2016, Vol. 47
表 1(Table 1)
SIRT1/NF-κB信号轴在人参皂苷Rg1延缓D-半乳糖致衰老模型大鼠造血干/祖细胞衰老过程中的作用
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.22.014 |
李渊, 周玥, 王亚平, 王建伟, 何颖红, 丁继超, 赵文珍, 杨勇琴, 王慧杰 . SIRT1/NF-κB信号轴在人参皂苷Rg1延缓D-半乳糖致衰老模型大鼠造血干/祖细胞衰老过程中的作用[J]. 中草药, 2016, 47(22): 4016-4020.
LI Yuan, ZHOU Yue, WANG Ya-ping, WANG Jian-wei, HE Ying-hong, DING Ji-chao, ZHAO Wen-zhen, YANG Yong-qin, WANG Hui-jie . Effect of SIRT1/NF-κB signal axis on delaying hematopoietic stem cell and progenitor cell senescence with ginsenoside R1 in aging model rat induced by D-galactose[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2016, 47(22): 4016-4020 .
SIRT1/NF-κB信号轴在人参皂苷Rg1延缓D-半乳糖致衰老模型大鼠造血干/祖细胞衰老过程中的作用
1. 大理大学 组织学与胚胎学教研室, 云南省细胞生物学重点实验室, 云南 大理 671000
;
2. 重庆医科大学 干细胞与组织工程研究室, 组织学与胚胎学教研室, 重庆 400016
2. 重庆医科大学 干细胞与组织工程研究室, 组织学与胚胎学教研室, 重庆 400016
摘要:
目的
探讨SIRT1/NF-κB信号轴在人参皂苷Rg1对抗衰老模型大鼠造血干/祖细胞衰老中的作用。
方法
6~8周雄性SD大鼠50只，随机分为对照组、模型组、人参皂苷Rg1对照组、人参皂苷Rg1治疗组和人参皂苷Rg1预防组，每组10只。以连续42 d sc D-半乳糖（D-gal）制备衰老动物模型，人参皂苷Rg1各组ip给药不同时间，药物注射完成第2天，免疫磁性分选法分离纯化各组Sca-1+造血干/祖细胞（HSC/HPC），衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色、流式细胞周期分析和造血祖细胞混合集落（CFU-Mix）培养观察人参皂苷Rg1对Sca-1+ HSC/HPC抗衰老的生物学作用。荧光定量PCR及Western blotting检测衰老调控分子SIRT1、NF-κB mRNA及蛋白的表达。
结果
与模型组比较，人参皂苷Rg1治疗组和预防组SA-β-Gal染色阳性率、G0/G1期细胞比例下降，生成CFU-Mix数增高，SIRT1 mRNA及蛋白表达上调，NF-κB mRNA及蛋白表达下调；人参皂苷Rg1预防组各指标变化均较人参皂苷Rg1治疗组明显。
结论
SIRT1/NF-κB信号轴在人参皂苷Rg1对抗D-gal致衰老模型大鼠HSC/HPC衰老过程中发挥重要作用，人参皂苷Rg1具有抗HSC/HPC衰老作用。
关键词:
人参皂苷Rg1
去乙酰化酶沉默调节因子1
核转录因子-κB
造血干/祖细胞
衰老
Effect of SIRT1/NF-κB signal axis on delaying hematopoietic stem cell and progenitor cell senescence with ginsenoside R1 in aging model rat induced by D-galactose
LI Yuan1
, ZHOU Yue1
, WANG Ya-ping2, WANG Jian-wei2, HE Ying-hong1, DING Ji-chao1, ZHAO Wen-zhen1, YANG Yong-qin1, WANG Hui-jie1
, ZHOU Yue1, WANG Ya-ping2, WANG Jian-wei2, HE Ying-hong1, DING Ji-chao1, ZHAO Wen-zhen1, YANG Yong-qin1, WANG Hui-jie1
1. Key Laboratory of Cell Biology, Department of Histology and Embryology, Dali University, Dali 671000, China
;
2. Laboratory of Stem Cell and Tissue Engineering, Department of Histology and Embryology, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
2. Laboratory of Stem Cell and Tissue Engineering, Department of Histology and Embryology, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
Abstract:
Objective
To investigate the effect of SIRT1/NF-κB signal axis on delaying hematopoietic stem cell and progenitor cell senescence with ginsenoside Rg1 in ageing model rat induced by D-galactose.
Methods
Male SD rats (n=40) aging from 6 to 8 weeks old were randomly divided into control group, aging model group, positive control group, Rg1 treated group, and Rg1 prevented group (n=10). The aging rat model was prepared by sc D-galactose for continuous 42 d, then ginsenoside Rg1 was given in different time. After 2 d of the treatment, the Sca-1+ HSC/HPC was isolated by magnetic cell sorting (MACS). The changes of cells observed by senescence-associated β-galactosidase (SA-β-Gal) staining, cell cycle analysis and culture of mixed hematopoietic progenitor cell were used to investigate the treated aging effect of ginsenoside Rg1.The expression of senescence associated SIRT1, NF-κB mRNA and protein was examined by real time fluorescence quantitative PCR (FQ-PCR) and Western blotting.
Results
In ginsenoside Rg1 treated group and ginsenoside Rg1 prevented group, the percentage of positive cells expressed SA-β-Gal and the number of cells entering G0/G1 phase were lower than that of aging model group, but the number of CFU-Mix was increased than aging model group. Compared with aging model group, the expression of SIRT1 mRNA and protein was upregulated and the expression of NF-κB mRNA and protein was downregulated in Rg1 treated group and prevented group. Changes in Rg1 prevented group were more than those in Rg1 treated group.
Conclusion
SIRT1/NF-κB signal axis may play a key role in the anti-aging effect of Rg1 to Sca-1+ HSC/HPC senescence in ageing model rat induced by D-galactose.
Key words:
ginsenoside Rg1
SIRT1
NF-κB
Sca-1+ HSC/HPC
senescence
细胞衰老被认为是细胞和组织损伤的累积所导致，其中活性氧（ROS）是引起细胞损伤最主要的原因，去乙酰化酶SIRT1（沉默调节因子1）在线粒体调控及清除ROS过程中发挥重要功能，SIRT1通过抑制核转录因子-κB（NF-κB）通路，缓解细胞内ROS的负荷而延缓细胞的衰老[1-2]。
人参皂苷Rg1是人参重要的活性成分，具有补气生血、延缓衰老等功效[3]，本课题组前期研究发现人参皂苷Rg1在体内、外均具有延缓造血干/祖细胞（HSC/HPC）衰老的作用，但其靶向调控分子仍不清楚。本研究将人参皂苷Rg1作用于D-半乳糖（D-gal）致大鼠衰老模型，检测人参皂苷Rg1对衰老模型大鼠Sca-1+ HSC/HPC衰老的作用，探讨SIRT1/NF-κB信号轴在人参皂苷Rg1延缓HSC/HPC衰老中的调控作用，为探寻延缓HSC衰老及机体衰老的途径提供理论及实验依据。
1 材料 1.1 实验动物雄性SD大鼠，3月龄，体质量210～250 g，由重庆医科大学实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（渝）2007-0001。
1.2 药品与试剂人参皂苷Rg1（吉林宏久生物科技有限公司，质量分数＞95%，批号060427），D-gal（Amresco公司）；IMDM、胎牛血清、马血清（Gibco公司）；Anti-Sca-1+ Micro Bead Kit（Miltenyi公司）；衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）染色试剂盒（Cell Signaling 公司）；Trizol、荧光定量PCR试剂、sybr green I（TaKaRa公司），PCR引物（Invitrogen公司）；t-BHP、Ficoll分离液、L-谷氨酰胺、甲基纤维素（Sigma公司）；重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、重组人促红细胞生成素（rhEPO），麒麟鲲鹏生物药业有限公司，SIRT1、NF-κB一抗、HRP二抗（SantaCruz公司）；蛋白裂解液（Applygen公司）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天生物技术研究所）；ECL发光试剂盒（Pierce公司）。
1.3 仪器7900HT荧光定量PCR仪（ABI，美国）；MiniPROTEAN 3垂直凝胶电泳槽（Bio Rad，美国）；165-8001印迹电泳转移系统（Bio Rad，美国）；GelDoc It TS2凝胶成像和分析系统（Bio Rad，美国）。
2 方法 2.1 实验分组、造模及给药雄性SD大鼠随机分为对照组、模型组、人参皂苷Rg1对照组、人参皂苷Rg1治疗组和人参皂苷Rg1预防组，每组10只。对照组：大鼠颈背部sc生理盐水0.2 mL/只，每天1次，连续42 d；模型组：大鼠颈背部sc D-gal 120 mg/kg，每天1次，连续42 d；人参皂苷Rg1对照组：大鼠颈背部sc生理盐水0.2 mL/只，每天1次，连续7 d，然后ip人参皂苷Rg1（20 mg/kg[4]），连续35 d；人参皂苷Rg1治疗组：大鼠颈背部sc D-gal 120 mg/kg，每天1次，连续42 d，第8天起ip人参皂苷Rg1（20 mg/kg），连续35 d；人参皂苷Rg1预防组：大鼠先ip给予人参皂苷Rg1（20 mg/kg）预处理，连续7 d，接着颈背部sc D-gal 120 mg/kg，每天1次，连续42 d，于D-gal注射后第8天起ip人参皂苷Rg1（20 mg/kg），连续35 d。模型构建及药物注射完成2 d后，免疫磁性分选法[5]提取各组大鼠Sca-1+ HSC/HPC进行相关检测。
2.2 SA-β-Gal染色收集各组Sca-1+ HSC/HPC，按照SA-β-Gal 染色试剂盒方法操作，染色后离心甩片，70%甘油封片镜检。每张甩片随机计数400个细胞，观察和计数阳性细胞的百分比。
2.3 流式细胞术分析细胞周期收集各组Sca-1+ HSC/HPC细胞，PBS洗1次，70%冰乙醇固定过夜，PBS洗涤2次，加入100 μL牛胰核糖核酸酶（1 mg/mL），37 ℃水浴孵育30 min；加入碘化丙啶染色液（50 μg/mL）避光反应30 min，流式细胞仪检测，Multicycle软件（日本PHENIX公司）分析各组细胞的细胞周期时相。
2.4 造血祖细胞混合集落（CFU-Mix）培养参照文献方法[6]改进，依次加入2-巯基乙醇（0.1 mmol/L）、3% L-谷氨酰胺、马血清、rhEPO、白细胞介素-3（IL-3）、rhGM-CSF、1×104个各组细胞、2.7%甲基纤维素，总体积2 mL，充分混匀后接种于96孔板（0.2 mL/孔），在37 ℃、含5% CO2饱和湿度的培养箱中培养7 d，根据种植Sca-1+ HSC/HPC数与形成CFU-Mix数评价各组细胞形成CFU-Mix能力与多向分化潜能。
2.5 荧光定量PCR检测SIRT1、NF-κB mRNA的表达收集各组Sca-1+ HSC/HPC，Trizol裂解，分别提取各组细胞总RNA。逆转录为相应的cDNA，逆转录反应条件：42 ℃、30 min，99 ℃、5 min，5 ℃、5 min。以RNA反转录得到的cDNA为模板，扩增SIRT1、NF-κB，以β-actin为内参照。引物序列见表 1。PCR扩增条件：94 ℃、4 min；94 ℃、20 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，35个循环；72 ℃检测信号。应用Quantity One（Bio Rad）软件进行数据处理，分析结果。
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表 1 荧光定量PCR引物序列 Table 1 Primers sequence of FQ-PCR |
2.6 Western blotting检测SIRT1、NF-κB蛋白的表达
收集各组Sca-1+ HSC/HPC，分别提取总蛋白，按BCA蛋白浓度测定试剂盒方法测定总蛋白浓度。取等量总蛋白经SDS-PAGE电泳分离后转移至PVDF膜；5%脱脂奶粉封闭2 h，加入兔抗鼠SIRT1、NF-κB一抗（1∶200），4 ℃过夜；TBST缓冲液充分漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗（1∶5 000），室温反应2 h；TBST充分洗膜3次，ECL增强发光试剂显色后，于凝胶成像系统曝光，显影定影后观察结果。
2.7 统计学处理运用SPSS 11.0软件进行实验数据统计学处理，采用析因设计、单因素方差分析方法，数据均以x±s表示。
3 结果 3.1 对Sca-1+ HSC/HPC SA-β-Gal染色阳性率的影响与对照组比较，模型组SA-β-Gal染色阳性细胞百分比显著增高（P＜0.05），人参皂苷Rg1对照组与对照组之间无统计学差异；人参皂苷Rg1治疗组及预防组SA-β-Gal染色阳性细胞百分比低于模型组（P＜0.05），且人参皂苷Rg1预防组SA-β-Gal阳性细胞百分比较人参皂苷Rg1治疗组低（P＜0.05）。见表 2。
3.2 对Sca-1+ HSC/HPC形成CFU-Mix能力的影响与对照组比较，模型组形成CFU-Mix数量减少（P＜0.05），人参皂苷Rg1对照组形成CFU-Mix数量增加（P＜0.05）；与模型组比较，人参皂苷Rg1治疗及预防组形成CFU-Mix数量增加（P＜0.05），人参皂苷Rg1预防组变化较人参皂苷Rg1治疗组显著（P＜0.05）。见表 2。
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表 2 人参皂苷Rg1对Sca-1+ HSC/HPC SA-β-Gal染色阳性率和CFU-Mix形成的影响 (x±s,n = 6) Table 2 Effect of Rg1 on percentage of SA-β-Gal staining positive cells and number of CFU-Mix forming of Sca-1+ HSC/HPC (x±s,n = 6) |
3.3 对Sca-1+ HSC/HPC细胞周期分布的影响
与对照组比较，模型组G0/G1期比例明显增高（P＜0.05），S期比例减少（P＜0.05），S＋G2/M比例明显降低；人参皂苷Rg1对照组G0/G1期比例低于对照组（P＜0.05），S＋G2/M比例高于对照组；与模型组组相比，人参皂苷Rg1治疗组及预防组G0/G1期比例明显降低（P＜0.05），S＋G2/M比例显著增高，其中人参皂苷Rg1治疗组变化最为明显（P＜0.05）。见表 3。
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表 3 人参皂苷Rg1对Sca-1+ HSC/HPC细胞周期分布的影响 (x±s,n = 6) Table 3 Effect of Rg1 on distribution of cell cycle to Sca-1+ HSC/HPC (x±s,n = 6) |
3.4 对Sca-1+ HSC/HPC SIRT1和NF-κB mRNA表达的影响
与对照组比较，人参皂苷Rg1对照组SIRT1 mRNA表达升高（P＜0.05），NF-κB mRNA表达下降（P＜0.05）；模型组SIRT1 mRNA表达低于对照组（P＜0.05）、NF-κB mRNA表达高于对照组（P＜0.05）；与模型组比较，人参皂苷Rg1 治疗组及预防组SIRT1 mRNA表达上调（P＜0.05），NF-κB mRNA表达下调（P＜0.05），人参皂苷Rg1预防组各指标变化较治疗组显著（P＜0.05）。见图 1。
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与对照组比较：P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05；与人参皂苷Rg1治疗组比较：△P＜0.05，图 2同 P < 0.05 vs control group; #P < 0.05 vs model group; △P < 0.05 vs ginsenoside Rg1 treatment group,Figure 2 is same 图 1 人参皂苷Rg1对Sca-1+ HSC/HPC SIRT1和NF-κB mRNA表达的影响 (x±s,n = 6) Fig.1 Effect of Rg1 on expression of Sca-1+ HSC/HPC SIRT1 and NF-κB mRNA of aging model rat (x±s,n = 6) |
3.5 对Sca-1+ HSC/HPC SIRT1、NF-κB蛋白表达的影响
与对照组比较，模型组SIRT1蛋白表达下降（P＜0.05），NF-κB蛋白表达增高（P＜0.05），人参皂苷Rg1对照组较对照组SIRT1蛋白表达增高（P＜0.05），NF-κB蛋白表达下降（P＜0.05）；与模型组比较，人参皂苷Rg 1治疗及预防组SIRT1蛋白表达上调（P＜0.05），NF-κB蛋白表达下调（P＜0.05）；其中Rg1预防组变化较治疗组更为显著（P＜0.05）。见图 2。
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图 2 人参皂苷Rg1对Sca-1+ HSC/HPC SIRT1和NF-κB蛋白表达的影响 (x±s,n = 6) Fig.2 Effect of Rg1 on expression of Sca-1+ HSC/HPC SIRT1 and NF-κB protein of aging model rat (x±s,n = 6) |
4 讨论
现代药理学研究发现[7-8]，人参皂苷Rg1是人参延缓衰老的主要活性成分，人参皂苷Rg1具有延缓成纤维细胞衰老的作用，能延长老年大鼠的存活时间，并可显著改善老年大鼠衰退的行为活动功能。本课题组既往研究[9]发现人参皂苷Rg1在体外可通过调控细胞周期调控分子（p16INK4a、p19Arf、p53、p21Cip1/Waf1）发挥其延缓小鼠Sca-1+ HSC/HPC衰老的作用。但人参皂苷Rg1延缓Sca-1+ HSC/HPC衰老的机制仍不清楚，人参皂苷Rg1延缓Sca-1+ HSC/HPC衰老的靶向调控分子是目前关注的热点问题。
本实验将人参皂苷Rg1作用于D-Gal诱导的大鼠衰老模型，结果提示人参皂苷Rg1治疗及预防处理后，Sca-1+ HSC/HPC G0/G1期细胞比例及形成CFU-Mix数量高于模型组，SA-β-Gal染色阳性率低于模型组，提示人参皂苷Rg1增强了Sca-1+ HSC/HPC自我更新及多向分化潜能增强，人参皂苷Rg1具有延缓D-Gal诱导的大鼠衰老模型中Sca-1+ HSC/HPC衰老的作用。
NF-κB是与衰老密切相关的调节因子，NF-κB过表达引起培养细胞出现衰老表型，抑制NF-κB表达，将诱发小鼠胚胎成纤维细胞产生逃避衰老的能力，从而延缓细胞衰老发生[10-11]。活性氧（ROS）是引起细胞累积性损伤，致细胞衰老最主要的原因。去乙酰化酶家族是营养代谢循环过程中重要调控因子，其中SIRT1在线粒体调控及清除ROS过程中发挥重要功能，SIRT1可通过抑制NF-κB通路缓解细胞内ROS的负荷从而发挥延缓细胞衰老的功能[12]；研究发现[13]SIRT1可增强正常HSCs线粒体的稳定性及清除ROS的能力，SIRT1可上调衰老的HSCs自我更新潜能，发挥延缓HSCs衰老的作用。本研究发现模型组Sca-1+ HSC/HPC SIRT1表达下降，NF-κB表达增高，这与细胞衰老过程中SIRT1与NF-κB表达改变一致。人参皂苷Rg1作用于衰老模型后，SIRT1表达上调，NF-κB表达下调，说明人参皂苷Rg1增强了Sca-1+ HSC/HPC内SIRT1的表达，增高的SIRT1抑制了下游调控分子NF-κB的表达。该结果提示人参皂苷Rg1可通过调控SIRT1-NF-κB信号通路发挥延缓D-Gal诱导的大鼠衰老模型中Sca-1+ HSC/HPC衰老的作用。
参考文献
| [1] | Ulkan K, Ozlem G, Ufuk E, et al. A remarkable age-related increase in SIRT1 protein expression against oxidative stress in elderly:SIRT1 gene variants and longevity in human[J]. PLoS One , 2015, 10 (3) :1–19. |
| [2] | Hubbard B P, Sinclair D A. Small molecule SIRT1 activators for the treatment of aging and age-related diseases[J]. Trends Pharmacol Sci , 2014, 35 (3) :146–154. DOI:10.1016/j.tips.2013.12.004 |
| [3] | Xu F T, Li H M, Yin Q S, et al. Effect of ginsenoside Rg1 on proliferation and neural phenotype differentiation of human adipose-derived stem cells in vitro[J]. Can J Physiol Pharmacol , 2014, 92 (6) :467–475. DOI:10.1139/cjpp-2013-0377 |
| [4] | 彭彬, 陈茂山, 蒲莹, 等. 人参皂苷Rg1延缓D-半乳糖大鼠脑衰老作用及机制的初步研究[J]. 重庆医科大学学报 , 2011, 6 (4) :419–422. |
| [5] | Challen G A, Sun D, Mayle A, et al. Dnmt3a and Dnmt3b have overlapping and distinct functions in hematopoietic stem cells[J]. Cell Stem Cell , 2014, 15 (3) :350–364. DOI:10.1016/j.stem.2014.06.018 |
| [6] | Wang J, Sun Q, Morita Y, et al. A differentiation checkpoint limits hematopoietic stem cell self-renewal in response to DNA damage[J]. Cell , 2012, 148 (5) :1001–1014. DOI:10.1016/j.cell.2012.01.040 |
| [7] | Chu S F, Zhang J T. New achievements in ginseng resrarch and its future prospects[J]. Chin J Integr Med , 2009, 15 (6) :403–408. DOI:10.1007/s11655-009-0403-6 |
| [8] | Zhu J H, Mu X Y, Zeng J, et al. Ginsenoside Rg1 prevents cognitive impairment and hippocampus senescence in a rat model of D-galactose-induced aging[J]. PLoS One , 2014, 9 (6) :1–12. |
| [9] | 周玥, 杨斌, 姜蓉, 等. 人参皂苷Rg1延缓造血干细胞衰老及其相关机制[J]. 中华医学杂志 , 2010, 90 (48) :3421–3425. |
| [10] | Wang Y, Liu Y, Zhang X Y, et al. Ginsenoside Rg1 regulates innate immune responses in macrophages through differentially modulating the NF-κB and PI3K/Akt/mTOR pathways[J]. Int Immunopharmacol , 2014, 23 (1) :77–84. DOI:10.1016/j.intimp.2014.07.028 |
| [11] | Tanaka Y T, Tanaka K, Kojima H, et al. Cynaropicrin from Cynara scolymus L. suppresses photoaging of skin by inhibiting the transcription activity of nuclear factor-κB[J]. Bioorg Med Chem Lett , 2013, 23 (2) :518–523. DOI:10.1016/j.bmcl.2012.11.034 |
| [12] | Brownl K, Xie S, Qiu X L, et al. SIRT3 reverses aging-associated degeneration[J]. Cell Rep , 2013, 3 (2) :319–327. DOI:10.1016/j.celrep.2013.01.005 |
| [13] | Kaarniranta K, Kauppinen A. Crosstalk between oxidative stress and SIRT1:Impact on the aging process[J]. Antero Salminen Int J Mol Sci , 2013, 14 (2) :3834–3859. DOI:10.3390/ijms14023834 |