附子Aconiti Lateralis Radix Praeparata为毛莨科乌头属植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品，具有回阳救逆、补火助阳、散寒止痛等功效^[1]。干姜与附子配伍组成姜附汤，二者是温通心阳的常用药对，主治肾阳虚而烦躁、脉沉细等症，临床上用于急救回阳^[2-4]。四逆汤由附子、干姜、炙甘草3味药材组成，其功效为回阳救逆，主治少阳病^[5-6]。参附注射液由人参、附子提取物组成，具回阳救逆、益气固脱之功，主要用于阳气暴脱、四肢厥逆、心力衰竭等症^[7-9]。

研究表明附子中的乌头碱、新乌头碱、次乌头碱等双酯型生物碱是主要药效成分，同时也是毒性成分^[10-12]，但目前对附子配伍研究中，多从其毒性角度进行研究，未能充分阐明其配伍机制^[13-14]。等量附子获得的单一附子汤、姜附汤、四逆汤和参附注射液4种制剂由于组方不同，可能引起附子中碱性物质的质量浓度发生变化，起到整体减毒增效和适用于不同适应症的作用。

吸波面积法是药物经紫外-可见吸收光谱全波长扫描后，通过获得的吸光度（A）与波长曲线下的面积（简称吸波面积）求算整体药物浓度/质量浓度的一种分析方法，前期研究表明^[15-21]吸波面积和中药复方中整体成分的总浓度呈正比。本实验拟采用吸波面积法和传统的溴甲酚绿比色法分别测定等量附子不同组方的4种制剂中碱性物质的质量浓度，通过比较分析，以期对含附子药对的配伍机制、量效关系和临床安全性研究提供有益的理论指导。

TU-1901双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；AR-2140十万分之一电子天平，梅特勒-托利多仪器上海有限公司；VXH-3型微型旋涡混合器，上海跃进医疗器械厂；TDL-4低速台式离心机，上海安亭科学仪器厂；HH-2型数显恒温水浴锅，国华电器有限公司。

单一附子汤、姜附汤、四逆汤均由福建中医药大学中药制剂实验室自制；黑附片、干姜和炙甘草均购自安微协和成药业饮片有限公司，并由福建中医药大学中药鉴定教研室杨成梓教授鉴定，分别为毛莨科乌头属植物乌头Aconitum carmichaelii Debx.的子根的加工品、姜科姜属植物姜Zingiber officinale Rose.的干燥根茎、豆科甘草属植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根茎炮制加工品；参附注射液，雅安三九药业有限公司，产品批号150909010；乌头碱对照品，批号110720-200410，质量分数≥98%，中国食品药品检定研究院；其他试剂均为分析纯。

精密称取黑附片90 g，置烧杯中，加15倍量蒸馏水，浸泡30 min，煎煮2次（第1次2.0 h，第2次1.5 h），滤过合并滤液，水浴浓缩至450 mL（相当于附子生药0.2 g/mL），加入0.9 mL的聚山梨酯-80，即得单一附子汤样品溶液。

精密称取黑附片90 g、干姜60 g，置烧杯中，按“2.1.1”项同法操作，得姜附汤样品溶液。

按照《中国药典》2015年版一部中四逆汤的处方，精密称取黑附片90 g，干姜60 g，炙甘草90 g，置烧杯中，按“2.1.1”项同法操作，得四逆汤样品溶液。

称取乌头碱对照品5.00 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加三氯甲烷溶解，定容，即得质量浓度为200 μg/mL对照品溶液。

分别精密移取单一附子汤、姜附汤、四逆汤和参附注射液各1 mL，用10%氨水调pH值至10~11，静置，加4 mL三氯甲烷，涡旋2 min，3 800 r/min离心10 min，取三氯甲烷层，即得上述4种制剂的供试品溶液（相当于附子生药0.05 g/mL）。另精密移取0.2%聚山梨酯-80水溶液1 mL，同法操作，即为空白参比溶液。

取供试品溶液与对照品溶液，在紫外200~600 nm波长下进行全波长扫描，结果见图 1。

图 1 吸波面积法对照品与供试品紫外全波长扫描图 Fig.1 Scanning profile on ultraviolet full wavelength for reference and test samples

精密移取乌头碱对照品溶液0.25、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、5.0 mL于5 mL的量瓶中，加三氯甲烷定容至刻度，即得质量浓度分别为10、20、40、60、80、120、200 μg/mL的对照品溶液，以三氯甲烷作空白对照，在200~600 nm波长下进行紫外扫描，通过Origin 8.0软件求算200~600 nm波长下的吸波面积。以吸波面积为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），建立乌头碱的吸波面积法线性方程Y=0.145 42 X+3.240 4，r=0.999 3，结果表明，乌头碱在10~200 μg/mL吸波面积和质量浓度呈良好的线性关系。

取80 μg/mL的乌头碱对照品溶液，在200~600 nm波长下连续测定6次，RSD为1.05%，表明仪器精密度良好。

取单一附子汤、姜附汤、四逆汤和参附注射液样品，按“2.2.2”项下操作，分别制得6份，于200~600 nm波长下进行紫外扫描，RSD分别为5.02%、2.82%、2.73%、0.60%，表明该方法重复性良好。

分别取单一附子汤、姜附汤、四逆汤和参附注射液样品制得的供试品溶液，分别在0、2、4、6、8、10 h进行紫外扫描，RSD分别为4.20%、4.08%、4.59%、2.14%，表明各供试品溶液在10 h内稳定性良好。

取单一附子汤、姜附汤、四逆汤和参附注射液样品溶液，分别加入乌头碱对照品187、374、374、120 μg，混匀，按“2.2.2”项下操作，各制得6份，在200~600 nm波长下扫描，计算加样回收率和RSD值，结果平均加样回收率分别为105.14%、106.07%、107.37%、98.75%，RSD分别为3.78%、3.20%、5.03%、2.07%。

称取乌头碱对照品2.56 mg，精密称定，置25 mL量瓶中，加0.01 mol/L盐酸溶液溶解，稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为102.40 μg/mL的对照品溶液。

分别移取单一附子汤、姜附汤、四逆汤样品溶液各1.0 mL，置于3个离心管中，加10%氨水调pH值至10~11，三氯甲烷（每次3 mL）涡旋提取4次，静置，取三氯甲烷层，合并。回收三氯甲烷，残渣加0.01 mol/L盐酸溶液适量，溶解，转入10 mL量瓶中，0.01 mol/L盐酸定容，即得上述3种供试品溶液（相当于附子生药0.02 g/mL）。

精密移取参附注射液10 mL置于离心管中，加10%氨水调pH值至10~11，三氯甲烷涡旋提取4次（每次10 mL），合并三氯甲烷液，回收溶剂，残渣加0.01 mol/L盐酸溶液适量，溶解，转入10 mL量瓶中，0.01 mol/L盐酸溶液定容，得参附注射液供试品溶液。另精密移取0.2%聚山梨酯-80水溶液，同法操作，即为空白参比溶液。

取在碱性条件下与溴甲酚绿发生显色反应后的对照品溶液、供试品溶液，在紫外200~600 nm下进行全波长扫描，确定415 nm为检测波长，结果见图 2。

图 2 溴甲酚绿比色法对照品与供试品紫外全波长扫描图 Fig.2 Scanning profile on ultraviolet full wavelength for reference and test samples

精密移取0.00、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 mL对照品溶液，置离心管中，分别加入0.01 mol/L盐酸溶液2.00、1.50、1.25、1.00、0.75、0.50、0.25 mL，再依次加醋酸-醋酸钠缓冲液10 mL，溴甲酚绿液2 mL，三氯甲烷10 mL，涡旋3 min，静置，分取三氯甲烷液，在紫外下415 nm波长处测定A值。以A值为纵坐标（Y），质量浓度为横坐标（X），建立溴甲酚绿比色法线性方程Y=0.008 63 X+0.006 57，r=0.999 5，结果表明，乌头碱在25.6~89.6 μg/mL时A值和质量浓度呈良好的线性关系。

取51.2 μg/mL乌头碱对照品溶液，按“2.3.4”项下方法，连续测定6次，RSD为0.12%，表明仪器精密度良好。

取单一附子汤、姜附汤、四逆汤和参附注射液样品溶液，按“2.3.2”项和“2.3.4”项下方法操作，分别制得6份，在紫外下415 nm波长处测定，RSD分别为3.70%、1.49%、1.48%、1.76%，表明该方法重复性良好。

取单一附子汤、姜附汤、四逆汤和参附注射液样品制得的供试品溶液，按“2.3.4”项下方法操作，分别在0、20、40、60、80、100 min进行测定，RSD分别为2.80%、1.78%、1.45%、1.89%，表明供试品溶液在100 min内稳定性良好。

取单一附子汤、姜附汤、四逆汤和参附注射液样品溶液，分别加入乌头碱对照品30.72、40.96、40.96、38.40 μg，混匀，按“2.3.2”项和“2.3.4”项下方法操作，各制得6份，在紫外下415 nm波长处测定，计算加样回收率和RSD值，结果平均加样回收率分别为102.98%、116.72%、96.64%、112.61%，RSD分别为5.49%、1.81%、2.87%、4.51%。

分别取3批样品，采用上述2种方法测定等量附子不同组方的4种中药制剂中碱性物质的质量浓度，结果见表 1。等量附子不同组方（单一附子汤、姜附汤、四逆汤和参附注射液）采用吸波面积法测得碱性物质质量浓度分别为1 278.35、2 907.12、2 455.61、2 98.21 μg/mL；而比色法测得的碱性物质质量浓度分别为293.82、447.77、343.80、38.38 μg/mL；前者方法测得碱性物质的质量浓度均为后者方法测得的5倍数值以上，但其大小均符合姜附汤＞四逆汤＞单一附子汤＞参附注射液的趋势。

表 1(Table 1)

表 1 样品定量测定结果 Table 1 Results of sample content 样品 质量浓度/(μg·mL-1) 吸波面积法 比色法 单一附子汤 1 196.48 289.19 1 365.60 291.51 1 272.96 300.78 姜附汤 2 903.71 455.54 2 933.09 449.91 2 884.56 437.86 四逆汤 2 429.17 337.86 2 428.83 344.46 2 508.83 349.10 参附注射液 296.48 36.57 293.51 40.28 304.63 38.31

表 1 样品定量测定结果 Table 1 Results of sample content

由2种方法测得4种制剂中碱性物质质量浓度的结果可得，附子与干姜配伍后碱性物质的质量浓度增加，与中医“附子无姜不热”的说法相一致；佐以益气补中的甘草，碱性物质有所减少，体现了“遇甘草则缓”；附子与人参配伍，碱性物质减少，又含有皂苷成分，体现了“附子得人参则回阳而无燥热伤阴之弊，人参得附子则补气而兼温里之功”。单一附子汤、姜附汤、四逆汤煎煮方法和组方的确定主要参照《中国药典》2015年版一部中四逆汤的煎煮方法及处方。

由于市售的参附注射液处方中含有0.2%聚山梨酯-80，且规定每毫升的注射液中含0.2 g附子生药，考虑到同一性原则，故将单一附子汤、姜附汤、四逆汤浓缩至含附子生药0.2 g/mL，且加入0.2%的聚山梨酯-80。

在供试品溶液制备中采用涡旋而非萃取方法，前期课题组实验^[22]得出，涡旋能使溶剂与溶质混合更充分，有利于碱性物质的提取。在吸波面积法中，单一附子汤、姜附汤、四逆汤3个供试品溶液在进行紫外扫描时，其在241 nm处的A值均大于10，故将其稀释16倍后进行测定。另前期实验只取1 mL的参附注射液进行测定，发现在415 nm处A值很低（约0.03），故采用10 mL进行测定，这可能是加样回收率试验中，其生物碱量比单一附子汤和四逆汤中的量要大的原因。

吸收光谱体现了所有紫外可见波长内有吸收的所有成分的总和，在碱性条件下，经有机溶剂萃取得到的为碱性部分^[23]，故显色前所得曲线（图 1）与乌头碱对照品较为类似，但又稍有些不同。另酸性染料溴甲酚绿只与碱性条件下生成季铵阳离子的碱性物质发生反应^[24-26]，生成的络合物[R₄N⁺+ In⁻=(R₄N⁺•In⁻)]与显色后的乌头碱对照品比较，供试品同样在415 nm处有最大吸收，但在200~300 nm处仍有较多吸收峰，而对照品则没有，这正是碱性条件下不能生成季铵阳离子而未能与溴甲酚绿发生反应的其他碱性物质保留下来的特征，比如可能存在稠环氮杂缩醛体系的碱性物质，其在碱性条件下可被三氯甲烷萃取出，但不能生成季铵阳离子碱性物质。因此，所得的曲线能够代替制剂中的整体碱性物质，所选择的溴甲酚绿比色法可用于测定制剂中所含的乌头碱类生物碱^[27-29]，其结果科学可行，选择性良好。

综上所述，针对现有乌头或附子类制剂的标准中多采用比色法进行生物碱限量测定可能不够完整，如果增加吸波面积法对制剂中整体碱性物质的定量测定，将对现有标准具有良好的补充作用。