中草药  2017, Vol. 48 Issue (1): 179-184
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UPLC结合化学计量法对不同产地黄芪的快速鉴别
贺敬霞1,2, 牟倩倩1,2, 张建琪2,3, 田茜1, 何晨1, 尹蓉莉1, 李化2     
1. 成都中医药大学药学院, 四川 成都 611137;
2. 中国中医科学院中药研究所, 北京 100700;
3. 西华大学生物食品工程学院, 四川 成都 610039
摘要: 目的 建立UPLC-DAD法测定黄芪中4种黄酮类成分的测定方法,结合化学计量学方法快速鉴别黄芪的产地。 方法 采用UPLC法测定5个省份20批黄芪药材中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素4种黄酮类成分,运用聚类分析、主成分分析、判别分析方法综合分析不同产地黄芪质量。 结果 以毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素4种黄酮类成分的量为标准,进行聚类分析与主成分分析,两者结果一致,可将不同黄芪产地区分为3大类。判别分析进一步以Fisher判别函数的形式将内蒙古、四川、吉林产地较准确进行区分,甘肃与陕西的样品出现了误判,初始分组的正确率为85%。 结论 UPLC结合化学计量法可快速、准确鉴别黄芪产地,研究结果也可为不同产地黄芪的质量评价提供科学的依据。
关键词: 黄芪     黄酮     UPLC     聚类分析     主成分分析     判别分析     产地    
Rapid identification of Astragali Radix from different origins by UPLC combined with chemometrics methods
HE Jing-xia1,2, MOU Qian-qian1,2, ZHANG Jian-qi2,3, TIAN Qian1, HE Chen1, YIN Rong-li1, LI Hua2     
1. College of pharmacy Chengdu college of TCM, Chengdu 611137, China;
2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China;
3. Bio and Food Engineering of College, Xihua University, Sichuan, Chengdu 610039, China
Abstract: Objective To determine the contents of four flavonoids in Astragali Radix by UPLC-DAD method, and to rapidly identify their origins using chemometric method. Methods UPLC method was used for determining calycosin-7-O-β-D-glycoside, ononin, calycosin, and formononetin in 20 batches of Astragali Radix from five provinces. Three methods, such as clustering analysis, principal component analysis, and discriminant analysis were compared for comprehensive quality evaluation of Astragali Radix from different places. Results Origins of Astragali Radix were successfully divided into three categories by cluster analysis and principal component analysis, based on the contents of the tested flavonoids. Discriminant analysis could accurately distinguish some origins, such as the Inner Mongolia Autonomous Region and Sichuan and Jilin Provinces, while Shaanxi and Gansu Provinces appeared false classification. The correct rate of the initial group was 85%. Conclusion UPLC combined with chemometric method could be used for rapid and accurate identification of origins of Astragali Radix, which also provided the scientific basis for the quality evaluation of Astragali Radix from different origins.
Key words: Astragali Radix     flavonoids     UPLC     cluster analysis     principal component analysis     discriminant analysis     origins    

黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus mem-branaceus (Fisch.) Beg. var. mongholicus (Bge.) Hisao或膜荚黄芪Astragalus mem-branaceus (Fisch.) Beg.的干燥根,具有益气固表、利水消肿、托疮生肌等功效。黄芪含有皂苷、黄酮类与多糖类等多种活性成分[1-3]。研究表明黄酮类成分具有多种药理作用,如抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗炎等,已广泛运用于多种慢性疾病的治疗与研究中[4-5]。而黄芪中富含黄酮类成分,如毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、芒柄花素,目前黄芪中这4种成分的研究报道较多,且在黄芪质量评价方面,多选择这4种成分作为评价指标[6-8]

黄芪在我国分布较为广泛,中国大部分地区均有种植,主要产区有内蒙古、山西、甘肃、黑龙江等。大量的研究发现不同产地的黄芪质量参差不齐,如酸不溶性、水不溶性、灰分、浸出物、皂苷类、黄酮类等在量上存在一定的差异[9-11]。目前有关黄芪产地鉴别的研究报道较少,仅见汪祺等[12]应用液相指纹图谱结合聚类分析和主成分分析对黄芪产地进行鉴别。在中药材产地研究方面,常见化学计量方法包括系统聚类[13-14]、主成分分析[15-16]、判别分析[17-18],但尚未见到将3种方法综合应用于黄芪产地的鉴别。3种方法在应用中具有不同的作用,多种方法结合使用可互相弥补每种方法的不足之处,使研究结果更加全面、系统,更有说服力[19]。同时毛蕊异黄酮苷具有降血压、调血脂等作用[20],芒柄花苷具有促皮肤生长、增强免疫、抑制脂质过氧化等药理活性[21],毛蕊异黄酮具有促血管作用、肝损伤的保护作用、抗过敏等作用[22],芒柄花素具有抗菌、抗心律不齐、调血脂等活性。鉴于此,本研究收集了陕西、内蒙古、四川、甘肃、吉林5个省份的黄芪药材共20批,以黄芪中毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮苷作为指标成分,采用UPLC法建立4种黄酮类成分同时测定的方法,比较研究聚类分析法、主成分分析法、判别分析法在黄芪产地鉴别上的应用。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Waters ACQUITY H-Class UPLCTM超高效液相色谱仪(包括四元高压梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、真空脱气机、Empower II色谱工作站),十万分之一电子天平Startorious BT125D [赛多利斯科学仪器(北京)有限公司],Milli-Q型超纯水制备仪(法国Millipore公司),R115安迪生硬质红外线灯泡(海宁市照明电器有限公司),电子天平奥豪斯SPS 202F[梅特勒-托利多(常州)称重设备有限公司],高速万能粉碎机(FW80型天津市泰斯特仪器有限公司)。

1.2 试药

甲醇、乙腈均为色谱纯,其余试剂均为分析纯;超纯水由Milli-Q纯水机制备。刺芒柄花苷(批号15052010,质量分数99.14%),毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷(批号14110905,质量分数99.53%),芒柄花黄素(批号14091205,质量分数99.03%),毛蕊异黄酮(批号14121511,质量分数99.22%)购于成都曼斯特生物科技有限公司。20批黄芪药材分别收集于内蒙古、四川、甘肃、陕西、吉林5省区,由中国中医科学院中药资源中心袁媛研究员鉴定为蒙古黄芪Astragalus mem branaceus (Fisch.) Beg. var. mongholicus (Bge.) Hisao的干燥根,见表 1

表 1 样品信息 Table 1 Information of samples

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱:Aquity BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱,0~1 min,80%~77% A;1~3 min,77% A;3~5 min,77%~70% A;5~6.5 min,70% A;6.5~7 min,70%~80% A;体积流量0.4 mL/min;柱温45 ℃;检测波长250 nm;进样量1 μL。色谱见图 1

1-毛蕊异黄酮苷 2-芒柄花苷 3-毛蕊异黄酮 4-芒柄花素 1-calycosin-7-O-β-D-glycoside 2-ononin 3-calycosin 4-formononetin 图 1 黄芪样品(A)和对照品(B)溶液色谱图 Fig.1 HPLC chromatograms of AstragaliRadix (A) and reference substances (B)

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花素、芒柄花苷对照品适量,加甲醇配制成质量浓度分别为3.06、3.09、2.16、2.02 μg/mL对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取0.5 g黄芪粉末,置具塞平底圆形烧瓶中,加质量分数70%甲醇9 mL,称定质量,红外灯(200 W)提取9 min,快速降至室温,补足减失质量,滤过,滤液置25 mL量瓶中,少量多次洗涤残渣,加提取溶剂定容至刻度线,摇匀,过0.2 μm微孔滤膜,即得。

2.4 方法学考察 2.4.1 线性关系考察

分别精密称取适量毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮对照品加甲醇溶解,配制成含1.03 mg/mL毛蕊异黄酮苷、1.01 mg/mL芒柄花苷、1.08 mg/mL芒柄花素、1.02 mg/mL毛蕊异黄酮对照品母液。稀释对照品母液分别配制7个梯度质量浓度的对照品溶液,以峰面积为纵坐标(Y),浓度为横坐标(X),绘制标准曲线,见表 2

表 2 4种黄酮类成分线性关系考察结果 Table 2 Results of linear investigation of four flavonoids

2.4.2 精密度试验

分别取对照品芒柄花素(17.18、2.16、1.08 μg/mL)、芒柄花苷(24.24、2.02、1.01 μg/mL)、毛蕊异黄酮(16.32、3.06、1.02 μg/mL)、毛蕊异黄酮苷(17.28、3.09、1.03 μg/mL)高、中、低3个质量浓度对照品溶液以及供试品溶液,按“2.1”项色谱条件连续进样6次,测定对照品芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷峰面积,不同质量浓度对照品溶液峰面积的RSD均小于2%,供试品中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素峰面积的RSD分别为1.41%、2.87%、0.89%、2.19%。结果表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验

分别取对照品毛蕊异黄酮苷(17.28、3.09、1.03 μg/mL)、芒柄花苷(24.24、2.02、1.01 μg/mL)、毛蕊异黄酮(16.32、3.06、1.02 μg/mL)、芒柄花素(17.18、2.16、1.08 μg/mL)高、中、低3个质量浓度对照品溶液与供试品溶液,按“2.1”项色谱条件,分别考察日内稳定性(0、2、4、6、8、10、12、24 h)与日间稳定性(0、1、2、3 d)。结果显示,对照品溶液与样品溶液在24 h内与3 d内相对稳定(RSD均小于4%)。

2.4.4 重复性试验

取同一批供试品6份,精密称定,按“2.3”项方法制备供试品溶液,按“2.1”项色谱条件测定。测得样品中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素平均质量分数分别为0.104、0.048、0.144、0.108 mg/mL,其RSD分别为1.29%、1.83%、1.46%、2.28%。表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验

精密称取已测定的样品粉末6份,置具塞烧瓶中,分别精密加入芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷对照品溶液,按“2.3”制备方法制备供试品溶液,按“2.1”项色谱条件测定,结果显示,回收率均在95%~105%,RSD均小于3.5%。

2.5 样品测定

将20批不同产地的黄芪药材,分别按“2.3”项下制备供试品溶液,并按“2.1”项色谱条件下进行测定,见表 3

表 3 不同产地黄芪药材中4种黄酮类成分测定结果(n=3) Table 3 Results of four flavonoids in Astragali Radix in different cultivated regions (n=3)

2.6 数据处理 2.6.1 系统聚类分析

本实验采用SPSS 21.0软件中的组间法对样品进行系统聚类分析,欧式法计算样品间距离,将样品中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素4种成分的量导入分析。聚类结果见图 2,由图 2可以看出根据距离不同将各地区的药材划分为3大类,将8~11、16~20号(四川、吉林)划分为一大类;将3~7、12~15号(甘肃、陕西)划分为第二大类;将1~2号(内蒙古)划分为第三大类,且同一省份不同地区的药材样本分布相对集中。结合表 3分析,在含量方面,四川与吉林4种单一成分的量均较低,且差异较小,含量划分较为接近,故将这2个产地划分为一类;内蒙古产地成分量相比其他地区各单一成分量均较高,单独划分为一类;甘肃与陕西2个地区的成分相比四川与吉林成分量高,与内蒙古相比成分量稍低,且这2个地区的成分也较为接近,故划分为一大类。

图 2 不同产地黄芪药材系统聚类分析图 Fig.2 Cluster analysis of Astragali Radix

2.6.2 主成分分析

将黄芪中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素量导入SPSS 21.0软件,以特定的特征值与累计贡献率作为判定依据,对20批不同产地药材进行主成分分析。其中,主成分1与主成分2特征值分别为2.495、1.297,特征值均大于1,故含有2个主成分PC1与PC2,且方差贡献值分别为62.373%、32.424%。累计贡献值达94.796%,因此PC1与PC2 2个主成分可以反映黄芪的综合质量。由表 4因子载荷矩阵表知,PC1与毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素呈正相关;PC2与毛蕊异黄酮、芒柄花素呈正相关。分别以PC1与PC2建立坐标系,制作因子载荷矩阵散点平面图,见图 3,结合图 3可知主成分PC1与PC2将样品粗略聚为3类。将内蒙古地区聚为一类,将甘肃、陕西地区聚为一类,将吉林、四川聚为一类。

表 4 因子载荷矩阵表 Table 4 Load matrix table of factor

图 3 主成分分析散点图 Fig.3 Scatter plots of principal component analysis

与聚类分析结果相一致,在印证聚类分析的同时,同样可以得出PC1与PC2可用于黄芪产地划分。

根据得分系数矩阵结果得PC1、PC2及综合得分线性表达式,如下:

PC1=0.317 BX1+0.344 BX2+0.338 BX3+0.273 BX4

PC1=-0.450 BX1-0.382 BX2+0.364 BX3+0.539 BX4

BX1、BX2、BX3、BX4分别代表毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素的量

综合得分(F)=0.624×PC1+0.948×PC1

通过以上表达式得各地区的综合得分,并对得分结果进行排序,见表 3。得分情况反映各地区黄芪药材质量情况,质量越好,则分数越高。本研究中,甘肃地区药材得分最高,质量较好,而四川地区药材得分较低,其质量偏差。

2.6.3 判别分析

判别分析是一种统计判别和分组的手段。通常聚类分析与判别分析联合起来使用,通过聚类结果对样品进行分类,本研究将对每个地区进行分别判定,之后与聚类结果进行对比分析。通过聚类分析得不同产地黄酮指标成分的含量特征,主成分分析中毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮苷载荷量都较大,这4种成分可用于黄芪药材地区的判别,利用判别分析法对20批不同地区的药材进行判定,结合典型判别函数通过软件分析结果表明毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷Sig值分别为0.000、0.000,小于0.05,说明这2种成分在组间具有显著的差异。

通过将20批黄芪药材导入判别分析,得Fisher判别函数,如下:

内蒙古地区=1 203.817×毛蕊异黄酮苷量-276.16×芒柄花苷量-40.817×毛蕊异黄酮量+582.452×芒柄花素量-180.889

甘肃地区=457.816×毛蕊异黄酮苷量+578.902×芒柄花苷量-299.267×毛蕊异黄酮量+1 030.455×芒柄花素量-98.804

四川地区=109.083×毛蕊异黄酮苷量-135.979×芒柄花苷量-42.458×毛蕊异黄酮量-65.871×芒柄花素量-2.974

陕西地区=452.809×毛蕊异黄酮苷量+511.690×芒柄花苷量-271.062×毛蕊异黄酮量+931.778×芒柄花素量-85.291

吉林地区=489.323×毛蕊异黄酮苷量-447.323×芒柄花苷量+86.449×毛蕊异黄酮量-58.772×芒柄花素量-23.429

为验证该判断函数的正确性,SPSS 21.0软件内部提供了交互验证对函数进行判别。内蒙古、四川、吉林判定正确率为100%,甘肃、陕西出现误判,有5批出现错误,甘肃中有2批误判在陕西,陕西有3批误判在甘肃,说明了甘肃与陕西产药材中各成分量相近。典型判别函数散点图如图 4所示,内蒙古、四川、吉林重心相距较远,而甘肃与陕西的重心相近,进一步说明了甘肃与陕西2个地区量具有一定的相似性。通过软件分析结果表明不同地区的所有批次初始分组正确率为85%,交叉验证判别正确率为75%,说明判别函数基本稳定,可用于黄芪药材地区的判断。在聚类分析和主成分分析中,产地甘肃和产地陕西的黄芪样品也不能完全区分,也与判别分析的结果基本一致。

1-内蒙古 2-甘肃 3-四川 4-陕西 5-吉林 1-Inner Mongolia 2-Gansu 3-Sichuan 4-Shaanxi 5-Jilin 图 4 判别分析散点图 Fig.4 Scatter plots of discriminant analysis

3 讨论

本实验通过对20批黄芪样品研究,发现不同产地质量差异较大,内蒙古地区质量最好,陕西和甘肃质量次之,吉林和四川质量最差。原因可能受其生长环境影响,如温度、湿度、光照、土壤等因素。在研究时通常引入监督分类与非监督分类进行数据结果分析,监督分类通常指自主进行对样品选择,而非监督分类则是非自主选择样本,由机器进行分类。以上3种化学计量分析法中,判别分析为监督分类,聚类分析与主成分分析是非监督分类,通过比较聚类分析、主成分分析、判别分析在黄芪产地鉴别上的应用,3种化学计量学方法的结果基本一致。鉴于本研究中黄芪样本数较少,在后续研究中还需继续增加采集地区与样品批次,进一步完善黄芪产地鉴别研究,同时也为中药材产地鉴别研究提供研究参考。

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