2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.22.016 |
2. 吉林大学白求恩医科大学第二附属医院 骨科, 吉林 长春 130021
2. Department of Orthopedics, Second Affitialed Hospital of Bethume Medical University, Jilin University, Changchun 130021, China
糖皮质激素广泛应用于慢性阻塞性肺病、哮喘、风湿免疫性疾病、炎性肠病等多种疾患及器官移植后的治疗[1, 2]。除了直接减少成骨细胞的数量和活性以外，糖皮质激素还可减少钙在胃肠道的吸收，加速钙由肾脏排泄，通过减少性激素分泌，抑制胰岛素样生长因子和前列腺素，产生及影响甲状旁腺激素等环节导致骨量减少[3, 4]。随着糖皮质激素广泛用于临床，糖皮质激素性骨质疏松症（glucocorticoid- induced osteoporosis，GIOP）发病率剧增，仅次于绝经后及老年性骨质疏松症[5, 6]。因此，如何对GIOP进行有效防治已成为临床医生和科研工作者亟待解决的重要课题，其发病机制也越来越得到重视。
鹿骨是常用的中药之一，有着人们所不熟知的一些特殊的功效，鹿骨中含有大量蛋白质、骨胶原、磷脂质、软骨素和磷蛋白，有益于骨形成，促进体内胶原蛋白及弹性蛋白的更新，延缓骨吸收，促进软骨内骨化等过程[7, 8]。此外，鹿骨中亦含有大量矿物质，如钙、镁、铁、锌、钾、铜、磷、硒等，以维持血清中钙、磷、镁等离子的浓度和比例，为骨的再生提供一个适宜的微环境[8]。骨提取物中主要成分骨多肽具有水溶性强、活性高的特点而备受关注。本研究通过建立地塞米松诱导的大鼠骨质疏松模型，观察鹿骨多肽对大鼠骨质疏松模型预防及治疗作用，利用血清学和组织形态学指标来评价其治疗效果，预期鹿骨多肽能够延缓骨吸收、促进骨形成，起到预防及治疗GIOP的作用。
1 材料 1.1 实验动物Wistar大鼠，雄性，2个半月龄，体质量（350±20）g，清洁级，由吉林大学亿斯实验动物中心提供，实验动物许可证号SCXK-（吉）20140003。
1.2 药品与试剂梅花鹿Cervus nippon Temminck鹿骨（批号201505，经吉林市食品药品检验所王维礼主任药师鉴定）购于吉林市龙潭山鹿业有限责任公司；地塞米松（批号1501212111）为辰欣药业股份有限公司生产；复方鹿茸健骨胶囊（批号14110131）为白求恩医科大学制药厂生产；骨钙素（BGP）、甲状旁腺激素（PTH）、碱性磷酸酶（ALP）、降钙素（CT）、钙（Ca2+）ELISA检测试剂盒，均为基尔顿生物科技（上海）有限公司产品；其他化学试剂均为分析纯。
1.3 实验仪器microCTμ100扫描仪，瑞士Scanco公司；酶标仪，芬兰Labsystems Multiskan MS公司；URIT-8021A生化自动分析仪，优利特电子集团有限公司。
2 方法 2.1 鹿骨多肽的制备新鲜鹿骨股骨称质量后，清洗剃除毛和脂肪，60 ℃整骨烘干后，将骨打碎成3～5 cm小块，取500 g加1 000 mL蒸馏水浸泡2 h，置于压力蒸汽灭菌器中，于121 ℃提取1 h。后用滤布滤过，滤液冷却除脂，收取滤液。滤渣按上述条件再提取1次，合并2次滤液浓缩至500 mL。浓缩液于4 ℃下静置12 h，去除上层油脂，滤过，先用胃蛋白酶以酶与底物1∶50（质量体积比）在37 ℃ pH 2的条件下酶解5 h，然后再用胰蛋白酶以酶与底物1∶50（质量体积比）在37 ℃ pH 8的条件下再次酶解5 h后得鹿骨多肽，酶解液经喷雾干燥得鹿骨多肽干粉48.2 g，经测定鹿骨多肽干粉中含蛋白质为58.6%，水解度为13.9%。
2.2 动物分组及处理将48只Wistar 雄性大鼠随机分为6组：对照组，模型组，鹿骨多肽高、中、低剂量（250、125、62.5 mg/kg）组，阳性药复方鹿茸健骨胶囊组，每组各8只大鼠。除对照组外，其他5组大鼠im地塞米松2.5 mg/kg，每周2次，对照组im等体积的生理盐水。造模同时，鹿骨多肽各组分别ig给予鹿骨多肽250、125、62.5 mg/kg，阳性药组ig复方鹿茸健骨胶囊（胶囊内容物以双蒸水溶解）540 mg/kg，对照组和模型组ig等量生理盐水，各组均每天给药1次，连续75 d。
2.3 血清生化指标的检测末次给药后采用大鼠麻醉后腹主动脉取血法，所取全血静置后，经2 000 r/min离心10 min后取血清，−20 ℃冰冻保存备用。测定前置室温复融均匀，取上清测定。利用酶联免疫法，按照试剂盒说明书操作步骤检测大鼠血清中Ca2+、CT、BGP、PTH、ALP水平；利用生化自动分析仪检测血清磷（P3+）水平。
2.4 microCT检测各组大鼠处死后迅速取出右侧胫骨，去除附着的软组织，然后将骨组织置于4%多聚甲醛溶液中固定。将标本放入样品杯中并固定好，在相同条件（扫描电压70 kV，扫描电流200 μA，层距14.80 μm，平面分辨率300 ms，连续扫描约808层）下扫描。扫描完成后，选取胫骨膨大处及骨干区域作为感兴趣区，设定三维重建阈值后对各标本感兴趣区行三维重建，分析总体积（TV）、骨体积（BV）、骨体积/总体积（BV/TV）、骨小梁数量（Tb.N）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分离度（Tb.Sp）、骨表面积/骨体积（BS/BV）。
2.5 HE染色给药结束后，将各组大鼠处死，取左股骨远端1/3，除净周围附着的组织，然后将骨组织置于4%多聚甲醛溶液中固定，包埋，切片、染色，制作不脱钙骨切片。
2.6 统计学分析数据采用SPSS Statistics V21.0统计软件进行方差分析及检验，以x±s表示。
3 结果 3.1 对GIOP模型大鼠一般状态及体质量的影响在实验期间，模型组大鼠逐渐出现毛色无光泽、懒动、少食等现象，而对照组和鹿骨多肽高、中剂量组大鼠皮毛光泽较好，活动如常；与对照组相比，模型组大鼠体质量明显降低（P＜0.05）；与模型组大鼠相比，鹿骨多肽中、高剂量组大鼠体质量明显恢复（P＜0.05），见表 1。
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表 1 鹿骨多肽对GIOP模型大鼠体质量的影响 (x±s,n = 8) Table 1 Effects of deer bone polypeptides on body weight of rats with GIOP (x±s,n = 8) |
3.2 对GIOP模型大鼠血清Ca2+、P3+、ALP的影响
模型组大鼠血清Ca2+下降，而P3+、ALP明显增高，与对照组比较差异显著（P＜0.05）；鹿骨多肽高剂量组和阳性药物组血清Ca2+有不同程度的增加，P3+明显下降，与模型组比较差异显著（P＜0.05），而鹿骨多肽高剂量组血清ALP明显下降（P＜0.05），见表 2。
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表 2 鹿骨多肽对GIOP模型大鼠血清Ca2+、P3+、ALP的影响 (x±s,n = 8) Table 2 Effects of deer bone polypeptides on serum Ca2+ and P3+ levels and ALP activities in rats with GIOP (x±s,n = 8) |
3.3 对GIOP模型大鼠血清PTH、BGP、CT的影响
与对照组比较，模型组大鼠血清PTH水平显著升高（P＜0.05），BGP水平显著降低（P＜0.05）；与模型组比较，鹿骨多肽高、中剂量组大鼠血清PTH水平明显降低（P＜0.05），血清BGP水平显著升高（P＜0.05）；鹿骨多肽组虽有降低血清CT的趋势，但与模型组比较未见统计学意义。见表 3。
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表 3 鹿骨多肽对GIOP模型大鼠血清PTH、BGP、CT水平的影响 (x±s,n = 8) Table 3 Effects of deer bone polypeptides on serum PTH,BGP,and CT levels in rats with GIOP (x±s,n = 8) |
3.4 对GIOP模型大鼠骨微结构的影响
与对照组比较，模型组大鼠骨微结构指标Tb.N、BV/TV显著降低（P＜0.05），而Tb.Sp、BS/BV显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，鹿骨多肽高剂量组胫骨近端的Tb.N、BV/TV均明显升高（P＜0.05），Tb.Sp、BS/BV均明显降低（P＜0.05），各组Tb.Th无明显变化，见表 4。
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表 4 鹿骨多肽对GIOP大鼠骨微结构的影响 (x±s,n = 8) Table 4 Effects of deer bone polypeptides on bone microstructure in rats with GIOP (x±s,n = 8) |
3.5 对GIOP模型大鼠骨组织形态学的影响
大鼠左股骨远端1/3病理切片光境检查显示，与对照组比较，模型组骨小梁数目明显减少，稀疏断裂，大部分不能连接成网状，骨髓腔明显增大，骨小梁结构出现较大的空白区域，且可见大量脂肪细胞。而鹿骨多肽组股骨骨小梁明显宽厚，数目也显著增加，骨小梁断裂与脂肪细胞少见，骨小梁光滑，接近对照组。见图 1。
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图 1 各组大鼠骨组织HE染色 Fig.1 HE staining of bone tissue of rats in each group |
4 讨论
长期大剂量使用糖皮质激素不仅可抑制成骨细胞增殖，促进其凋亡，减少骨骼中活性成骨细胞成分，导致骨生成能力下降，而且可使成骨细胞不能正常募集到骨侵蚀表面，使得被破骨细胞吸收的骨面未能及时被修复，造成骨质丢失，导致骨质疏松。由于激素所致骨量丢失主要是抑制骨形成为主，因此，遏制激素引起的骨质丢失，关键在于刺激骨形成、促进骨量增加[9, 10]。
本研究利用地塞米松im大鼠75 d后，模型组大鼠血清BGP明显降低，骨矿物质分解，钙从骨骼流失增加，骨代谢紊乱。病理结果显示骨小梁稀疏变薄、断裂，骨髓腔扩大，脂肪细胞增加，骨密度降低，说明GIOP大鼠模型已复制成功。血清学评价结果提示，模型组血清Ca2+明显下降，是由于短时间内应用较大剂量糖皮质激素，抑制不同胃肠道部位的钙离子吸收。尤其在十二指肠，糖皮质激素抑制钙离子的跨细胞转运，降低钙结合蛋白合成，进而使肠内钙离子的吸收减少。并且糖皮质激素抑制肾小管对钙离子的重吸收并产生高钙尿症，导致尿中钙排泄的增加。这种负钙平衡引起代偿性增加血清P3+和PTH水平[11]。若造模同时给予鹿骨多肽，血清生化检查各指标有所改善，即血清Ca2+有不同程度的提高，血清P3+和PTH则有明显下降。这些结果表明鹿骨多肽能够抑制地塞米松引起的钙磷代谢失衡。
ALP是一种磷酸单酯酶，骨骼中的ALP由成骨细胞分泌，主要集中在骨化部位，即在骨骺线和骨膜下[12]。BGP来源于骨组织，由成骨细胞合成并分泌到骨中，是骨组织中非胶原性蛋白的主要成分，约占骨质蛋白的3%，其作用是调节和维持骨钙。BGP 2/3与轻磷灰石结晶结合，沉积于骨基质，1/3进入血液循环。因此，血清中BGP浓度可特异性地反映它的“母体”成骨细胞的活性[13]。由于在骨吸收过程中，基质中的BGP又可释放到血液，所以综合来讲，BGP是评价骨形成和骨转换率的特异性指标。ALP、BGP均为骨形成生化指标，ALP、BGP水平反映了骨形成水平。CT主要由甲状腺C细胞合成和分泌的一种激素，对骨代谢有重要的调节作用，通过受体介导作用能抑制破骨细胞的活性[14]。本实验用ELISA法检测了各组大鼠血清中ALP、BGP和CT的量，鹿骨多肽组血清ALP降低，BGP升高，同时也有降低CT的趋势，提示鹿骨多肽具有抑制骨吸收，降低骨转化率，使骨形成加强，进而减少骨量丢失的作用。
骨组织显微结构退化是骨质疏松症的重要特征。骨小梁的数量、密度和空间构象等显微结构影响着骨的生物力学特性，因此骨显微结构的改变可以更直接地反映骨质疏松的情况。骨组织病理学检测是反映骨显微结构变化的最直接的依据，评价骨显微结构的金标准[15]。而MicroCT是一种体外无损伤测量技术，适用于药物治疗后骨小梁结构的三维分析。本研究同时采用组织病理学检测和MicroCT分析，发现模型组大鼠骨小梁变细、中断、游离端增多，数量减少，间隙增宽，空间结构破坏增加，而鹿骨多肽的干预能明显改善上述骨显微结构指标，提示鹿骨多肽对改善显微结构具有一定的疗效。
以上实验均证明了鹿骨多肽可抑制骨吸收和促进骨形成，具有防治GIOP的作用。鹿骨多肽能够抑制糖皮质激素诱导的钙磷代谢失衡，降低ALP，升高BGP，抑制骨吸收和促进骨形成。并且改善GIOP大鼠病理学改变和显微结构，发挥对骨的保护作用。
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