2017, Vol. 48
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2017.01.021 |
2. 重庆医科大学附属第一医院 重症医学科, 重庆 400016
2. Department of Emergency, First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
党参为桔梗科植物党参Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf、素花党参C. Pilosula Nannf. var. modesta (Nannf.) L. T. Shen或川党参C. tangshen Oliv.的干燥根[1]，具有健脾益肺之功效。生党参以益气生津为主[2]，炮制后功效发生变化，如米炒后气味焦香，益气健脾作用增强；蜜炙取其甘缓，增强补中益气的作用[3]；土炒后能增强其健脾止泻的作用；麸炒后能增强和胃健脾的作用。但是，党参炮制前后功效发生变化的物质基础和机制目前尚不清楚。有文献报道党参炮制后产生5-羟甲基糠醛（5-HMF），5-HMF具有增进血红细胞变性、改变血液流变学、抗氧化、抗心肌缺血等药理活性[4]。但是党参炮制后生成的5-HMF是否是其健脾功效的物质基础尚不清楚。本实验以巫山庙宇产党参为研究对象，仅以米炒方法炮制党参，研究党参米炒前后党参饮片中党参多糖与5-HMF的变化，并通过比较米炒前后党参对家兔胃肠平滑肌运动的影响，阐明米炒后产生的5-HMF是否是米炒前后党参发生健脾功效变化的物质基础之一。
1 材料 1.1 药品与试剂党参药材采自重庆巫山红椿庙宇镇，以5点法采样，随机分成20批，10批用来制备党参饮片，另外10批用来制备米炒党参饮片，每批10个样品。党参药材由重庆市中药研究院彭锐研究员鉴定为川党参Codonopsis tangshen Oliv.的干燥根。5-HMF（批号A93140，质量分数98%，中国食品药品检定研究院）；氯化乙酰胆碱（Ach，批号6YZBF-AG，东京化成工业株式会社）；甲硫酸新斯的明注射液（河南润弘制药股份有限公司，批号1410301），氯化钡（BaCl2，成都市科龙化工试剂厂，批号20090401）；硫酸阿托品注射液（遂成药业股份有限公司，批号1505092）；盐酸肾上腺素注射液（Adr，远大医药中国有限公司，批号140110）；葡萄糖、苯酚（成都市科龙化工试剂厂）；浓硫酸（重庆川东化工集团有限公司，批号20131101）；乙腈、甲醇（国药集团化学试剂有限公司），其他试剂为分析纯。
1.2 仪器UV-2450紫外-可见分光光度计（日本Shimadzu公司）；高效液相色谱仪（配有COSMOSIL 5C18-PAQ色谱柱日本岛津公司）；HW200S恒温平滑肌实验系统（成都泰盟软件有限公司）；BL-420F生物信号采集与分析系统（成都泰盟软件有限公司）；KQ5200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；FA2004B电子分析天平（上海精天电子仪器有限公司）；RE-52A旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；LX-04A型多功能粉碎机（上海江信科技有限公司）；SHB-IIIS型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司），FT-100生物张力传感器（成都泰盟软件有限公司）。
1.3 动物健康成年家兔，雄性，体质量约2 kg，普通级，由西南大学国家级药学实验教学实验平台提供。
2 方法 2.1 党参和米炒党参样品制备课题组前期运用正交试验优选党参饮片水处理及干燥工艺方法如下：党参药材去除杂质后，以党参质量的20倍水体积浸泡30 min，闷润3 h后切2~4 mm厚片，置于80 ℃下干燥8 h，筛去碎屑，粉碎，过20目筛，备用。米炒党参：党参饮片100 kg，用米20 kg，用米拌炒至表面深黄色，偶有焦斑，取出，筛去米，放凉，粉碎，过20目筛，备用[5]。
2.2 样品中总多糖的测定精密称取党参饮片粉末和米炒党参粉末各1.2 g分别置于烧杯中，加入蒸馏水30 mL，70 ℃超声提取35 min后抽滤，残渣用蒸馏水洗涤2次，洗液并入滤液，定容于50 mL量瓶中，摇匀。精密吸取上述样品液1 mL，稀释100倍后制成供试品溶液[6-8]。精密吸取0.5 mL供试品溶液，置于干燥的15 mL具塞试管中，加蒸馏水定容至1 mL，另取1 mL蒸馏水为空白对照。在试管中加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5 mL，摇匀，冷却至室温后沸水浴15 min，流水冷却后于490 nm波长处测定吸光度（A）值[9-10]，以葡萄糖标准溶液质量浓度为横坐标（X），A值为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得回归方程为Y=79.087 X-0.025 4，r=0.999 2，表明对照品葡萄糖在1.74~10.46 μg/mL与A值呈良好的线性关系。根据标准曲线计算多糖质量浓度，按以下公式[11]算出多糖质量分数。
多糖质量分数=多糖质量浓度×待测液体积/药材粉末质量
2.3 样品中5-HMF的测定[4] 2.3.1 色谱条件色谱柱为Kromasil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）Sel NO. 22208，检测波长284 nm，流动相3%乙腈；体积流量为1 mL/min，柱温25 ℃，进样量10 μL。
2.3.2 对照品的配制精密称取5-HMF对照品5.0 mg于50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。精密移取1 mL定容至10 mL量瓶中配成质量浓度为0.01 mg/mL对照品溶液，滤过，备用。
2.3.3 供试品制备精密称取过20目筛的米炒党参粉末和党参饮片粉末0.2 g左右，精密移取甲醇50 mL，称质量。超声30 min，放冷，补足质量，滤过，备用。
2.4 党参炮制前后对家兔离体胃肠平滑肌张力的影响[12] 2.4.1 台氏液配制1 000 mL台氏液含NaCl 8.0 g、KCl 0.2 g、MgCl2 0.1 g、NaH2PO4 0.05 g、NaHCO3 1.0 g、CaCl2 0.2 g、葡萄糖1.0 g，蒸馏水加至1 000 mL（CaCl2溶液须在其他基础溶液混合并加蒸馏水稀释之后，边搅拌边逐滴加入，否则将生成钙盐沉淀，葡萄糖应在临用时加入，加入葡萄糖的溶液不能久置）[13]。
2.4.2 5-HMF及米炒前后党参药液的制备（1）称取1 mg 5-HMF，用台氏液配成1 mg/mL 5-HMF的母液，备用。（2）称取党参饮片和米炒党参各2 g，加500 mL甲醇，超声30 min，放冷，补足质量，滤过，减压浓缩挥干，用台氏液溶解至每毫升含生药1 g的药液。置−4 ℃冷藏箱中备用。根据高效液相色谱测定米炒前后党参中5-HMF的量，计算出米炒前后每克党参含有5-HMF的量，再以5-HMF的量为依据，将米炒前后党参药液换算为含有5-HMF相应浓度的药液，用以比较米炒前后党参对家兔离体胃肠平滑肌运动的影响。备用。
2.4.3 家兔胃肠平滑肌肠段的制备家兔实验前禁食24 h，用木棒敲击延髓致死，迅速剖腹，取近幽门端十二指肠约10 cm，立即放入低温台氏液中。小心分离肠外周结缔组织，用低温台氏液冲洗肠内容物将其剪成2 cm×3 cm肠段备用[14]。
2.4.4 5-HMF及炮制前后党参对家兔离体胃肠平滑肌运动的影响[15]（1）按照上述方法制备肠段标本，调节恒温平滑肌槽（37.0±0.5）℃，缓慢通入气泡（2个气泡/s），取兔肠一段，两端各穿一线，其中一线固定于L型通气管上，放入有20 mL台氏液的浴漕内。肠段另一端连接张力换能器，并加以2 g负荷。打开BL-420F生物机能实验系统，将张力换能器与该系统连接，待肠段运动恢复正常后，记录一段肠段正常活动曲线，开始滴加不同质量浓度5-HMF、含有相应质量浓度5-HMF的党参和米炒党参药液，以及工具药Ach（1×10−5 mol/L）、新斯的明（0.15 g/mL）、BaCl2（10 mg/L）、阿托品（0.015 g/mL）和Adr（0.15 g/mL）。（2）米炒前后党参药液累积滴加方法：记录3 min正常肠段活动曲线，滴加生药质量浓度为0.1 mg/mL的米炒前后党参药液0、2、2、4、8、16、32 μL（米炒前后党参药液终质量浓度分别为0、0.01、0.02、0.04、0.08、0.16 mg/L。（3）5-HMF及党参药液累积滴加方法[15]：记录3 min正常肠段活动曲线，滴加质量浓度为0.1 mg/mL 5-HMF药液0、10、10、20、40、80 μL（终质量浓度分别为0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/L），每次加药间隔1 min，记录肠段收缩的张力变化。基于以上选择剂量及党参中5-HMF的量滴加1 g/mL（生药）党参药液0、5.4、5.4、10.8、21.6、43.2 μL（党参药液相当于含5-HMF终质量浓度分别为0、3.05、7.1、14.2、28.4、56.8 μg/L；米炒党参相当于含5-HMF终质量浓度分别为0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 mg/L）。
2.4.5 统计学处理实验结果用x±s表示，以IBM SPSS Statistics 20软件处理，采用单因素方差分析方法进行检验。
3 结果 3.1 党参饮片与米炒党参饮片外观比较党参饮片厚2~4 mm，表面淡黄棕色，断面浅白色，至中心颜色渐深，表皮疏松，韧皮部黄白色至灰黄色，散发特殊的党参香气；米炒党参饮片表面黄棕色至褐色，断面老黄色，韧皮部黄棕色至黄褐色，散发特殊的焦香味。见图 1。
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图 1 党参饮片和米炒党参饮片样品 Fig.1 Samples of Codonopsis Radix and Codonopsis Radix cooked with rice |
3.2 党参米炒前后总多糖量的比较
党参米炒后总多糖的量减少，米炒前后总多糖的量差异显著（P < 0.05、0.01），结果见表 1。
3.3 党参米炒前后5-HMF量的比较以5-HMF对照品的进样量为横坐标、峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程Y=4 491 X-246.11，r=0.994 3，表明5-HMF在0.06~0.14 μg内呈良好的线性关系。党参米炒后5-HMF的量增加非常显著（P < 0.01）。结果见表 1。
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表 1 党参米炒前后总多糖和5-HMF量的比较(x±s, n=10) Table 1 Contents of Codonopsis Radix polysaccharide before and after processing (x±s, n=10) |
3.4 5-HMF及党参米炒前后对家兔离体胃肠平滑肌运动的影响 3.4.1 相同生药浓度党参米炒前后作用比较
由表 2可见，党参和米炒党参均有促进立体胃肠平滑肌肠段收缩的作用（P < 0.05、0.01），与党参饮片组相比，米炒党参对离体胃肠平滑肌肠段收缩作用更加明显，张力增加显著。
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表 2 党参和米炒党参对家兔离体平滑肌收缩的影响(x±s, n=5) Table 2 Effects ofCodonopsis Radix andCodonopsis Radix cooked with rice on smooth muscle contraction from rabbits in vitro (x±s, n=5) |
3.4.2 5-HMF及党参米炒前后作用比较
由表 3可见，与对照组相比，5-HMF对离体胃肠平滑肌肠段具有明显的收缩作用（P < 0.01），随着剂量增大，张力逐渐增大。基于5-HMF的质量浓度确定的党参饮片随着质量浓度增大，张力值也呈现增加的趋势，但米炒党参对离体胃肠平滑肌肠段收缩作用更加明显，张力增加更显著。
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表 3 5-HMF、党参及米炒党参对家兔离体平滑肌收缩的影响(x±s, n=5) Table 3 Effects of 5-hydroxymethyl-fufural, Codonopsis Radix, andCodonopsis Radix cooked with rice on smooth muscle contraction from rabbits invitro (x±s, n=5) |
3.4.3 工具药对5-HMF、党参及米炒党参作用的影响
Ach、新斯的明、BaCl2能够兴奋离体胃肠平滑肌收缩，阿托品、Adr能够抑制离体胃肠平滑肌收缩，Ach联合5-HMF使用后，没有对家兔离体平滑肌张力产生显著影响；阿托品是M受体阻断剂，阿托品联合5-HMF使用后，没有对家兔离体平滑肌张力产生显著影响。提示5-HMF对家兔离体平滑肌收缩张力的影响与M受体无关。5-HMF和米炒党参均能够显著抑制新斯的明、BaCl2所致的强直痉挛性收缩，对抗Adr所致的平滑肌舒张，提示5-HMF和米炒党参对离体胃肠平滑肌有双向调控作用。见表 4。
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表 4 工具药联合党参及米炒党参对家兔离体平滑肌收缩的影响(x±s, n=5) Table 4 Effect of tool medicine combined with Codonopsis Radix orCodonopsis Radix cooked with rice on smooth muscle contraction from rabbits in vitro (x±s, n=5) |
4 讨论
中药炮制直接影响临床疗效，明代《本草蒙筌》中讲到：“凡药制造，贵在适中，不及则功效难求，太过则气味反失”。庙宇党参隶属于川党参，不仅活性成分党参多糖的量较高[16]，氨基酸成分较其他产地也比较高[17]。本实验以庙宇党参为例，结果发现党参米炒后党参多糖的量显著减少，而5-HMF明显增加，推测党参米炒以后，党参多糖可能通过化学反应转化成其他物质如5-HMF，这一结果与文献报道一致[4]。
传统炮制理论以及临床研究证实，党参炮制前后出现了功效差异，但其功效差异的物质基础和药理作用机制并不清楚。本研究结果显示，党参米炒炮制后再现了5-HMF的作用，其作用趋势和统计学结果与5-HMF一致，且与相应浓度党参饮片比较，米炒后党参显著增强了离体肠段的收缩张力，结合党参米炒炮制后5-HMF量显著增加的实验结果，表明5-HMF是党参米炒炮制后健脾功效增强的物质基础之一。
Ach是M受体激动剂，Ach联合5-HMF使用后，并没有对家兔离体平滑肌张力产生显著影响；阿托品是M受体阻断剂，阿托品联合5-HMF使用后，没有对家兔离体平滑肌张力产生显著影响。提示5-HMF对家兔离体平滑肌收缩张力的影响与M受体无关。新斯的明作用于胆碱能N2受体[18]，增强胃肠道平滑肌收缩，新斯的明联合5-HMF使用后，显著抑制了胃肠道平滑肌收缩，张力降低明显，表明5-HMF对胃肠道平滑肌的作用可能与新斯的明竞争N2受体，从而使新斯的明作用减弱有关，结合现有文献，5-HMF也可能下调N2受体，或者5-HMF促进AchE表达，致使Ach减少，导致家兔离体平滑肌松弛，肌肉收缩张力降低[19]。BaCl2直接作用于肠管，使平滑肌发生强直性痉挛，而5-HMF能够显著对抗BaCl2所致的平滑肌强直性痉挛。肾上腺素Adr对平滑肌的影响与平滑肌的受体类型有关[20]，Adr与小肠平滑肌肌膜上的β肾上腺素能受体结合，使膜超极化，抑止动作电位的产生和收缩活动，可使β1受体占优势的胃肠平滑肌舒张，张力降低[21]。5-HMF能够显著逆转Adr对胃肠平滑肌运动的影响，增强平滑肌收缩张力，改善胃肠运动。提示5-HMF作用可能与拮抗β肾上腺素能受体有关。
值得注意的是，米炒前党参显著增强了Ach的作用，但对阿托品和Adr的影响不明显，党参米炒前对抗新斯的明和BaCl2对胃肠道平滑肌收缩的作用，但不似5-HMF和米炒后党参作用显著，米炒后党参对离体肠段的作用与相应剂量的5-HMF作用趋势高度一致，提示米炒前后党参对胃肠道平滑肌收缩的作用并非是5-HMF单独作用的结果，而是多种成分共同的效应。
综上，本实验结果提示党参米炒后功效发生了改变，其部分原因与5-HMF的量发生变化有关，米炒前后党参对胃肠道平滑肌的作用是N2受体和β肾上腺素能受体共同调控的结果。
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