2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.23.007 |
甘草Glycyrrhizae RadixetRhizoma是豆科（Leguminosae）甘草属GlycyrrhizaLinn.某些植物的干燥根及根茎，广泛分布在我国的华北、东北和西北地区，素有“国老”的尊称[1]。《中国药典》2015年版中收录的甘草有3种，分别是甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.、胀果甘草Glycyrrhiza inflata Bat.和光果甘草Glycyrrhiza glabra L.。甘草具有补脾益气、清热解毒、祛痰止咳、缓急止痛、调和药效的功效[2]，其主要的化学成分是黄酮类和三萜皂苷类等[3]，还包括香豆素、生物碱、氨基酸、有机酸和多糖等。现代药理学研究表明，甘草具有抗肿瘤、抗动脉粥样硬化和抗血栓形成、抗病毒、抗炎、抗菌和抗原虫等药理作用[2-4]。目前已有研究证明甘草中的抗炎活性成分主要有甘草酸（glycyrrhizinic acid）、异甘草素（isoliquiritigenin）、异甘草苷（isoliquiritin）、甘草素（liquiritigenin）、甘草查耳酮A（licochalcone A）、光甘草定（glabridin）和甘草酚（glycyrol）等[4-10]。本实验对甘草乙醇提取液中的黄酮类化合物进行分离鉴定，共得到10个化合物，分别是甘草苷（liquiritin，1）、芹糖甘草苷（liquiritin apioside，2）、异甘草苷（isoliquiritin，3）、芹糖异甘草苷（isoliquiritin apioside，4）、sophoraisoflavone A（5）、粗毛甘草素F（glyasperin F，6）、光甘草酮（glabrone，7）、光甘草定（glabridin，8）、甘草黄酮醇（licoflavonol，9）和粗毛甘草素D（glyasperin D，10）。并用细菌脂多糖（LPS）诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型对分离到的化合物进行了抑制NO产生活性筛选，发现化合物1、3、5、6、8和9对NO分泌有一定的抑制作用。其中化合物5、6和9对抑制LPS诱导的RAW264.7细胞NO分泌的结果为首次报道，是甘草潜在的抗炎活性成分。
1 仪器与材料Agilent 1100型高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；Bruker Avance III 500核磁共振仪（瑞士Bruker公司）；Agilent 6230 TOF质谱仪（美国Agilent公司）；Agilent Zorbax SB-C18 Semi-Preparative色谱柱（250 mm×9.4 mm，5 μm，美国Agilent公司）；Milli-Q水（法国Millipore公司）；D101大孔树脂购自天津海光化工有限公司，ODS填料购自日本YMC公司，甲醇（分析纯）购自国药集团化学试剂有限公司，无水乙醇（分析纯）购自上海凌峰化学试剂有限公司；RAW264.7细胞购于上海细胞库，NO检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，TECAN F200荧光及化学发光分析仪购自瑞士TCAN公司。
甘草（新疆，批号150501）购自杭州市本地药店，由浙江大学药学院陈柳蓉副教授鉴定为甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根。
2 提取与分离取干燥的甘草5.0 kg，分别用8倍量和6倍量的95%乙醇水溶液回流提取2次，每次1 h。合并2次提取液，减压浓缩到一定浓度后，置于装有D101大孔树脂的色谱柱，分别用水和40%、95%乙醇洗脱，收集40%乙醇洗脱液，减压浓缩到适宜浓度后，进行半制备液相色谱分离，乙腈-水（10:90→100:0）梯度洗脱，得到化合物1（3.9 mg）、2（4.6 mg）、3（3.3 mg）和4（3.0 mg）。收集95%乙醇洗脱液，经ODS中压柱色谱进一步分离，使用55%甲醇和纯甲醇溶剂洗脱。收集纯甲醇洗脱液进行减压浓缩后冷冻干燥，得到干燥粉末（28 g）。取0.43 g干燥粉末用甲醇溶解，半制备液相色谱分离，乙腈-水（15:85→100:0）梯度洗脱，得到化合物5（2.8 mg）、6（10.8 mg）、7（1.2 mg）、8（3.0 mg）、9（2.7 mg）和10（2.1 mg）。
3 结构鉴定化合物1：白色粉末。ESI-MS m/z: 417 [M-H]−, 835 [2M-H]−。1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 5.46 (1H, dd, J=12.8, 3.0 Hz, H-2), 3.04 (1H, dd, J=16.9, 12.8 Hz, H-3a), 2.74 (1H, dd, J=16.9, 3.0 Hz, H-3b), 7.73 (1H, d, J=8.7 Hz, H-5), 6.51 (1H, dd, J=8.7, 2.3 Hz, H-6), 6.37 (1H, d, J=2.3 Hz, H-8), 7.44 (2H, d, J=8.6 Hz, H-2′, 6′), 7.15 (2H, d, J=8.7 Hz, H-3′, 5′), 4.94 (1H, d, J=7.5 Hz, H-1″), 3.90 (1H, dd, J=12.1, 2.2 Hz, H-6″a), 3.70 (1H, dd, J=12.1, 5.6 Hz, H-6″b), 3.37~3.49 (4H, m, H-2″~5″)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 80.9 (C-2), 45.1 (C-3), 193.3 (C-4), 115.2 (C-4a), 134.6 (C-5), 112.0 (C-6), 167.0 (C-7), 104.0 (C-8), 165.6 (C-8a), 130.0 (C-1′), 128.9 (C-2′, 6′), 118.0 (C-3′, 5′), 159.4 (C-4′)；glucose: 102.4 (C-1″), 75.1 (C-2″), 78.2 (C-3″), 71.5 (C-4″), 78.4 (C-5″), 62.7 (C-6″)。以上数据与文献报道[11]基本一致，故鉴定化合物1为甘草苷。
化合物2：白色粉末。ESI-MS m/z: 549 [M-H]−, 1 099 [2M-H]−。1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 5.45 (1H, dd, J=13.1, 3.1 Hz, H-2), 3.04 (1H, dd, J=16.9, 12.8 Hz, H-3a), 2.74 (1H, dd, J=17.0, 2.7 Hz, H-3b), 7.73 (1H, d, J=8.7 Hz, H-5), 6.51 (1H, dd, J=8.7, 2.3 Hz, H-6), 6.37 (1H, d, J=2.2 Hz, H-8), 7.44 (2H, d, J=8.4 Hz, H-2′, 6′), 7.12 (2H, d, J=8.7 Hz, H-3′, 5′), 5.00 (1H, d, J=7.5 Hz, H-1″), 3.89 (1H, dd, J=12.1, 2.2 Hz, H-6″a), 3.69 (1H, dd, J=12.0, 5.5 Hz, H-6″b), 3.47~3.67 (4H, m, H-2″~5″), 5.47 (1H, d, J=1.5 Hz, H-1′′′), 3.95 (1H, d, J=1.5 Hz, H-2′′′), 3.55 (2H, d, J=2.3 Hz, H-4′′′), 4.06 (1H, d, J=9.6 Hz, H-5′′′a), 3.80 (1H, d, J=9.5 Hz, H-5′′′b)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 80.9 (C-2), 45.1 (C-3), 193.3 (C-4), 115.2 (C-4a), 130.0 (C-5), 112.0 (C-6), 166.9 (C-7), 104.0 (C-8), 165.6 (C-8a), 134.5 (C-1′), 129.0 (C-2′, 6′), 117.9 (C-3′, 5′), 159.2 (C-4′)；glucose: 101.0 (C-1″), 78.2 (C-2″), 78.2 (C-3″), 71.6 (C-4″), 78.8 (C-5″), 62.7 (C-6″)；apiose: 111.0 (C-1′′′), 78.8 (C-2′′′), 80.9 (C-3′′′), 75.6 (C-4′′′), 66.2 (C-5′′′)。以上数据与化合物1非常相似，仅比化合物1多出1组芹糖信号，参考文献报道[12]，鉴定化合物2为芹糖甘草苷。
化合物3：黄色粉末。ESI-MS m/z: 417 [M-H]−, 835 [2M-H]−。1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 7.69 (1H, d, J=15.3 Hz, H-α), 7.81 (1H, d, J=15.3 Hz, H-β), 7.72 (2H, d, J=8.6 Hz, H-2, 6), 7.16 (2H, d, J=8.7 Hz, H-3, 5), 6.30 (1H, d, J=2.4 Hz, H-3′), 6.42 (1H, dd, J=8.9, 2.4 Hz, H-5′), 7.99 (1H, d, J=8.9 Hz, H-6′), 5.00 (1H, d, J=7.6 Hz, H-1″), 3.91 (1H, dd, J=12.2, 2.3 Hz, H-6″a), 3.71 (1H, dd, J=12.1, 5.7 Hz, H-6″b)；3.38~3.51 (4H, m, H-2″~5″)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 120.3 (C-α), 144.9 (C-β), 193.5 (C=O), 130.7 (C-1), 131.5 (C-2, 6), 118.2 (C-3, 5), 161.2 (C-4), 114.8 (C-1′), 166.8 (C-2′), 104.0 (C-3′), 167.7 (C-4′), 109.4 (C-5′), 133.6 (C-6′)；glucose: 102.0 (C-1″), 75.0 (C-2″), 78.1 (C-3″), 71.5 (C-4″), 78.4 (C-5″), 62.7 (C-6″)。以上数据与文献报道[13]基本一致，故鉴定化合物3为异甘草苷。
化合物4：黄色粉末。ESI-MS m/z: 549 [M-H]−, 1 099 [2M-H]−。1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 7.70 (1H, d, J=15.1 Hz, H-α), 7.81 (1H, d, J=15.3 Hz, H-β), 7.72 (2H, d, J=8.7 Hz, H-2, 6), 7.14 (2H, d, J=8.8 Hz, H-3, 5), 6.30 (1H, d, J=2.4 Hz, H-3′), 6.43 (1H, dd, J=8.9, 2.4 Hz, H-5′), 7.99 (1H, d, J=8.9 Hz, H-6′), 5.06 (1H, d, J=7.5 Hz, H-1″), 3.91 (1H, dd, J=12.2, 2.3 Hz, H-6″a), 3.70 (1H, dd, J=12.2, 5.8 Hz, H-6″b)；3.37~3.69 (4H, m, H-2″~5″), 5.47 (1H, d, J=1.6 Hz, H-1′′′), 3.95 (1H, d, J=1.6 Hz, H-2′′′), 3.54 (2H, d, J=1.4 Hz, H-4′′′), 4.06 (1H, d, J=9.6 Hz, H-5′′′a), 3.80 (1H, d, J=9.6 Hz, H-5′′′b)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 120.3 (C-α), 145.0 (C-β), 193.6 (C=O), 130.7 (C-1), 131.6 (C-2, 6), 118.0 (C-3, 5), 161.1 (C-4), 114.9 (C-1′), 166.7 (C-2′), 104.0 (C-3′), 167.7 (C-4′), 111.0 (C-5′), 133.6 (C-6′)；glucose: 100.7 (C-1″), 78.2 (C-2″), 78.3 (C-3″), 71.5 (C-4″), 78.8 (C-5″), 62.6 (C-6″)；apiose: 109.2 (C-1′′′), 80.9 (C-2′′′), 78.7 (C-3′′′), 75.6 (C-4′′′), 66.2 (C-5′′′)。以上数据与化合物3非常相似，仅比化合物3多出1组芹糖信号，参考文献报道[14]，鉴定化合物4为芹糖异甘草苷。
化合物5：淡黄色粉末。TOF-MS m/z: 351.090 8 [M-H]−。1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 7.93 (1H, s, H-2), 6.23 (1H, d, J=2.1 Hz, H-6), 6.35 (1H, d, J=2.1 Hz, H-8), 6.40 (1H, d, J=8.4 Hz, H-5′), 6.95 (1H, d, J=8.4 Hz, H-6′), 6.68 (1H, d, J=10.0 Hz, H-4″), 5.60 (1H, d, J=10.0 Hz, H-3″), 1.36 (6H, s, 2×CH3)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 156.5 (C-2), 122.1 (C-3), 182.5 (C-4), 106.4 (C-4a), 163.9 (C-5), 100.3 (C-6), 166.1 (C-7), 95.0 (C-8), 159.9 (C-8a), 111.5 (C-1′), 153.3 (C-2′), 111.1 (C-3′), 155.1 (C-4′), 108.5 (C-5′), 132.4 (C-6′), 118.3 (C-4″), 129.7 (C-3″), 77.5 (C-2″), 28.2 (5″/6″-CH3), 27.9 (6″/5″-CH3)。以上数据与文献报道[15]基本一致，故鉴定化合物5为sophoraisoflavone A。
化合物6：黄色粉末。TOF-MS m/z: 353.101 7 [M-H]−。1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 4.58 (1H, dd, J=11.1, 10.0 Hz, H-2), 4.43 (1H, dd, J=11.0, 5.5 Hz, H-2), 4.19 (1H, dd, J=10.0, 5.5 Hz, H-3), 5.89 (1H, d, J=2.2 Hz, H-6), 5.89 (1H, d, J=2.2 Hz, H-8), 6.31 (1H, d, J=8.3 Hz, H-5′), 6.87 (1H, d, J=8.3 Hz, H-6′), 6.65 (1H, d, J=10.0 Hz, H-4″), 5.65 (1H, d, J=9.9 Hz, H-3″), 1.38 (6H, s, 2×CH3)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 71.6 (C-2), 48.3 (C-3), 199.3 (C-4), 103.7 (C-4a), 166.0 (C-5), 97.3 (C-6), 168.5 (C-7), 96.2 (C-8), 165.3 (C-8a), 117.1 (C-1′), 152.3 (C-2′), 112.5 (C-3′), 154.9 (C-4′), 110.0 (C-5′), 130.8 (C-6′), 118.1 (C-4″), 130.6 (C-3″), 76.6 (C-2″), 28.1 (5″/6″-CH3), 28.0 (6″/5″-CH3)。以上数据与文献报道[16]基本一致，故鉴定化合物6为粗毛甘草素F。
化合物7：棕黄色粉末。TOF-MS m/z: 335.104 1 [M-H]−。1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 8.21 (1H, s, H-2), 8.11 (1H, d, J=8.9 Hz, H-5), 6.99 (1H, dd, J=8.5, 2.1 Hz, H-6), 6.90 (1H, d, J=2.2 Hz, H-8), 6.39 (1H, d, J=8.4 Hz, H-5′), 6.99 (1H, d, J=8.4 Hz, H-6′), 6.76 (1H, d, J=10.0 Hz, H-1″), 5.65 (1H, d, J=10.0 Hz, H-2″), 1.41 (6H, s, 2×CH3)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 157.1 (C-2), 124.9 (C-3), 179.8 (C-4), 117.5 (C-4a), 128.8 (C-5), 117.3 (C-6), 165.6 (C-7), 103.3 (C-8), 160.0 (C-8a), 114.3 (C-1′), 153.3 (C-2′), 112.8 (C-3′), 156.1 (C-4′), 110.1 (C-5′), 131.5 (C-6′), 118.6 (C-4″), 130.2 (C-3″), 77.1 (C-2″), 28.2 (2×CH3)。以上数据与文献报道[17]基本一致，故鉴定化合物7为光甘草酮。
化合物8：黄色粉末。ESI-MS m/z: 323 [M-H]−。1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 4.30 (1H, ddd, J=10.2, 3.6, 2.1 Hz, H-2), 3.96 (1H, t, J=10.2 Hz, H-2), 3.42 (1H, m, H-3), 2.94 (1H, dd, J=15.6, 11.2 Hz, H-4), 2.76 (1H, ddd, J=15.6, 5.2, 2.0 Hz, H-4), 6.80 (1H, d, J=8.2 Hz, H-5), 6.27 (1H, d, J=8.3 Hz, H-6), 6.32 (1H, d, J=2.4 Hz, H-3′), 6.26 (1H, dd, J=8.3, 2.9 Hz, H-5′), 6.88 (1H, d, J=8.4 Hz, H-6′), 6.61 (1H, d, J=9.9 Hz, H-4″), 5.57 (1H, d, J=9.9 Hz, H-3″), 1.37 (6H, s, 2×CH3)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 71.6 (C-2), 33.2 (C-3), 31.9 (C-4), 116.4 (C-4a), 131.6 (C-5), 109.6 (C-6), 153.2 (C-7), 111.1 (C-8), 151.2 (C-8a), 120.2 (C-1′), 157.4 (C-2′), 103.8 (C-3′), 158.2 (C-4′), 107.9 (C-5′), 129.9 (C-6′), 118.3 (C-4″), 130.4 (C-3″), 76.7 (C-2″), 28.1 (5″/6″-CH3), 28.0 (6″/5″-CH3)。以上数据与文献报道[18]基本一致，故鉴定化合物8为光甘草定。
化合物9：黄色粉末。TOF-MS m/z: 353.106 9 [M-H]−。1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 6.43 (1H, s, H-8), 8.08 (2H, d, J=8.4 Hz, H-2′, 6′), 6.90 (2H, d, J=8.5 Hz, H-3′, 5′), 3.33 (2H, m, H-1″, 与氘代试剂信号部分重合), 5.24 (1H, t, J=7.3 Hz, H-2″), 1.79 (3H, s, 4″-CH3), 1.67 (3H, s, 5″-CH3)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 147.9 (C-2), 137.2 (C-3), 177.5 (C-4), 104.5 (C-4a), 160.6 (C-5), 112.4 (C-6), 163.6 (C-7), 93.8 (C-8), 156.4 (C-8a), 124.1 (C-1′), 130.8 (C-2′, 6′), 116.5 (C-3′, 5′), 159.3 (C-4′), 22.4 (C-1″), 123.7 (C-2″), 132.1 (C-3″), 26.1 (5″-CH3), 18.0 (4″-CH3)。以上数据与文献报道[15]基本一致，故鉴定化合物9为甘草黄酮醇。
化合物10：棕色粉末。TOF-MS m/z: 369.1805 [M-H]−。1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δ: 4.21 (1H, ddd, J=10.3, 3.5, 1.9 Hz, H-2), 3.96 (1H, t, J=10.1 Hz, H-2), 3.35 (1H, m, H-3), 2.89 (1H, ddd, J=16.0, 5.5, 1.9 Hz, H-4), 2.80 (1H, dd, J=16.0, 10.7 Hz, H-4), 3.69 (3H, s, 5-OCH3), 3.74 (3H, s, 7-OCH3), 6.22 (1H, s, H-8), 6.32 (1H, d, J=2.5 Hz, H-3′), 6.27 (1H, dd, J=8.3, 2.5 Hz, H-5′), 6.89 (1H, d, J=8.3 Hz, H-6′), 3.24 (1H, m, H-1″), 5.14 (1H, t, J=7.1 Hz, H-2″), 1.75 (3H, s, 4″-CH3), 1.65 (3H, s, 5″-CH3)；13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δ: 71.2 (C-2), 32.9 (C-3), 26.9 (C-4), 109.7 (C-4a), 158.4 (C-5), 61.2 (5-OCH3), 116.4 (C-6), 158.7 (C-7), 56.2 (7-OCH3), 96.8 (C-8), 155.3 (C-8a), 120.4 (C-1′), 157.4 (C-2′), 103.8 (C-3′), 158.2 (C-4′), 107.8 (C-5′), 128.9 (C-6′), 23.6 (C-1″), 125.6 (C-2″), 131.1 (C-3″), 26.0 (5″-CH3), 18.0 (4″-CH3)。以上数据与文献报道[19]基本一致，故鉴定化合物10为粗毛甘草素D。
4 抗炎活性评价采用细菌脂多糖（LPS）诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7炎症模型评价化合物抑制NO产生的活性。将RAW264.7细胞接种于96孔板，用MTT法测定各化合物的细胞毒性。确定无毒浓度后，以吲哚美辛（50.0 μmol/L）作阳性对照，用LPS（200 ng/mL）诱导小鼠巨噬细胞RAW264.7模型，以NO抑制率作抗炎活性指标，对各单体化合物进行抗炎活性初筛（n=3），对有抗炎活性的化合物做进一步的量效考察。
实验结果显示，异甘草苷（3）、sophoraisoflavone A（5）、粗毛甘草素F（6）、光甘草定（8）和甘草黄酮醇（9）有较强的抑制NO产生活性，而甘草苷（1）在50.0 μmol/L表现出较弱的NO抑制作用（抑制率为27%），芹糖甘草苷（2，200.0 μmol/L）、芹糖异甘草苷（4，200.0 μmol/L）、光甘草酮（7，50.0 μmol/L）和粗毛甘草素D（10，12.5 μmol/L）未显示有抑制活性。其中对甘草苷、芹糖甘草苷、异甘草苷和芹糖异甘草苷的实验结果分析可知，化合物结构中增加糖单元（芹糖），会降低对NO的抑制作用。对具有抑制NO产生活性的化合物3、5、6、8、9进行量效关系考察，根据毒性实验结果确定各化合物浓度梯度，结果见图 1，其半数抑制浓度（IC50）值依次为（14.0±1.8）、（70.3±4.0）、（26.5±2.0）、（22.4±2.0）、（17.0±2.1）μmol/L。与阳性对照吲哚美辛IC50（31.6±2.0）μmol/L[20]相比，化合物3、6、8、9有更好的抑制NO产生活性。
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图 1 化合物3、6、8、9抑制NO产生活性的量效结果 Fig.1 Dose-effect result of inhibitory effect of compounds 3, 5, 6, 8, and 9 on NO production |
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