。在A瓶中加入0.5 mol/L氢氧化钠溶液和氯仿各75 mL。A、B瓶同时搅拌5 min，使水相和氯仿充分混匀，体积流量6 mL/min下循环35 min。盐酸浓度为0.01、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50、0.60、0.70、0.80、0.90 mol/L时，OSC的平均萃取率分别为29.07%、42.13%、59.75%、72.95%、68.03%、60.11%、49.73%、42.84%、31.58%、20.28%(n＝3)。盐酸浓度在0.01～0.30 mol/L时，盐酸H+和生物碱变成游离状态的生物碱，增大了其在有机相中的溶解度，所以提取率较高，0.30 mol/L时萃取率为72.95%。随着盐酸浓度的继续增加，有机相和生物碱的结合能力不断减弱，OSC在酸相中的溶解度也不断降低。实际选定盐酸浓度在0.30 mol/L。
2.4.4 氢氧化钠浓度在B瓶中加入OSC、0.3 mol/L盐酸和氯仿的混合溶液。在A瓶中加入不同浓度氢氧化钠溶液和氯仿各75 mL。A、B瓶同时搅拌5 min，使水相和氯仿充分混匀，体积流量6 mL/min下循环35 min。OSC在碱相中的萃取率随着OH-浓度增加而增高，氢氧化钠浓度为0.125、0.25、0.5、0.75、1.0、1.25 mol/L时，平均萃取率分别为29.66%、44.68%、64.13%、84.29%、68.29%、51.66%。氢氧化钠浓度在0.75 mol/L时萃取率达到84.29%，OH-浓度再增加时，OSC趋向于成盐状态，在氯仿中的溶解度和萃取率逐渐降低，可能在0.75 mol/L时细胞内外生物碱已达平衡，如果继续增加OH-浓度，提取液中的生物碱浓度会降低，不利于后续分离操作。
2.4.5 循环时间在B瓶中加入OSC、0.30 mol/L盐酸和氯仿的混合溶液。在A瓶中加入0.75 mol/L氢氧化钠溶液和氯仿各75 mL。A、B瓶同时搅拌5 min，使水相和氯仿充分混匀，体积流量6 mL/min下循环一定时间。随提取时间的增加，生物碱的提取率逐渐增加，15、30、45、60、90、120 min的平均萃取率分别为51.83%、84.23%、93.89%、98.97%、97.04%、96.87%。60 min后生物碱的提取率趋于稳定，说明此时细胞内外生物碱已经达到溶解平衡，随提取时间的延长，其他杂质在提取液中的溶出量也会增加，为了减少提取液中其他杂质的溶出量，减轻后续分离工艺的负担，不宜继续延长提取时间，所以将提取时间确定为60 min。
2.5 正交试验优化提取工艺根据以上单因素试验结果，提取次数为3次，采用正交试验设计，选取盐酸浓度(A)、氢氧化钠浓度(B)、提取时间(C)、体积比(D)4个因素，设计每个因素选取4个水平，因素水平见表 2。以OSC萃取率为评价指标，采用L16(45) 正交试验表安排试验，并对试验结果进行单因素方差分析，结果见表 3。由直观分析可知，各因素对提取效果的影响为A＞B＞C＞D，以盐酸浓度影响最大。每个因素4个水平之间的趋势为A2＞A3＞A1＞A4、B3＞B4＞B2＞B1、C4＞C2＞C3＞C1、D1＞D4＞D2＞D3。经方差分析结果(表 6)可知，A、B因素对OSC的提取效果有极显著性影响(P＜0.01)，C和D因素对OSC的提取效果有显著性影响(P＜0.05)，因此，从大工业生产和降低成本、节省工时等方面综合考虑，确定最佳萃取工艺为A2B3C4D1，即盐酸浓度为0.30 mol/L、氢氧化钠浓度为0.75 mol/L、提取时间为60 min、体积比为1∶1。
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表 2 L16(45) 正交试验设计及结果 Table 2 Design and results of L16(45) orthogonal test |
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表 3 方差分析 Table 3 Analysis of variance |
为验证上述结果的正确性，保证提取工艺的合理可行，按上述最佳工艺条件，精密吸取“2.1.3”项下提取的OSC提取液，对优选的最佳工艺进行验证，照“2.1.1”项下色谱条件测定提取液中OSC的质量浓度，计算其萃取率。在最佳提取工艺条件下平行进行3组试验，结果OSC萃取率分别为97.41%、98.96%、98.26%，平均萃取率是98.21%。结果表明，该工艺稳定、合理、可靠，可为工业生产提供理论依据。
3 讨论本研究通过单因素试验考察了各提取因素对提取OSC的影响规律。通过正交设计试验得到OSC的最佳提取工艺为水相和有机相溶剂体积比1∶1、盐酸浓度0.30 mol/L、氢氧化钠浓度0.75 mol/L、提取时间为60 min、提取次数3次。按该条件验证试验3次，得到OSC平均萃取率为98.21%。综上所述，本研究优化的提取工艺设计合理，具有一定的重复性和重现性，可作为OSC提取的生产工艺。
在试验因素的考察上，本实验仅选择了盐酸浓度、氢氧化钠浓度和提取时间，尚有溶剂体积比、酸相萃取剂等因素可供选择，其完整的优化工艺有待进一步研究。
对OSC对照品溶液进行紫外扫描，溶剂不同，测出来的最大吸收波长也不同，根据逆三相膜循环萃取分离原理，用氢氧化钠溶液作为溶剂时得到的最大吸收波长215 nm，浓度0.50 mol/L时最大吸收波长为221 nm。为了能在尽量短的时间内获得指标成分的完全分离，本实验比较了甲醇-0.2%磷酸水溶液和甲醇-水的洗脱效果。结果表明使用甲醇-0.2%磷酸水溶液，样品峰可得到完全分离，且峰形良好。预试验发现OSC在实验过程中较不稳定，冰箱冷藏过夜后易变质，无法定量测定。因此，稳定性实验表明样品需在9 h内完成测定。
| [1] | 钱利武, 戴五好, 王丽丽, 等. 槐果碱及氧化槐果碱对小鼠的急性毒性[J]. 中国实验方剂学杂志, 2012, 18(13):256–258. |
| [2] | Zhou Y, Wei Y H, Liu H X, et al. Preparation and in vitro evaluation of ethosomal total alkaloids of Sophora alopecuroides loaded by a transmembrane pH-gradient method[J]. AAPS PharmSciTech, 2010, 11(3): 1350–1358. DOI:10.1208/s12249-010-9509-6 |
| [3] | 刘静. 苦豆子总碱提取与注射液制备及药效学研究[D]. 银川:宁夏大学, 2012. |
| [4] | 冷晓红, 陈海燕, 郭鸿雁, 等. 不同提取方法对苦豆子中氧化槐果碱与槐果碱含量的影响[J]. 西北药学杂志, 2013, 28(5):457–458. |
| [5] | 杨清娥, 张宏利, 韩崇选, 等. 氧化槐果碱的提取分离工艺及其毒性研究[J]. 西北林学院学报, 2006, 21(3):111–113. |
| [6] | 李莉, 张文学, 张顺利. 苦豆子生物碱的免疫调节作用及其作用机制研究进展[J]. 中草药, 2007, 38(4):附7–附8. |
| [7] | 余永婷. 苦豆子生物碱提取分离纯化及抑菌性研究[D]. 乌鲁木齐:新疆农业大学, 2007. |
| [8] | 秦学功. 苦豆子生物碱分离纯化与生物活性研究[D]. 天津:天津大学, 2002. |
| [9] | Rui G, Nannan C, Yan W, et al. Optimized extraction and molecular characterization of polysaccharides from Sophora alopecuroides seeds[J]. Int J Biol Macromol, 2016, 82(1): 231–242. |
| [10] | Chang A H, Zhen C, Zhi H W, et al. Extraction and isolation of alkaloids of Sophora Alopecuroides and their anti-tumor effects in H22 tumor-bearing mice[J]. Afr J Tradit Complem, 2014, 11(2): 245–248. |
| [11] | 李生虎, 张永康, 李勇. 苦豆子植物生物碱的提取及TLC分析[J]. 山东畜牧兽医, 2015, 36(6):12–14. |
| [12] | Lu X, Lin B, Tang J G, et al. Study on the inhibitory effect of total alkaliods of Sophora alopecuroides on osteosarcoma cell growth[J]. Afr J Tradit Complem, 2014, 11(1): 172–175. |
| [13] | Zheng K B, Li C H, Shan X S, et al. A study on isolation of chemical from Sophora flavescens Ait and their anti-glioma effects[J]. Afr J Tradit Complem, 2014, 11(1): 156–160. |
| [14] | Mousavi S H, Motaez M, Zamiri-Akhlaghi A, et al. In-vitro evaluation of cytotoxic and apoptogenic properties of Sophora pachycarpa[J]. Iran J Pharm Res, 2014, 13(2): 665–673. |
| [15] | 郭鸿雁, 冷晓红, 陈海燕, 等. 苦豆子籽总生物碱分离纯化工艺研究[J]. 西部中医药, 2015, 28(10):48–52. |
| [16] | 李军, 郝彩琴, 马小兰, 等. 正交试验法优化苦豆子总生物碱的超声提取工艺[J]. 中国民族民间医药, 2014, 24(8):24–27. |
| [17] | 余永婷. 超声波提取苦豆子生物碱的工艺研究[J]. 中国食品添加剂, 2008, 69(3):69–73. |
| [18] | Yu H G, Wang Z W, Wu Z C, et al. Dynamic membrane formation in anaerobic dynamic membrane bioreactors:role of extracellular polymeric substances[J]. PLoS One, 2015, 10(10): 17–23. |
| [19] | 刘涛, 伍利华, 李鹏程, 等. 清脑复神液精制工艺再评价研究[J]. 中草药, 2015, 46(16):2407–2412. |
| [20] | Björkegren S, Karimi R F, Martinelli A, et al. A new emulsion liquid membrane based on a palm oil for the extraction of heavy metals[J]. Membranes, 2015, 5(2): 168–179. DOI:10.3390/membranes5020168 |
| [21] | Stetter F W, Cwiklik L, Jungwirth P, et al. Single lipid extraction:the anchoring strength of cholesterol in liquid-ordered and liquid-disordered phases[J]. Biophys J, 2014, 107(5): 1167–1175. DOI:10.1016/j.bpj.2014.07.018 |
| [22] | 刘双双, 刘丽芳, 朱华旭, 等. 超滤膜技术用于脉络宁注射液废弃物中多糖分离及其活性筛选研究[J]. 中草药, 2016, 47(13):2288–2293. |
| [23] | 米尔扎提·麦麦提, 尔西丁·买买提, 喀日耶姆·艾海提, 等. 正交试验优化逆三相膜萃取烟碱的工艺研究[J]. 新疆医科大学学报, 2016, 39(11):1436–1439. |
| [24] | Brockmeyer B, Kraus U R, Theobald N. Accelerated solvent extraction (ASE) for purification and extraction of silicone passive samplers used for the monitoring of organic pollutants[J]. Environ Sci Pollut R, 2015, 22(24): 19887–19895. DOI:10.1007/s11356-015-5192-1 |
| [25] | Björkegren S, Karimi R F, Martinelli A, et al. A new emulsion liquid membrane based on a palm oil for the extraction of heavy metals[J]. Membranes, 2015, 5(2): 168–179. DOI:10.3390/membranes5020168 |
| [26] | Liu J, Li W J. Supported liquid membrane extraction technology and its application in detection of meat security[J]. Meat Res, 2010(7): 86–89. |
| [27] | 王晓萍, 石会丽, 李富贤, 等. HPLC法同时测定苦刺花中氧化槐果碱、槐果碱、氧化槐果碱和氧化氧化槐果碱的含量[J]. 陕西中医, 2014, 35(9):1247–1249. |
| [28] | 吴志娇, 赵红, 薛英, 等. HPLC法同时测定氧化槐果碱、槐定碱和氧化槐果碱水[J]. 中国科学院研究生院学报, 2011, 28(3):398–402. |
| [29] | 古丽娜·沙比尔, 阿吉艾克拜尔·艾萨, 石明辉, 等. HPLC同时测定苦豆子中槐定碱、氧化槐果碱和氧化氧化槐果碱的含量[J]. 中国中药杂志, 2007, 32(24):2619–2622. |