柽柳Tamarix chinensis Lour. 喜生于河流冲积平原、海滨、滩头、潮湿盐碱地和沙荒地。柽柳味甘、辛、性平，归肺、胃、心经，具有解热、镇痛^[1]、抗肿瘤^[2]和保肝^[3]之功效。主治风湿痹痛、麻疹不透^[4]，柽柳为温带及亚热带树种，产于中国甘肃、河北、河南、山东、湖北、安徽、江苏、浙江、福建、广东、云南等省区，黄河流域及沿海盐碱地多有栽培。前人的研究主要集中在柽柳药用价值^[5-6]、入侵能力和入侵特性^[7-10]。例如通过比较欧亚本地柽柳和美国入侵柽柳的PepC基因，Gaskin等^[11]发现柽柳的草本植物特性和种间杂交是柽柳作为入侵植物的原因之一。Cui等^[12]发现柽柳的株高和直径与土壤含盐量呈负相关。蒋志敏等^[13]和赵景奎等^[14]分别采用ISSR和RAPD分子标记技术对黄河三角洲柽柳居群的遗传多样性进行了分析，认为该地区柽柳遗传多样性主要来自种群内。秦皇岛市位于河北省东北部，东经118°33′～119°51′，北纬39°24′～40°37′。东北接辽宁省绥中县，西北临河北省承德市，西靠唐山市的滦县、迁安，南临渤海。秦皇岛市浅水湾作为柽柳的自然基因宝库，在维持自身的生态平衡以及植物资源的种质保护上都具有极其重要的价值。秦皇岛沿海地区存在大量的天然柽柳林，本课题组在秦皇岛发现了高9.6 m，直径22.4 cm的柽柳，但未见关于本地区居群柽柳遗传多样性的相关报道。鉴于此，本研究利用ISSR分子标记，对秦皇岛柽柳的遗传多样性和居群内的分化水平进行研究，其成果为深入了解秦皇岛柽柳种质资源和制定合理有效的湿地生态系统保护策略提供必要的理论依据。

本研究的柽柳试材共32份，由河北科技师范学院杨俊明教授鉴定。其中28份采自秦皇岛浅水湾地区海滨（从浅水湾到金屋浴场），以白花柽柳、松柏柽柳和刚毛柽柳为对照，中华柽柳采自河北科技师范学院，具体样品信息见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 供试32份柽柳品种 (系) 名称、编号和产地 Table 1 Names,codes,and places of 32 cultivars (strains) used in study 编号 品种（系） 采集地 1 密1 秦皇岛西南木栈道西 2 密2 秦皇岛西南木栈道西 3 密5 秦皇岛中段木栈道西 4 密6 秦皇岛东北木栈道西 5 密7 秦皇岛东北木栈道西 6 密0-1 秦皇岛西南木栈道东 7 密0-2 秦皇岛西南木栈道东 8 密0-3 秦皇岛西南木栈道东 9 密0-4 秦皇岛西南木栈道东 10 密0-5 秦皇岛西南木栈道东 11 密4-1 秦皇岛西南木栈道西 12 密4-2 秦皇岛西南木栈道西 13 密4-3 秦皇岛西南木栈道西 14 密4-4 秦皇岛西南木栈道西 15 密4-5 秦皇岛西南木栈道西 16 密4-6 秦皇岛西南木栈道西 17 密4-7 秦皇岛西南木栈道西 18 ·3 秦皇岛东北木栈道西 19 ·4 秦皇岛东北木栈道西 20 ·6 秦皇岛东北木栈道西 21 ·7 秦皇岛东北木栈道西 22 ·8 秦皇岛东北木栈道西 23 ·2-1 秦皇岛西南木栈道西 24 ·2-2 秦皇岛西南木栈道西 25 ·2-3 秦皇岛西南木栈道西 26 滨海翠 秦皇岛西南木栈道西 27 短3 秦皇岛西南木栈道西 28 金屋壮号 秦皇岛东北木栈道西 29 白花柽柳 新疆 30 松柏柽柳 山东 31 刚毛柽柳 新疆 32 中华柽柳 河北科技师范学院实验站

表 1 供试32份柽柳品种 (系) 名称、编号和产地 Table 1 Names,codes,and places of 32 cultivars (strains) used in study

采用高盐低pH值法提取DNA^[15]，用酶标仪检测A₂₆₀/A₂₈₀均在1.8左右，表明DNA提取纯度较高。

首先从加拿大British Columbia大学公布的100条引物中筛选出9条稳定性好、多态性丰富的引物（表 2），对32份柽柳材料进行扩增。引物、2xEs Taq MasterMix（含染料）以及2000DL DNA Marker均购自上海赛百盛基因技术有限公司。PCR反应体系为20 μL，2xEsTaq Master Mix 12.5 μL，100 μmol/L 引物1.0 μL，模板DNA 50 ng/mL 2 μL，RNase-Free Water 4.5 μL。扩增程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性1 min，每个引物在合适的退火温度（表 2）下退火1 min，72 ℃延伸10 min，30个循环，4 ℃保存。PCR扩增反应在美国Bio-Rad公司生产的T100型PCR扩增仪上进行，用琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

表 2(Table 2)

表 2 用于分析柽柳遗传多样性的ISSR引物及扩增结果 Table 2 ISSR primers used in analysis of genetic diversity of T. chinensis and their amplification results 引物编号 引物序列 退火温度/℃ 扩增条带数 多态性条带 数量 占比/% 810 GAGAGAGAGAGAGAGAT 52.0 16 16 100.00 811 GAGAGAGAGAGAGAGAC 46.9 12 12 100.00 818 CACACACACACACACAG 51.7 12 12 100.00 823 TCTCTCTCTCTCTCTCC 49.5 16 15 93.75 824 TCTCTCTCTCTCTCTCG 50.0 11 11 100.00 844 CTCTCTCTCTCTCTCTRC 49.1 14 13 92.86 873 GACAGACAGACAGACA 49.5 7 6 85.71 834 AGAGAGAGAGAGAGAGYT 50.8 15 14 93.33 880 GGAGAGGAGGAGGAGA 50.3 11 11 100.00 总数 — 114 110 — 平均 — 12.67 12.22 96.49

表 2 用于分析柽柳遗传多样性的ISSR引物及扩增结果 Table 2 ISSR primers used in analysis of genetic diversity of T. chinensis and their amplification results

根据PCR扩增产物的电泳结果，人工读带，在凝胶的某个相同迁移率位置上有DNA条带的记为“1”，无DNA条带的记为“0”，从而生成由“1”和“0”组成的原始矩阵。用POPGEN32软件进行显性分析与聚类分析^[16]。参照刘新龙等^[17]的方法构建32份柽柳的DNA指纹图谱。

根据Marker片段大小的对数值与电泳迁移距离绘制出DNA相对分子质量标准曲线图，然后用直尺量出每个扩增片段在胶板上的迁移距离，依据DNA相对分子质量标准曲线图计算出每个片段的相对分子质量。

9条引物共扩增出114个DNA位点，其中110个位点具有多态性，占总位点的96.49%，说明32份柽柳遗传多样性非常丰富。每条引物可以产生7～15个DNA扩增片段，平均每条引物可以产生12.67个扩增片段和12.22个多态性扩增片段。834引物在32份柽柳中的扩增图谱见图 1。

图 1 834引物在32份柽柳中的扩增图谱 Fig.1 ISSR amplification of 32 plant samples from T. chinensis using primer 834

由POPGEN32分析显示，32份柽柳的平均观察等位基因数1.982 5，平均有效等位基因数1.543 7，平均Nei’s基因多样性指数（H）0.320 2，平均Shannon信息指数（I）0.484 2，其中有效等位基因最大值为2.000 0，最小值为0，H最大值为0.500 0，最小值为0，I最大值为0.693 1，最小值为0。说明秦皇岛柽柳居群内个体遗传多样性十分丰富。

以32份柽柳和114个遗传位点的谱带数据为原始矩阵，基于遗传距离的聚类分析表明，在遗传距离28.79处将32份柽柳分成2大类（图 2），第1类包括的柽柳的编号分别是1～3、5～29、31～32，共30份柽柳。第2类是4和30号柽柳共2份柽柳。第1类在遗传距离26.47处再进一步分成2个亚类，第1个亚类的柽柳编号是1～3、5～29和32共29份柽柳；第2个亚类只有编号是31的刚毛柽柳。

图 2 32份柽柳的UPGMA聚类图 Fig.2 UPGMA dendrogram of 32 samples in T. chinensis

通过对32份柽柳材料的ISSR 扩增图谱分析，引物810对22号柽柳扩增出2 953 bp左右的特异性条带。引物818对11号柽柳扩增出238 bp左右的特异性条带。引物824对10号柽柳扩增出385 bp左右的特异性条带。这些特异性条带可以作为柽柳品种鉴定的分子依据。

通过对32份柽柳ISSR扩增图谱分析，从筛选出的9条引物中又挑选出引物834，其扩增出14个多态位点，除26号柽柳滨海翠与27号柽柳短3的指纹图谱一致外，其他柽柳的谱带都不相同。由此可见，引物834可以将31份柽柳全部区分开。从而建立了32份柽柳的分子指纹图谱（图 3）。

图 3 ISSR标记构建32份柽柳分子指纹图谱 Fig.3 Molecular fingerprint of 32 samples in T. chinensis set up by ISSR marker

在物种的进化中遗传多样性起着重要的作用。物种的适应性和新物种的出现依赖于丰富的遗传多样性。高水平的遗传多样性群体被认为是健康的适应性强的群体^[18]。本研究中9条ISSR引物共在32份柽柳中扩增出114个DNA位点，其中112个位点具有多态性，占总位点的96.49%，平均Nei’s 基因多样性指数0.320 3。其中，本研究中的多态性位点数（P）和Nei’s基因多样性指数（H）均略低于蒋志敏等^[13]用ISSR分析获得的P（98.2%）和H（0.406 1）；同时本研究的H与赵景奎^[14]用RPAD分析报道的柽柳种内H（0.313）基本一致。进一步说明柽柳的居群内遗传多样性非常丰富，同时也说明ISSR分子标记技术可以很好地用于柽柳居群内遗传多样性分析。

河北省秦皇岛市柽柳具有相对丰富的遗传多样性的原因：一方面与其多年生的习性有关。柽柳为两性花，既可同花授粉，又可异花授粉，极易发生居群内杂交，增大基因变异的概率，增大遗传多样性。另一方面与其复杂的交配体系有关。柽柳繁育系统为兼性异交^[19]，由于柽柳没有无融合生殖现象，虽然自交亲和，但缺乏自花传粉机制，必须通过传粉媒介（蝇类和蜜蜂等）为其授粉，这就大大增加了异交的机会，因此有可能提高柽柳遗传多样性的丰度。另外，近几年，秦皇岛沿海地区大量建筑的出现，也在一定程度上增加了柽柳居群内的异交机会。

目前，构建植物分子指纹图谱主要有特征谱带法^[20]、引物组合法^[21-23]和单引物方法^[24-25] 3种方式。本研究采用单引物法，利用1条重复性好的ISSR引物构建了32份柽柳的分子指纹图谱，为今后观赏柽柳资源鉴定提供了参考。然而，随着柽柳不断的异交，本研究中的ISSR引物可能会无法鉴别，此时应采用更多的多态性引物组合或筛选新的分子标记将其区分开，以补充和扩展本研究初步建立的柽柳DNA指纹图谱。

该研究中柽柳居群内的遗传多样性非常丰富。鉴于此，本地区应该采取就地保护政策，建立柽柳资源保护区，即以秦皇岛浅水湾为中心保护区，重视大范围群体内不同类型个体的保存，要尽量防止人为因素造成遗传资源的流失。