陆英Sambucus chinensis Lindl. 又名接骨草、八棱麻、蒴藋等，属于忍冬科（Caprifoliaceae）接骨木属Sambucus L. 多年生草本植物。在国内分布广泛，是一种传统中草药，具有抗氧化^[1]、抗病毒^[2]和抗肿瘤^[3]等功效，尤其对黄疸型和病毒性肝炎具有显著疗效^{[4, 5, 6]}，其发挥作用的主要成分均属萜类化合物。在高等植物中，萜类化合物主要由甲羟戊酸（MVA）途径合成，MVA 为萜类合成的前体。3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A合成酶（HMGS）是MVA途径中的一个重要酶，乙酰乙酰辅酶A与乙酰辅酶A在HMGS的催化下缩合成3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）^[7]。目前，已在拟南芥^[8]、橡胶树^[9]、长白杉、多花水仙^[11]、茶树^[12]、喜树^[13]等植物中成功分离、克隆到HMGS基因，而陆英HMGS基因未见任何报道。

本研究拟克隆陆英HMGS基因cDNA序列，利用生物信息学对其推导的氨基酸序列进行分析，检测该基因在不同组织器官中的表达特异性。为进一步研究该基因的分子调控机制并阐明其在陆英萜类合成途径中的重要作用提供理论基础。

样品经怀化学院伍贤进教授鉴定为陆英Sambucus chinensis Lindl.，种植于怀化学院植物种植园，于2014年6月5日采集同一株陆英的根状茎、地上茎、叶片、花等样品，洗净后，乙醇擦拭，经焦碳酸二乙酯（DEPC）处理水及蒸馏水冲洗后，放入液氮中保存，带回实验室，于−80 ℃冰箱保存备用。

RNA提取试剂盒、cDNA合成试剂盒、高保真DNA聚合酶Prime STARHS DNA Polymerase、克隆载体pMD 18-T Vector、质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒、菌种JM109、DNA相对分子量标记，T4 DNA连接酶、荧光定量试剂盒SYBR Prime Script^TM RT-PCR Kit及电泳类试剂等，均购自TaKaRa公司。

陆英根状茎、地上茎、叶片及花RNA提取方法按照Trizol试剂说明书进行，提取后进行电泳检测和纯度及浓度测定；并于−80 ℃保存备用。

根据试剂盒说明书进行，反转录产物合成后置于−20 ℃保存备用。

通过分析陆英高通量转录组数据，发现一个被注释为HMGS的转录本，同已报道的其他植物（人参、三七、可可、烟草、三叶胶等）HMGS基因的核苷酸序列进行比对，应用Oligo 6软件设计引物。上游引物HMGS-F：5’-ATGGCCTC-ACAGCAAAA-3’；下游引物HMGS-R：5’-TCAGT-GACCGTTGACCAGT-3’，由生工生物工程（上海）股份公司合成。

反应体系和反应条件参照文献报道^[14]，其中退火温度为56 ℃。

对PCR产物进行回收，连接载体pMD 18-T Vector，并转化感受态细胞JM109，蓝白筛选后，挑选白色单克隆菌落20个，分别进行过夜培养，并提取质粒，然后送生工生物工程（上海）股份公司测序。采用DNAStar软件包分析与处理序列，在NCBI网站上Blast比对及BioEdit软件分析，并用Mega6软件^[15]进行UPMAG聚类分析。采用ExPASy Proteomics Server 提供的在线工具对陆英HMGS基因编码蛋白的理化性质及结构与功能进行预测^{[16, 17, 18]}。

利用实时荧光定量PCR（RT-PCR）的方法检测HMGS基因在陆英根（根状茎）、茎（地上茎）、叶、花中的相对表达量，采用美国ABI7500 RT-PCR检测系统，上游引物qHMGS-F序列为：5’-TGGCATTGACCCTAAA CA-3’，下游引物qHMGS-R序列为：5’-AATAGCTGCTGCTC-CTCC-3’。RT-PCR检测的反应体系如下：5 μL 2×SYBR^® PremixEx Taq^TM，正、反向引物均为0.3 μL，cDNA模板2 μL；加ddH₂O至10 μL，反应程序：95 ℃、5 min，95 ℃、20 s，60 ℃、20 s，72 ℃、20 s，40个循环，RT-PCR反应以陆英18 S rDNA为内参，18 S rDNA序列设计引物18S-F：5’-CGGAAGGTCTGG GTAATC-3’和18S-R：5’-ACGTAATCAACGCAA GCT-3’，产物大小为147 bp，每个反应重复3次。

以总RNA反转录所得到的第一链cDNA为模板，用引物HMGS-F和HMGS-R进行PCR扩增。电泳检测发现约在1 401 bp处有一条亮带见图 1。对20份重组质粒的插入片段进行测序，结果序列一致，确定陆英HMGS基因为单拷贝。序列经Blast确定为陆英HMGS基因序列，经ORF Finder预测，该序列含有一个完整的开放阅读框，推测编码466个氨基酸，见图 2。

M-Marker 1,2-PCR产物 M-Marker 1,2-PCR products 图 1 陆英HMGS的PCR扩增 Fig.1 PCR amplification of HMGS in S. chinensis

图 2 陆英HMGS基因的核苷酸序列及推测的氨基酸序列 Fig.2 Nucleic acid sequence and supposed amino acid sequence of HMGS gene in S. chinensis

陆英HMGS基因预测编码466个氨基酸，利用ExPASy在线软件对其蛋白的理化性质进行预测分析。推测其分子式为C₂₃₀₅H₃₅₅₄N₅₉₆O₇₀₄S₂₈，相对分子质量是51 776.8，等电点（pI）为5.78。该蛋白的不稳定系数（instability index）为40.65，属于稳定蛋白质。脂肪系数（aliphatic index）为73.69，亲水性系数（grand average of hydropathicity）为−0.226，该蛋白不含信号肽，不含跨膜区。

预测HMGS蛋白的二级结构如图 3所示，该蛋白的二级结构中α-螺旋占42.70%、β-折叠占4.72%、无规则卷曲占36.05%、自由延伸16.52%。由SWISS-MODEL预测HMGS的三级结构如图 4所示。

蓝色-α-螺旋 红色-折叠 绿色-β-转角 紫色-卷曲 blue-α-helix red-turn green-β-extended strand purple-coil 图 3 HMGS蛋白二级结构 Fig.3 Secondary structure prediction of HMGS protein

图 4 HMGS蛋白三级结构Fig.4 Teritary structureprediction of HMGS protein

推导氨基酸序列比较结果表明，陆英HMGS与人参、三七、可可、烟草、三叶胶、番茄、黄芪和丹参的HMGS蛋白质分子的相似度分别为90.4%、90.2%、90.0%、86.2%、85.1%、85.1%、84.5%和84.0%，不同物种HMGS氨基酸序列同源性在90.4%～84.0%。UPMAG聚类分析表明，陆英与可可、人参和三七亲缘关系最近，与丹参亲缘关系相对较远，见图 5。

图 5 陆英与其他植物HMGS的UPGMA进化树 Fig.5 UPGMA dendrogram of HMGS in S. chinensis and other plants

利用RT-PCR检测HMGS基因在根状茎、地上茎、叶、花等器官中的表达特异性，结果表明该基因主要在根状茎和花中表达，在叶中的表达相对较低，见图 6。

图 6 陆英不同组织中HMGS基因的相对表达量 Fig.6 Relative expression quantity of HMGS gene in different tissues of S. chinensis

HMGS基因在很多植物中已被成功克隆，但在陆英中尚未见报道，本研究利用RT-PCR技术首次克隆了陆英HMGS基因的全长cDNA序列，其完整开放阅读框为1 401 bp，编码466个氨基酸。对推导的氨基酸序列的结构和功能进行生物信息学分析，含有HMGS蛋白保守序列GNTDIEGVDSTNA-CYGGTA，这是HMGS蛋白的典型特征，同时HMGS基因的同源序列在不同的物种中显示很强的保守性，该基因推测氨基酸序列与已报道植物的HMGS蛋白序列有很高的一致性（大于80%），说明对HMGS的预测是完全可靠的。可见，克隆到的HMGS是陆英羟甲基戊二酰辅酶Ａ合酶基因。结果也提示HMGS蛋白质在不同植物生命活动过程中发挥着相似的作用。陆英HMGS基因在根（根状茎）、花、茎（地上茎）、叶中的相对表达量分别为1.197、1.167、0.872和0.693，由于HMGS 是甲羟戊酸途径第2个催化酶，其产物（羟甲基戊二酸，CoA）经一系列酶促反应最终成为异戊烯焦磷酸，是萜类化合物的重要前体。以陆英的入药部位中萜类化合物的量来衡量药效，本实验结果HMGS基因相对表达量的差异可为陆英的入药部位的选取提供一定的理论依据。

植物萜类化合物具有重要的商业价值，被广泛用于工业、医药卫生等领域^[19]。萜类化合物是绝大部分中药材的重要药用成分之一，HMGS在萜类化合物合成途径中发挥重要作用。研究表明，HMGS的表达与相关萜类化合物的水平具有一定的相关性，逆境胁迫对HMGS的表达具有诱导作用^[20]。在药用植物中，HMGS作为萜类化合物合成途径中的重要酶，其活性高低与量的多少决定着许多有效成分产量的多少。如何利用HMGS的表达提高有效药用活性成分在植株中的量，将成为提高中药材品质的有效手段。

因此，对陆英HMGS基因的克隆及进一步研究其在陆英中的功能和受调控的机制，并进一步构建陆英HMGS基因过表达载体和遗传转化体系，为实现重要药用成分在植株中高效表达，通过基因表达调控技术以控制植物萜类代谢流向挥发性萜类物质的合成从而提高陆英的药材品质具有重要意义。