小远志Polygala sibirica L. var. megalopha Fr.是云南一种民间药用植物，主要用于解热散寒和祛风止痛^[1]。文献报道其中主要成分为黄酮类化合物^[2-3]。本课题组前期研究工作中将小远志75%乙醇提取物通过D101大孔树脂柱色谱，依次用水和35%、65%、95%乙醇洗脱，并采用尿酸生成法来测定4部分洗脱物对黄嘌呤氧化酶（XO）的抑制活性。表 1显示65%乙醇洗脱物有更高的抗XO的活性。当样品质量浓度达到10.5 μg/mL时，其抑制率超过了50%，而其他的洗脱物活性稍低。同时，当样品质量浓度降低至1.75 μg/mL时，其余提取物抑制率已经不显著，而65%醇洗脱物仍然具有31.6%的抑制率。因此，本实验对体外XO抑制活性较高的小远志65%乙醇洗脱物进行化学成分的分离，以期发现其中对XO抑制率更高的单体化合物。通过分离纯化，结合活性追踪，得到4个对XO有较高抑制活性的糖酯类化合物，分别鉴定为远志寡糖酯A（tenuifoliside A，1）、3, 6′-二芥子酰基蔗糖（3, 6′-disinapoyl sucrose，2）、3′-E-3, 4, 5-三甲氧基肉桂酰基-6-苯基蔗糖（3′-E-3, 4, 5-trimethoxycinnamoyl-6-benzoyl sucrose，3）、3′-E-3, 4, 5-三甲氧基肉桂酰基-4-苯基蔗糖（3′-E-3, 4, 5-trimethoxycinnamoyl-4-benzoyl sucrose，4），均为首次从该植物中分离得到。

表 1(Table 1)

表 1 小远志各洗脱部分体外抗XO活性(x±s, n=3) Table 1 In vitro inhibitory activity of elution parts against XO (x±s, n=3) 溶剂 质量浓度a/ (μg·mL-1) 抑制率/% IC50b/ (μg·mL-1) 水  1.75  4.97±1.50 26.61  3.50 13.53±1.40  7.00 16.23±1.60 10.50 29.68±2.20 35%乙醇  1.75 11.78±2.00 12.62  3.50 14.02±2.10  7.00 34.32±2.00 10.50 45.85±2.30 65%乙醇  1.75 31.60±1.00 10.83  3.50 34.88±1.20  7.00 40.50±1.30 10.50 53.69±1.50 95%乙醇  1.75 12.26±3.60 10.91  3.50 20.56±2.70  7.00 36.25±1.50 10.50 50.48±3.40 a-所有样品均溶于DMSO b-P＜0.05，下同 a-all samples were disolved in DMSO b-P < 0.05, same as below

表 1 小远志各洗脱部分体外抗XO活性(x±s, n=3) Table 1 In vitro inhibitory activity of elution parts against XO (x±s, n=3)

糖酯类物质具有一定的生物活性，如抗菌^[4]、免疫调节^[5]等，但是对于抗XO的活性未见报道。XO高效抑制剂有助于减少尿酸的生成，能够缓解和治疗痛风症状^[6]。本实验分离得到的糖酯类化合物与对照品别嘌呤醇相比较，对XO有更好的抑制活性，同时作为天然来源的化合物，避免了别嘌呤醇严重的副作用^[7]，为进一步开发新的抗痛风药物奠定了基础。

Bruker AM-500兆超导核磁共振仪（Bruker公司）；Bruker HTC/Esquire spectrometer型LC-MS（Bruker公司）；Agilent 1100高效液相色谱仪（Agilent公司）；半制备色谱柱为ZORBAX SB-C₁₈反相柱（Agilent公司）；UV-2450紫外可见分光光度计（北京岛津仪器有限公司）。薄层色谱硅胶板GF₂₅₄板和柱色谱硅胶为青岛海洋化工厂产品；凝胶Sephadex LH-20（Amershm生科公司）；反相填充材料RP₁₈（40~60 μm，Merck公司）。XO（批号1001669570）溶于牛奶中，购于西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；别嘌呤醇（批号HFBM160120319003），黄嘌呤（批号HX0429）购于合肥博美生物有限公司。

小远志Polygala sibirica L. var. megalopha Fr.干燥全草5 kg，2012年8月采自云南省昭通市永善县。由西南林业大学杜凡教授鉴定，标本（2012010）保存在西南林业大学林学院植物资源利用系药用植物教研室。

小远志干燥全草约5 kg，粉碎后用75%乙醇回流提取3次，合并提取液，减压浓缩回收乙醇，得到浸膏1.7 kg。浸膏用温水溶解后，经D101大孔吸附树脂柱色谱，依次用水和35%、65%及95%乙醇洗脱。65%乙醇洗脱液回收溶剂后得到480 g粗提样品。样品经硅胶柱色谱，用氯仿-甲醇（1:0→0:1）梯度洗脱，得到了7个组分Fr. 1（31 g）、2（56 g）、3（47 g）、4（57 g）、5（122 g）、6（13 g）、7（106 g）。Fr. 2经硅胶柱色谱（氯仿-甲醇9:1→0:1）梯度洗脱，得到3个组分A、B和C。B（40 g）经RP₁₈（甲醇-水30:70→70:30）洗脱后得到11个部分。B4部分（0.2 g）经过硅胶柱色谱（氯仿-甲醇20:1→1:1）洗脱得到12个部分，B4-7经Sephadex LH-20（氯仿-甲醇1:1）除掉部分色素后，再经过半制备型HPLC分离，乙腈-水（47:53）洗脱，得到化合物1（126 mg）、2（25 mg）。Fr. 4经过硅胶柱色谱（氯仿-甲醇10:1→0:1）洗脱得到10个部分（A~J）。E部分（10 g）经过RP₁₈（甲醇-水20:80→70:30）洗脱后，得到14个部分。E1（161 mg）经半制备型HPLC分离，乙腈-水（10:90）洗脱，依次得到化合物3（25 mg）、4（17 mg）。化合物结构见图 1。

图 1 化合物1~4的结构 Fig.1 Structures of compounds 1-4

化合物1：白色无定形粉末，根据负离子ESI-MS谱给出准分子离子峰m/z: 681 [M-H]^-，结合¹³C-DEPT NMR谱，推测分子式为C₃₁H₃₈O₁₇，不饱和度为13。¹H-NMR (500 MHz, Pyridine-d₅) δ: 7.89 (1H, d, J=8.4 Hz, H-3′′′, 5′′′), 7.71 (1H, d, J=15.9 Hz, H-7″), 6.54 (1H, d, J=15.9 Hz, H-8″), 6.95 (2H, s, H-2″, 6″), 6.81 (1H, d, J=8.4 Hz, H-2′′′, 6′′′), 5.49 (1H, d, J=3.6 Hz, H-1), 3.86 (6H, s, OMe), 3.78 (3H, s, OMe)；¹³C-NMR (125 MHz, Pyridine-d₅) δ: 166.7 (C-7′′′), 166.3 (C-9″), 163.5 (C-4′′′), 154.0 (C-3″, 5″), 145.7 (C-7″), 140.7 (C-4″), 132.4 (C-2′′′, 6′′′), 130.3 (C-1″), 121.4 (C-1′′′), 117.6 (C-8″), 116.0 (C-3′′′, 5′′′), 106.2 (C-2″, 6″), 104.7 (C-2′), 93.0 (C-1), 84.6 (C-5′), 79.8 (C-3′), 75.0 (C-3), 73.6 (C-4′), 73.1 (C-2), 72.3 (C-5), 71.1 (C-4), 65.6 (C-1′), 64.5 (C-6), 62.7 (C-6′), 56.1, 60.5 (OMe)。以上光谱数据与文献报道^[4]基本一致，故鉴定化合物1为远志寡糖酯A。

化合物2：白色无定形粉末，根据负离子ESI-MS谱给出准分子离子峰m/z: 753 [M-H]^-，结合¹³C-DEPT NMR谱，推测分子式为C₃₄H₄₂O₁₉，不饱和度为14。¹H-NMR (500 MHz, Pyridine-d₅) δ: 7.70 (1H, d, J=15.9 Hz, H-7″), 7.63 (1H, d, J=15.9 Hz, H-7′′′), 7.05 (2H, s, H-2″, 6″), 7.03 (4H, s, H-2′′′, 6′′′), 6.54 (1H, d, J=15.9 Hz, H-8″), 6.45 (1H, d, J=15.9 Hz, H-8′′′), 5.48 (1H, d, J=3.3 Hz, H-1), 3.87 (6H, s, OMe), 3.85 (6H, s, OMe)；¹³C-NMR (125 MHz, Pyridine-d₅) δ: 167.6 (C-9″), 166.7 (C-9′′′), 149.1 (C-3″, 3′′′, 5″, 5′′′), 146.5 (C-7″), 145.9 (C-7′′′), 140.4 (C-4″, 4′′′), 125.1 (C-1″), 125.0 (C-1′′′), 115.4 (C-8″), 115.1 (C-8′′′), 106.8 (C-2″, 6″), 106.6 (C-2′′′, 6′′′), 104.7 (C-2′), 92.7 (C-1), 84.7 (C-5′), 79.3 (C-3′), 75.2 (C-3), 74.0 (C-2), 73.1 (C-4′), 72.2 (C-5), 71.6 (C-4), 65.7 (C-1′), 65.1 (C-6), 63.3 (C-6′), 56.2, 56.3 (OMe)。以上数据与文献报道^[4]基本一致，故鉴定化合物2为3, 6′-二芥子酰基蔗糖。

化合物3：白色无定形粉末，根据正离子ESI-MS谱给出准分子离子峰m/z: 689 [M+Na]⁺，结合¹³C-DEPT NMR谱，推测分子式为C₃₁H₃₈O₁₆，不饱和度为13。¹H-NMR (500 MHz, CD₃OD) δ: 7.71 (1H, d, J=15.9 Hz, H-7″), 6.54 (1H, d, J=15.9 Hz, H-8″), 6.95 (2H, s, H-2″, 6″), 5.48 (1H, d, J=3.6 Hz, H-1), 3.86 (6H, s, OMe), 3.78 (3H, s, OMe)；¹³C-NMR (125 MHz, CD₃OD) δ: 168.0 (C-7′′′), 167.7 (C-9″), 154.8 (C-3″, 5″), 147.2 (C-7″), 141.2 (C-4″), 134.3 (C-4′′′), 131.4 (C-1″), 131.2 (C-1′′′), 130.7 (C-3′′′, 5′′′), 129.6 (C-2′′′, 6′′′), 117.7 (C-8″), 106.8 (C-2″, 6″), 104.8 (C-2′), 93.1 (C-1), 84.1 (C-5′), 79.6 (C-3′), 74.9 (C-3), 74.0 (C-4′), 73.0 (C-2), 72.4 (C-5), 71.5 (C-4), 65.5 (C-1′), 65.5 (C-6), 63.4 (C-6′), 56.6, 61.1 (OMe)。以上数据与文献报道^[8]基本一致，故鉴定化合物3为3′-E-3, 4, 5-三甲氧基肉桂酰基-6-苯基蔗糖。

化合物4：白色无定形粉末，根据正离子ESI-MS谱给出准分子离子峰m/z: 689 [M+Na]⁺，结合¹³C-DEPT NMR谱，推测分子式为C₃₁H₃₈O₁₆，不饱和度为13。¹H-NMR (500 MHz, CD₃OD) δ: 7.72 (1H, d, J=15.9 Hz, H-7″), 6.54 (1H, d, J=15.9 Hz, H-8″), 6.93 (2H, s, H-2″, 6″), 5.47 (1H, d, J=3.6 Hz, H-1), 3.86 (6H, s, OMe), 3.78 (3H, s, OMe)；¹³C-NMR (125 MHz, CD₃OD) δ: 168.0 (C-7′′′), 167.8 (C-9″), 154.8 (C-3″, 5″), 147.2 (C-7″), 141.2 (C-4″), 134.3 (C-4′′′), 131.5 (C-1″), 131.3 (C-1′′′), 130.7 (C-3′′′, 5′′′), 129.6 (C-2′′′, 6′′′), 117.8 (C-8″), 106.8 (C-2″, 6″), 104.9 (C-2′), 93.1 (C-1), 84.1 (C-5′), 79.6 (C-3′), 74.9 (C-3), 74.0 (C-4′), 73.2 (C-2), 72.4 (C-5), 76.6 (C-4), 65.6 (C-1′), 60.8 (C-6), 63.4 (C-6′), 56.7, 61.2 (OMe)。以上数据与文献报道^[8]基本一致，故鉴定化合物4为3′-E-3, 4, 5-三甲氧基肉桂酰基-4-苯基蔗糖。

抗XO活性实验参考文献方法^[9]进行改进。按照表 2顺序依次加入不同试样（其中供试样浓度分别预先配制成1.75、3.50、7.00、10.50 μg/mL），混合均匀，水浴温度为25 ℃，反应时间30 min，用紫外分光光度计测定各处理样品，在290 nm处检测吸光度（A）值。根据以下公式计算不同质量浓度样品对XO的抑制率（表 3）。其中，A₁~A₄为实验处理1~4在290 nm处的A值。

表 2(Table 2)

表 2 抗XO试验反应体系 Table 2 Reaction system of XO inhibiting test 处理 供试样品 (不同质量浓度)/μL PBS缓冲液 (pH 7.4)/μL XO (0.04 U/mL)/μL 黄嘌呤溶液 (0.48 mmol/L)/μL 1 200   200     0     0 2 800 1 300 1 000 1 125 3 500     0   500     0 4 500   500   500   500

表 2 抗XO试验反应体系 Table 2 Reaction system of XO inhibiting test

表 3(Table 3)

表 3 糖酯与对照品别嘌呤醇体外抗XO活性(x±s, n=3) Table 3 In vitro inhibitory activity of glycolipids and allopurinol against XO (x±s, n=3) 化合物 样品浓度a/ (μg·mL-1) 抑制率/ % IC50b/ (μmol·mL-1) 1  1.75 20.51±2.70  9.5  3.50 33.24±1.90  7.00 52.12±1.50 10.50 62.34±2.30 2  1.75 68.31±1.70  1.3  3.50 70.68±1.40  7.00 89.92±2.50 10.50 91.94±0.90 3  1.75 19.11±1.30 10.2  3.50 31.63±2.40  7.00 51.32±2.00 10.50 61.90±0.10 4  1.75 27.36±1.70  7.7  3.50 38.18±1.90  7.00 57.22±0.50 10.50 68.14±0.80 别嘌呤醇  1.75 53.45±2.50 11.2  3.50 82.02±1.40  7.00 93.81±0.50 10.50 97.75±0.80

表 3 糖酯与对照品别嘌呤醇体外抗XO活性(x±s, n=3) Table 3 In vitro inhibitory activity of glycolipids and allopurinol against XO (x±s, n=3)

表 3显示了4个糖酯与对照品别嘌呤醇体外抗XO活性。化合物1、3、4的抑制活性（IC₅₀分别为9.5、10.2、7.7 μmol/L）比对照品别嘌呤醇（IC₅₀=11.2 μmol/L）略高，而化合物2（IC₅₀=1.3 μmol/L）则显示了比对照品更高的抑制活性。结合结构，推测其中的苯乙烯基与糖基相连的片段在空间上与XO有较高的适应性，可以与黄嘌呤竞争，从而起到抑制尿酸生成的作用。化合物2相比其他3个糖酯类化合物，可能由于分子中含有2个起效片段，其抑制效果更强。

本实验根据活性追踪，分离得到了4个对XO有较强抑制活性的糖酯类化合物，并初步对构效关系提出了一些假设，为进一步研究构效关系提供了方向。这一类新型的高效抗XO的化合物，也有着进一步被开发成治疗痛风药物的潜力。