2. 中国中医科学院中药研究所, 北京 100700;
3. 西华大学生物食品工程学院, 四川 成都 610039
2. Institute of Chinese Materia Medica, China Academy of Chinese Medical Sciences, Beijing 100700, China;
3. Bio and Food Engineering of College, Xihua University, Sichuan, Chengdu 610039, China
黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus mem-branaceus (Fisch.) Beg. var. mongholicus (Bge.) Hisao或膜荚黄芪Astragalus mem-branaceus (Fisch.) Beg.的干燥根,具有益气固表、利水消肿、托疮生肌等功效。黄芪含有皂苷、黄酮类与多糖类等多种活性成分[1-3]。研究表明黄酮类成分具有多种药理作用,如抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗炎等,已广泛运用于多种慢性疾病的治疗与研究中[4-5]。而黄芪中富含黄酮类成分,如毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、芒柄花素,目前黄芪中这4种成分的研究报道较多,且在黄芪质量评价方面,多选择这4种成分作为评价指标[6-8]。
黄芪在我国分布较为广泛,中国大部分地区均有种植,主要产区有内蒙古、山西、甘肃、黑龙江等。大量的研究发现不同产地的黄芪质量参差不齐,如酸不溶性、水不溶性、灰分、浸出物、皂苷类、黄酮类等在量上存在一定的差异[9-11]。目前有关黄芪产地鉴别的研究报道较少,仅见汪祺等[12]应用液相指纹图谱结合聚类分析和主成分分析对黄芪产地进行鉴别。在中药材产地研究方面,常见化学计量方法包括系统聚类[13-14]、主成分分析[15-16]、判别分析[17-18],但尚未见到将3种方法综合应用于黄芪产地的鉴别。3种方法在应用中具有不同的作用,多种方法结合使用可互相弥补每种方法的不足之处,使研究结果更加全面、系统,更有说服力[19]。同时毛蕊异黄酮苷具有降血压、调血脂等作用[20],芒柄花苷具有促皮肤生长、增强免疫、抑制脂质过氧化等药理活性[21],毛蕊异黄酮具有促血管作用、肝损伤的保护作用、抗过敏等作用[22],芒柄花素具有抗菌、抗心律不齐、调血脂等活性。鉴于此,本研究收集了陕西、内蒙古、四川、甘肃、吉林5个省份的黄芪药材共20批,以黄芪中毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮苷作为指标成分,采用UPLC法建立4种黄酮类成分同时测定的方法,比较研究聚类分析法、主成分分析法、判别分析法在黄芪产地鉴别上的应用。
1 仪器与试药 1.1 仪器Waters ACQUITY H-Class UPLCTM超高效液相色谱仪(包括四元高压梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、真空脱气机、Empower II色谱工作站),十万分之一电子天平Startorious BT125D [赛多利斯科学仪器(北京)有限公司],Milli-Q型超纯水制备仪(法国Millipore公司),R115安迪生硬质红外线灯泡(海宁市照明电器有限公司),电子天平奥豪斯SPS 202F[梅特勒-托利多(常州)称重设备有限公司],高速万能粉碎机(FW80型天津市泰斯特仪器有限公司)。
1.2 试药甲醇、乙腈均为色谱纯,其余试剂均为分析纯;超纯水由Milli-Q纯水机制备。刺芒柄花苷(批号15052010,质量分数99.14%),毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷(批号14110905,质量分数99.53%),芒柄花黄素(批号14091205,质量分数99.03%),毛蕊异黄酮(批号14121511,质量分数99.22%)购于成都曼斯特生物科技有限公司。20批黄芪药材分别收集于内蒙古、四川、甘肃、陕西、吉林5省区,由中国中医科学院中药资源中心袁媛研究员鉴定为蒙古黄芪Astragalus mem branaceus (Fisch.) Beg. var. mongholicus (Bge.) Hisao的干燥根,见表 1。
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表 1 样品信息 Table 1 Information of samples |
2 方法与结果 2.1 色谱条件
色谱柱:Aquity BEH C18(50 mm×2.1 mm,1.7 μm);流动相为0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)梯度洗脱,0~1 min,80%~77% A;1~3 min,77% A;3~5 min,77%~70% A;5~6.5 min,70% A;6.5~7 min,70%~80% A;体积流量0.4 mL/min;柱温45 ℃;检测波长250 nm;进样量1 μL。色谱见图 1。
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1-毛蕊异黄酮苷 2-芒柄花苷 3-毛蕊异黄酮 4-芒柄花素 1-calycosin-7-O-β-D-glycoside 2-ononin 3-calycosin 4-formononetin 图 1 黄芪样品(A)和对照品(B)溶液色谱图 Fig.1 HPLC chromatograms of AstragaliRadix (A) and reference substances (B) |
2.2 对照品溶液的制备
分别精密称取毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花素、芒柄花苷对照品适量,加甲醇配制成质量浓度分别为3.06、3.09、2.16、2.02 μg/mL对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备精密称取0.5 g黄芪粉末,置具塞平底圆形烧瓶中,加质量分数70%甲醇9 mL,称定质量,红外灯(200 W)提取9 min,快速降至室温,补足减失质量,滤过,滤液置25 mL量瓶中,少量多次洗涤残渣,加提取溶剂定容至刻度线,摇匀,过0.2 μm微孔滤膜,即得。
2.4 方法学考察 2.4.1 线性关系考察分别精密称取适量毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮对照品加甲醇溶解,配制成含1.03 mg/mL毛蕊异黄酮苷、1.01 mg/mL芒柄花苷、1.08 mg/mL芒柄花素、1.02 mg/mL毛蕊异黄酮对照品母液。稀释对照品母液分别配制7个梯度质量浓度的对照品溶液,以峰面积为纵坐标(Y),浓度为横坐标(X),绘制标准曲线,见表 2。
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表 2 4种黄酮类成分线性关系考察结果 Table 2 Results of linear investigation of four flavonoids |
2.4.2 精密度试验
分别取对照品芒柄花素(17.18、2.16、1.08 μg/mL)、芒柄花苷(24.24、2.02、1.01 μg/mL)、毛蕊异黄酮(16.32、3.06、1.02 μg/mL)、毛蕊异黄酮苷(17.28、3.09、1.03 μg/mL)高、中、低3个质量浓度对照品溶液以及供试品溶液,按“2.1”项色谱条件连续进样6次,测定对照品芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷峰面积,不同质量浓度对照品溶液峰面积的RSD均小于2%,供试品中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素峰面积的RSD分别为1.41%、2.87%、0.89%、2.19%。结果表明仪器精密度良好。
2.4.3 稳定性试验分别取对照品毛蕊异黄酮苷(17.28、3.09、1.03 μg/mL)、芒柄花苷(24.24、2.02、1.01 μg/mL)、毛蕊异黄酮(16.32、3.06、1.02 μg/mL)、芒柄花素(17.18、2.16、1.08 μg/mL)高、中、低3个质量浓度对照品溶液与供试品溶液,按“2.1”项色谱条件,分别考察日内稳定性(0、2、4、6、8、10、12、24 h)与日间稳定性(0、1、2、3 d)。结果显示,对照品溶液与样品溶液在24 h内与3 d内相对稳定(RSD均小于4%)。
2.4.4 重复性试验取同一批供试品6份,精密称定,按“2.3”项方法制备供试品溶液,按“2.1”项色谱条件测定。测得样品中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素平均质量分数分别为0.104、0.048、0.144、0.108 mg/mL,其RSD分别为1.29%、1.83%、1.46%、2.28%。表明该方法重复性良好。
2.4.5 加样回收率试验精密称取已测定的样品粉末6份,置具塞烧瓶中,分别精密加入芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷对照品溶液,按“2.3”制备方法制备供试品溶液,按“2.1”项色谱条件测定,结果显示,回收率均在95%~105%,RSD均小于3.5%。
2.5 样品测定将20批不同产地的黄芪药材,分别按“2.3”项下制备供试品溶液,并按“2.1”项色谱条件下进行测定,见表 3。
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表 3 不同产地黄芪药材中4种黄酮类成分测定结果(n=3) Table 3 Results of four flavonoids in Astragali Radix in different cultivated regions (n=3) |
2.6 数据处理 2.6.1 系统聚类分析
本实验采用SPSS 21.0软件中的组间法对样品进行系统聚类分析,欧式法计算样品间距离,将样品中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素4种成分的量导入分析。聚类结果见图 2,由图 2可以看出根据距离不同将各地区的药材划分为3大类,将8~11、16~20号(四川、吉林)划分为一大类;将3~7、12~15号(甘肃、陕西)划分为第二大类;将1~2号(内蒙古)划分为第三大类,且同一省份不同地区的药材样本分布相对集中。结合表 3分析,在含量方面,四川与吉林4种单一成分的量均较低,且差异较小,含量划分较为接近,故将这2个产地划分为一类;内蒙古产地成分量相比其他地区各单一成分量均较高,单独划分为一类;甘肃与陕西2个地区的成分相比四川与吉林成分量高,与内蒙古相比成分量稍低,且这2个地区的成分也较为接近,故划分为一大类。
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图 2 不同产地黄芪药材系统聚类分析图 Fig.2 Cluster analysis of Astragali Radix |
2.6.2 主成分分析
将黄芪中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素量导入SPSS 21.0软件,以特定的特征值与累计贡献率作为判定依据,对20批不同产地药材进行主成分分析。其中,主成分1与主成分2特征值分别为2.495、1.297,特征值均大于1,故含有2个主成分PC1与PC2,且方差贡献值分别为62.373%、32.424%。累计贡献值达94.796%,因此PC1与PC2 2个主成分可以反映黄芪的综合质量。由表 4因子载荷矩阵表知,PC1与毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素呈正相关;PC2与毛蕊异黄酮、芒柄花素呈正相关。分别以PC1与PC2建立坐标系,制作因子载荷矩阵散点平面图,见图 3,结合图 3可知主成分PC1与PC2将样品粗略聚为3类。将内蒙古地区聚为一类,将甘肃、陕西地区聚为一类,将吉林、四川聚为一类。
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表 4 因子载荷矩阵表 Table 4 Load matrix table of factor |
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图 3 主成分分析散点图 Fig.3 Scatter plots of principal component analysis |
与聚类分析结果相一致,在印证聚类分析的同时,同样可以得出PC1与PC2可用于黄芪产地划分。
根据得分系数矩阵结果得PC1、PC2及综合得分线性表达式,如下:
PC1=0.317 BX1+0.344 BX2+0.338 BX3+0.273 BX4
PC1=-0.450 BX1-0.382 BX2+0.364 BX3+0.539 BX4
BX1、BX2、BX3、BX4分别代表毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素的量
综合得分(F)=0.624×PC1+0.948×PC1
通过以上表达式得各地区的综合得分,并对得分结果进行排序,见表 3。得分情况反映各地区黄芪药材质量情况,质量越好,则分数越高。本研究中,甘肃地区药材得分最高,质量较好,而四川地区药材得分较低,其质量偏差。
2.6.3 判别分析判别分析是一种统计判别和分组的手段。通常聚类分析与判别分析联合起来使用,通过聚类结果对样品进行分类,本研究将对每个地区进行分别判定,之后与聚类结果进行对比分析。通过聚类分析得不同产地黄酮指标成分的含量特征,主成分分析中毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮苷载荷量都较大,这4种成分可用于黄芪药材地区的判别,利用判别分析法对20批不同地区的药材进行判定,结合典型判别函数通过软件分析结果表明毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷Sig值分别为0.000、0.000,小于0.05,说明这2种成分在组间具有显著的差异。
通过将20批黄芪药材导入判别分析,得Fisher判别函数,如下:
内蒙古地区=1 203.817×毛蕊异黄酮苷量-276.16×芒柄花苷量-40.817×毛蕊异黄酮量+582.452×芒柄花素量-180.889
甘肃地区=457.816×毛蕊异黄酮苷量+578.902×芒柄花苷量-299.267×毛蕊异黄酮量+1 030.455×芒柄花素量-98.804
四川地区=109.083×毛蕊异黄酮苷量-135.979×芒柄花苷量-42.458×毛蕊异黄酮量-65.871×芒柄花素量-2.974
陕西地区=452.809×毛蕊异黄酮苷量+511.690×芒柄花苷量-271.062×毛蕊异黄酮量+931.778×芒柄花素量-85.291
吉林地区=489.323×毛蕊异黄酮苷量-447.323×芒柄花苷量+86.449×毛蕊异黄酮量-58.772×芒柄花素量-23.429
为验证该判断函数的正确性,SPSS 21.0软件内部提供了交互验证对函数进行判别。内蒙古、四川、吉林判定正确率为100%,甘肃、陕西出现误判,有5批出现错误,甘肃中有2批误判在陕西,陕西有3批误判在甘肃,说明了甘肃与陕西产药材中各成分量相近。典型判别函数散点图如图 4所示,内蒙古、四川、吉林重心相距较远,而甘肃与陕西的重心相近,进一步说明了甘肃与陕西2个地区量具有一定的相似性。通过软件分析结果表明不同地区的所有批次初始分组正确率为85%,交叉验证判别正确率为75%,说明判别函数基本稳定,可用于黄芪药材地区的判断。在聚类分析和主成分分析中,产地甘肃和产地陕西的黄芪样品也不能完全区分,也与判别分析的结果基本一致。
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1-内蒙古 2-甘肃 3-四川 4-陕西 5-吉林 1-Inner Mongolia 2-Gansu 3-Sichuan 4-Shaanxi 5-Jilin 图 4 判别分析散点图 Fig.4 Scatter plots of discriminant analysis |
3 讨论
本实验通过对20批黄芪样品研究,发现不同产地质量差异较大,内蒙古地区质量最好,陕西和甘肃质量次之,吉林和四川质量最差。原因可能受其生长环境影响,如温度、湿度、光照、土壤等因素。在研究时通常引入监督分类与非监督分类进行数据结果分析,监督分类通常指自主进行对样品选择,而非监督分类则是非自主选择样本,由机器进行分类。以上3种化学计量分析法中,判别分析为监督分类,聚类分析与主成分分析是非监督分类,通过比较聚类分析、主成分分析、判别分析在黄芪产地鉴别上的应用,3种化学计量学方法的结果基本一致。鉴于本研究中黄芪样本数较少,在后续研究中还需继续增加采集地区与样品批次,进一步完善黄芪产地鉴别研究,同时也为中药材产地鉴别研究提供研究参考。
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