黄芪为豆科植物蒙古黄芪Astragalus mem-branaceus (Fisch.) Beg. var. mongholicus (Bge.) Hisao或膜荚黄芪Astragalus mem-branaceus (Fisch.) Beg.的干燥根，具有益气固表、利水消肿、托疮生肌等功效。黄芪含有皂苷、黄酮类与多糖类等多种活性成分^[1-3]。研究表明黄酮类成分具有多种药理作用，如抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗炎等，已广泛运用于多种慢性疾病的治疗与研究中^[4-5]。而黄芪中富含黄酮类成分，如毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、芒柄花素，目前黄芪中这4种成分的研究报道较多，且在黄芪质量评价方面，多选择这4种成分作为评价指标^[6-8]。

黄芪在我国分布较为广泛，中国大部分地区均有种植，主要产区有内蒙古、山西、甘肃、黑龙江等。大量的研究发现不同产地的黄芪质量参差不齐，如酸不溶性、水不溶性、灰分、浸出物、皂苷类、黄酮类等在量上存在一定的差异^[9-11]。目前有关黄芪产地鉴别的研究报道较少，仅见汪祺等^[12]应用液相指纹图谱结合聚类分析和主成分分析对黄芪产地进行鉴别。在中药材产地研究方面，常见化学计量方法包括系统聚类^[13-14]、主成分分析^[15-16]、判别分析^[17-18]，但尚未见到将3种方法综合应用于黄芪产地的鉴别。3种方法在应用中具有不同的作用，多种方法结合使用可互相弥补每种方法的不足之处，使研究结果更加全面、系统，更有说服力^[19]。同时毛蕊异黄酮苷具有降血压、调血脂等作用^[20]，芒柄花苷具有促皮肤生长、增强免疫、抑制脂质过氧化等药理活性^[21]，毛蕊异黄酮具有促血管作用、肝损伤的保护作用、抗过敏等作用^[22]，芒柄花素具有抗菌、抗心律不齐、调血脂等活性。鉴于此，本研究收集了陕西、内蒙古、四川、甘肃、吉林5个省份的黄芪药材共20批，以黄芪中毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮苷作为指标成分，采用UPLC法建立4种黄酮类成分同时测定的方法，比较研究聚类分析法、主成分分析法、判别分析法在黄芪产地鉴别上的应用。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Waters ACQUITY H-Class UPLC^TM超高效液相色谱仪（包括四元高压梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、真空脱气机、Empower II色谱工作站），十万分之一电子天平Startorious BT125D [赛多利斯科学仪器（北京）有限公司]，Milli-Q型超纯水制备仪（法国Millipore公司），R115安迪生硬质红外线灯泡（海宁市照明电器有限公司），电子天平奥豪斯SPS 202F[梅特勒-托利多（常州）称重设备有限公司]，高速万能粉碎机（FW80型天津市泰斯特仪器有限公司）。

1.2 试药

甲醇、乙腈均为色谱纯，其余试剂均为分析纯；超纯水由Milli-Q纯水机制备。刺芒柄花苷（批号15052010，质量分数99.14%），毛蕊异黄酮-7-O-葡萄糖苷（批号14110905，质量分数99.53%），芒柄花黄素（批号14091205，质量分数99.03%），毛蕊异黄酮（批号14121511，质量分数99.22%）购于成都曼斯特生物科技有限公司。20批黄芪药材分别收集于内蒙古、四川、甘肃、陕西、吉林5省区，由中国中医科学院中药资源中心袁媛研究员鉴定为蒙古黄芪Astragalus mem branaceus (Fisch.) Beg. var. mongholicus (Bge.) Hisao的干燥根，见表 1。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

色谱柱：Aquity BEH C₁₈（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流动相为0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）梯度洗脱，0~1 min，80%~77% A；1~3 min，77% A；3~5 min，77%~70% A；5~6.5 min，70% A；6.5~7 min，70%~80% A；体积流量0.4 mL/min；柱温45 ℃；检测波长250 nm；进样量1 μL。色谱见图 1。

2.2 对照品溶液的制备

分别精密称取毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷、芒柄花素、芒柄花苷对照品适量，加甲醇配制成质量浓度分别为3.06、3.09、2.16、2.02 μg/mL对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

精密称取0.5 g黄芪粉末，置具塞平底圆形烧瓶中，加质量分数70%甲醇9 mL，称定质量，红外灯（200 W）提取9 min，快速降至室温，补足减失质量，滤过，滤液置25 mL量瓶中，少量多次洗涤残渣，加提取溶剂定容至刻度线，摇匀，过0.2 μm微孔滤膜，即得。

2.4 方法学考察 2.4.1 线性关系考察

分别精密称取适量毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮对照品加甲醇溶解，配制成含1.03 mg/mL毛蕊异黄酮苷、1.01 mg/mL芒柄花苷、1.08 mg/mL芒柄花素、1.02 mg/mL毛蕊异黄酮对照品母液。稀释对照品母液分别配制7个梯度质量浓度的对照品溶液，以峰面积为纵坐标（Y），浓度为横坐标（X），绘制标准曲线，见表 2。

2.4.2 精密度试验

分别取对照品芒柄花素（17.18、2.16、1.08 μg/mL）、芒柄花苷（24.24、2.02、1.01 μg/mL）、毛蕊异黄酮（16.32、3.06、1.02 μg/mL）、毛蕊异黄酮苷（17.28、3.09、1.03 μg/mL）高、中、低3个质量浓度对照品溶液以及供试品溶液，按“2.1”项色谱条件连续进样6次，测定对照品芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷峰面积，不同质量浓度对照品溶液峰面积的RSD均小于2%，供试品中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素峰面积的RSD分别为1.41%、2.87%、0.89%、2.19%。结果表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验

分别取对照品毛蕊异黄酮苷(17.28、3.09、1.03 μg/mL)、芒柄花苷（24.24、2.02、1.01 μg/mL）、毛蕊异黄酮（16.32、3.06、1.02 μg/mL）、芒柄花素（17.18、2.16、1.08 μg/mL）高、中、低3个质量浓度对照品溶液与供试品溶液，按“2.1”项色谱条件，分别考察日内稳定性（0、2、4、6、8、10、12、24 h）与日间稳定性（0、1、2、3 d）。结果显示，对照品溶液与样品溶液在24 h内与3 d内相对稳定（RSD均小于4%）。

2.4.4 重复性试验

取同一批供试品6份，精密称定，按“2.3”项方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定。测得样品中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素平均质量分数分别为0.104、0.048、0.144、0.108 mg/mL，其RSD分别为1.29%、1.83%、1.46%、2.28%。表明该方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验

精密称取已测定的样品粉末6份，置具塞烧瓶中，分别精密加入芒柄花素、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、毛蕊异黄酮苷对照品溶液，按“2.3”制备方法制备供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，结果显示，回收率均在95%~105%，RSD均小于3.5%。

2.5 样品测定

将20批不同产地的黄芪药材，分别按“2.3”项下制备供试品溶液，并按“2.1”项色谱条件下进行测定，见表 3。

2.6 数据处理 2.6.1 系统聚类分析

本实验采用SPSS 21.0软件中的组间法对样品进行系统聚类分析，欧式法计算样品间距离，将样品中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素4种成分的量导入分析。聚类结果见图 2，由图 2可以看出根据距离不同将各地区的药材划分为3大类，将8~11、16~20号（四川、吉林）划分为一大类；将3~7、12~15号（甘肃、陕西）划分为第二大类；将1~2号（内蒙古）划分为第三大类，且同一省份不同地区的药材样本分布相对集中。结合表 3分析，在含量方面，四川与吉林4种单一成分的量均较低，且差异较小，含量划分较为接近，故将这2个产地划分为一类；内蒙古产地成分量相比其他地区各单一成分量均较高，单独划分为一类；甘肃与陕西2个地区的成分相比四川与吉林成分量高，与内蒙古相比成分量稍低，且这2个地区的成分也较为接近，故划分为一大类。

2.6.2 主成分分析

将黄芪中毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素量导入SPSS 21.0软件，以特定的特征值与累计贡献率作为判定依据，对20批不同产地药材进行主成分分析。其中，主成分1与主成分2特征值分别为2.495、1.297，特征值均大于1，故含有2个主成分PC1与PC2，且方差贡献值分别为62.373%、32.424%。累计贡献值达94.796%，因此PC1与PC2 2个主成分可以反映黄芪的综合质量。由表 4因子载荷矩阵表知，PC1与毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素呈正相关；PC2与毛蕊异黄酮、芒柄花素呈正相关。分别以PC1与PC2建立坐标系，制作因子载荷矩阵散点平面图，见图 3，结合图 3可知主成分PC1与PC2将样品粗略聚为3类。将内蒙古地区聚为一类，将甘肃、陕西地区聚为一类，将吉林、四川聚为一类。

与聚类分析结果相一致，在印证聚类分析的同时，同样可以得出PC1与PC2可用于黄芪产地划分。

根据得分系数矩阵结果得PC1、PC2及综合得分线性表达式，如下：

PC1=0.317 BX₁+0.344 BX₂+0.338 BX₃+0.273 BX₄

PC1=-0.450 BX₁-0.382 BX₂+0.364 BX₃+0.539 BX₄

BX₁、BX₂、BX₃、BX₄分别代表毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素的量

综合得分（F）=0.624×PC1+0.948×PC1

通过以上表达式得各地区的综合得分，并对得分结果进行排序，见表 3。得分情况反映各地区黄芪药材质量情况，质量越好，则分数越高。本研究中，甘肃地区药材得分最高，质量较好，而四川地区药材得分较低，其质量偏差。

2.6.3 判别分析

判别分析是一种统计判别和分组的手段。通常聚类分析与判别分析联合起来使用，通过聚类结果对样品进行分类，本研究将对每个地区进行分别判定，之后与聚类结果进行对比分析。通过聚类分析得不同产地黄酮指标成分的含量特征，主成分分析中毛蕊异黄酮、芒柄花苷、芒柄花素、毛蕊异黄酮苷载荷量都较大，这4种成分可用于黄芪药材地区的判别，利用判别分析法对20批不同地区的药材进行判定，结合典型判别函数通过软件分析结果表明毛蕊异黄酮苷、芒柄花苷Sig值分别为0.000、0.000，小于0.05，说明这2种成分在组间具有显著的差异。

通过将20批黄芪药材导入判别分析，得Fisher判别函数，如下：

内蒙古地区=1 203.817×毛蕊异黄酮苷量-276.16×芒柄花苷量-40.817×毛蕊异黄酮量+582.452×芒柄花素量-180.889

甘肃地区=457.816×毛蕊异黄酮苷量+578.902×芒柄花苷量-299.267×毛蕊异黄酮量+1 030.455×芒柄花素量-98.804

四川地区=109.083×毛蕊异黄酮苷量-135.979×芒柄花苷量-42.458×毛蕊异黄酮量-65.871×芒柄花素量-2.974

陕西地区=452.809×毛蕊异黄酮苷量+511.690×芒柄花苷量-271.062×毛蕊异黄酮量+931.778×芒柄花素量-85.291

吉林地区=489.323×毛蕊异黄酮苷量-447.323×芒柄花苷量+86.449×毛蕊异黄酮量-58.772×芒柄花素量-23.429

为验证该判断函数的正确性，SPSS 21.0软件内部提供了交互验证对函数进行判别。内蒙古、四川、吉林判定正确率为100%，甘肃、陕西出现误判，有5批出现错误，甘肃中有2批误判在陕西，陕西有3批误判在甘肃，说明了甘肃与陕西产药材中各成分量相近。典型判别函数散点图如图 4所示，内蒙古、四川、吉林重心相距较远，而甘肃与陕西的重心相近，进一步说明了甘肃与陕西2个地区量具有一定的相似性。通过软件分析结果表明不同地区的所有批次初始分组正确率为85%，交叉验证判别正确率为75%，说明判别函数基本稳定，可用于黄芪药材地区的判断。在聚类分析和主成分分析中，产地甘肃和产地陕西的黄芪样品也不能完全区分，也与判别分析的结果基本一致。

3 讨论

本实验通过对20批黄芪样品研究，发现不同产地质量差异较大，内蒙古地区质量最好，陕西和甘肃质量次之，吉林和四川质量最差。原因可能受其生长环境影响，如温度、湿度、光照、土壤等因素。在研究时通常引入监督分类与非监督分类进行数据结果分析，监督分类通常指自主进行对样品选择，而非监督分类则是非自主选择样本，由机器进行分类。以上3种化学计量分析法中，判别分析为监督分类，聚类分析与主成分分析是非监督分类，通过比较聚类分析、主成分分析、判别分析在黄芪产地鉴别上的应用，3种化学计量学方法的结果基本一致。鉴于本研究中黄芪样本数较少，在后续研究中还需继续增加采集地区与样品批次，进一步完善黄芪产地鉴别研究，同时也为中药材产地鉴别研究提供研究参考。