丁香Caryophylli Flos为桃金娘科（Myrtaceae）植物丁香Eugenia caryophyllata Thunb. 的干燥花蕾，又称公丁香，是我国重点开发研究的药材之一，也是日常食品中常用的调味料之一，为药食两用中药。其性温，味辛，具有补肾助阳、温中降逆的功效，临床常用于治疗脾胃虚寒、肾虚阳痿、呃逆呕吐、心腹冷痛等症^[1-3]。丁香的主要化学成分是挥发油，其挥发油是各种药理作用的物质基础。但目前对丁香挥发油的提取工艺优化及其质量控制还尚未进行系统、深入的研究。由于丁香挥发油在提取的过程中存在易发生乳化、提取速度慢、由于黏度大导致损失率大且难于收集等问题，从而导致挥发油得率较低、成本高，严重阻碍了丁香挥发油的市场应用。

本课题组前期研究表明丁香挥发油在提取过程中存在较严重的乳化现象，油滴沉积及聚集速度较慢，使得其得油率及工业生产中转移率较低。因此，如何提高挥发油的提取率、降低其在提取过程中的乳化，快速地实现油水的分离是面临的一大难题。目前，挥发油提取工艺的研究主要针对药材粒度、提取时间、浸泡时间等参数^[4-6]，但对挥发油提取过程中油水分离环节部分的研究较少，尤其是对于冷凝温度及收集温度对挥发油乳化芳香水稳定性的研究未见报道。

乳化芳香水的稳定性与乳滴的粒径、油的理化参数等有关，但目前的研究未见对理化参数与乳化芳香水稳定性之间的关系进行研究。这使得在挥发油提取的工业生产中主要依靠经验对冷凝及收集的温度进行控制，难以保证制剂工艺和产品的稳定。有较多的文献报道Turbiscan LAB稳定分析仪可用于油水及新剂型方面的稳定性的分析^[7-9]，但用于挥发油提取过程方面及其油水分离方面的研究未见报道。因此，本研究采用改进的挥发油提取器以不同冷凝温度以及不同收集温度所得的乳化芳香水为研究对象，采用Turbiscan LAB稳定性分析仪分析研究不同冷凝温度及收集温度对乳化芳香水的稳定性的影响。主成分分析（principal component analysis，PCA）法^[10-11]是目前医药研究中常用的一种把多个指标通过降维转化为几个综合指标的统计方法。偏最小二乘回归（partial least squares regression，PLSR）法是目前应用较多的数据分析方法，可以用于多因变量对多自变量的回归建模^[12-14]。本研究拟采用多元分析分别研究不同工艺参数、理化性质与乳化芳香水稳定性的相关性，为丁香挥发油的工业提取提供理论依据。

DCAT21型表面张力仪，德国Dataphysics公司；Turbiscan LAB稳定性分析仪，法国Formulaction公司；KDM型控温电热套，鄄城华鲁电热仪器有限公司；Zetasizer Nano ZS激光粒度测定仪，英国马尔文仪器有限公司；乌氏黏度计，上海申谊玻璃制品有限公司；SZ93双蒸水仪，上海杰和科技公司；改进型挥发油提取器、挥发油中试提取设备，自制。

丁香，批号20150828，经陕西中医药大学生药教研室王继涛副教授鉴定为桃金娘科丁香属植物丁香Eugenia caryophllata Thunb. 的干燥花蕾，购自江西樟树天齐堂中药饮片有限公司。

取丁香药材多份，每份20 g，置于1 000 mL烧瓶中，加入400 mL蒸馏水，接入冷凝管及改进的挥发油提取器（改进的挥发油提取器如图 1所示）。为考察不同冷凝温度及收集温度对丁香乳化芳香水稳定性的影响，分别向冷凝管（或收集器）中通入10、20、30、40、50、60、70 ℃的冷凝水，同时向收集器（或冷凝管）中通入20 ℃冷凝水，进行提取，在沸腾10 min后在图 1支管处收集一定体积的的乳化芳香水，即得丁香芳香水。

图 1 自制挥发油提取器 Fig.1 Homemade volatile oil extractor

取丁香5 kg，加入到挥发油中试提取设备中，控制冷凝水及收集器的温度为20 ℃，通入水蒸气进行蒸馏提取6 h，所得挥发油及芳香水放冷静置过夜后收集挥发油，得丁香挥发油600 mL。

应用SIMCA-P＋软件对所测定的挥发油的理化参数进行PCA，将工艺参数及理化参数分别对稳定性动力学指数（turbiscan stability index，TSI）进行PLSR。

Turbiscan LAB分散稳定性分析仪在近红外区域（λ＝880 nm，说明书写明采用此波长）电发光二极管对样品进行扫描。2个同步光学传感器接收通过样品的透射光（在入射光方向180°位置的透射光传感器），被反射的背散射光（在入射光方向45°位置的背散射检测器），通过测定样品不同部位的透射光及背散光的强度，从而分析乳状液、混悬液等不稳定体系的乳化、絮凝、沉淀和分相等现象。Turbiscan LAB分散稳定性分析仪通过测定体系的TSI来反映体系的稳定性的强弱。其测定原理为在选定的高度，比较每1次扫描测量对前1次扫描测量的光强度的变化，并将结果累计至样品总高度而获得一个结果，TSI越大稳定性越差，越易进行油水分离。

H为样品高度，scan_i本次扫描的光强度，scan_i－1为前1次扫描的光强度，h为扫描的高度

将“2.1.1”项所得不同冷凝温度下的丁香乳化芳香水放入到稳定性分析仪中监测其1 h内的TSI，结果如图 2所示。从图 2可知，各冷凝温度的TSI由大到小的顺序为10、50、40、30、20、70、60 ℃，随着冷凝温度的升高，丁香乳化芳香水的TSI出现一个先下降后升高再下降的过程。

图 2 冷凝温度对丁香乳化芳香水稳定性影响 (x±s,n = 3) Fig.2 Condensation temperature effect on emulsified fragrance water stability of Caryophylli Flos (x±s,n = 3)

将“2.1.1”项所得不同收集温度下的丁香乳化芳香水放入到稳定性分析仪中监测其1 h内的TSI，结果如图 3所示。从图 3可知，各收集温度的稳定性由大到小的顺序为70、60、10、50、40、30、20 ℃，随着冷凝温度的升高，丁香乳化芳香水的稳定性出现一个先下降后升高的过程。TSI最大的为70 ℃，从结果可知，在收集温度为20 ℃以上随着温度的逐渐升高芳香水的稳定性逐渐下降。因此，在收集丁香挥发油乳化芳香水的过程中在一定温度范围内应尽量提高收集温度，可加速油水分离速度。

图 3 收集温度对丁香乳化芳香水稳定性影响 (x±s,n = 3) Fig.3 Collection temperature effect on emulsified fragrance water stability of Caryophylli Flos (x±s,n = 3)

芳香水的粒径决定其稳定性的大小，粒径越大则其稳定性越差。由于不同的提取工艺所得的芳香水中的挥发油浓度不同（浓度无法测定），导致本研究无法应用Turbiscan LAB稳定性分析仪准确计算其粒径。而激光粒度测定仪无法准确测定芳香水沉降后的粒径。因此，本研究最终选用马尔文激光粒度测定仪测得各工艺参数条件下乳化芳香水的起始粒径与芳香水测定1 h后的TSI进行比较，考察不同工艺参数对粒径及TSI的影响，结果如表 1所示。从表 1中可知，各乳化芳香水的起始粒径与各工艺参数下的乳化芳香水的TSI趋势一致。

表 1(Table 1)

表 1 不同工艺参数下芳香水的粒径及TSI Table 1 Relationship between initial grain size of fragrance water and TIS under various process parameters 温度/ ℃ 温控收集 温控冷凝 TSI 粒径/μm TSI 粒径/μm 10 1.897±0.112 4.168±0.159 1.521±0.110 4.137±0.241 20 0.758±0.184 3.779±0.277 0.758±0.079 3.745±0.221 30 1.258±0.089 3.847±0.210 0.833±0.057 3.784±0.178 40 1.415±0.192 3.902±0.105 0.895±0.092 3.846±0.156 50 1.646±0.187 4.113±0.303 1.329±0.105 3.914±0.211 60 2.211±0.119 4.247±0.197 0.591±0.044 3.568±0.231 70 2.872±0.135 4.304±0.293 0.702±0.083 3.714±0.266

表 1 不同工艺参数下芳香水的粒径及TSI Table 1 Relationship between initial grain size of fragrance water and TIS under various process parameters

取丁香挥发油60 mL，采用乌氏黏度计分别测定其在10、20、30、40、50、60、70 ℃下的相对黏度值（相对黏度为挥发油的动力黏度与同温度下水的动力黏度之比），结果分别为10.431±0.128、8.398±0.102、6.679±0.077、5.765±0.064、4.911±0.084、4.387±0.088、4.095±0.102（n＝3）。可见随着温度的升高，黏度值逐渐降低。因此，在提取过程中冷凝温度的逐渐升高可以降低其黏度，减少黏壁现象的发生，加快油滴的滴落速度，但相应的会引起油滴的粒径较小，使得乳滴粒径变小，增加了乳化芳香水的稳定性。同时随着收集温度的提高，可以降低油滴的黏度，加快乳滴的聚结速度。

取丁香挥发油60 mL，以表面张力仪测定样品10、20、30、40、50、60、70 ℃时的相对密度（相对密度为挥发油的密度与同温度下水的密度之比），结果分别为1.067 2±0.002 1、1.064 6±0.002 8、1.059 6±0.001 9、1.056 2±0.003 2、1.050 5±0.002 4、1.047 2±0.001 1、1.043 9±0.003 5（n＝3）。可见丁香挥发油的相对密度随着温度的升高逐渐降低，说明丁香挥发油的密度是随着温度而变化的。理论上为了增加丁香挥发油的油水分离速度、提高其收油率，需要在丁香挥发油的收集过程中降低其收集温度，增加其相对密度，从而增加其收油速度及分离速度，使得收集的挥发油的量更高。

取丁香挥发油样品60 mL，以表面张力测定仪器测定丁香挥发油10、20、30、40、50、60、70 ℃时的表面张力，结果分别为（32.836±0.128）、（31.351±0.216）、（30.768±0.111）、（29.519±0.211）、（28.411±0.067）、（27.345±0.029）、（27.345±0.131）N/m（n＝3）。由以上结果可知随着温度的升高，丁香挥发油表面张力逐渐下降，而且其表面自由能也随温度的升高逐渐降低，其随着温度的升高其表面自由能逐渐降低，使得其更容易发生乳化。因此推测，在丁香挥发油的提取过程中，为了更好地减少乳化，挥发油提取工艺中应尽量的采用低冷凝温度和低收集温度，这样可以减少挥发油的乳化。

取丁香挥发油60 mL，采用表面张力仪测定样品分别在10、20、30、40、50、60、70 ℃时的界面张力，结果分别为（3.483±0.103）、（6.425±0.057）、（4.957±0.028）、（3.338±0.054）、（1.228±0.008）、（-1.134±0.023）、 （-1.347±0.012）N/m（n＝3）。由以上结果可知丁香挥发油的界面张力在10～70 ℃随着温度的升高出现先升高后下降的过程，且在温度高于60 ℃时界面张力为负值。乳化液的稳定性主要由界面张力及界面膜的稳定性两者决定，其中界面膜强度为决定性因素。乳化液的稳定性随着界面张力的降低而升高，但随着界面张力的降低界面膜的强度也逐渐降低，即界面张力越大乳化液的稳定性越好。因此，从界面张力-温度曲线可以推测，为了更好地实现油水的分离，减少丁香乳化芳香水的稳定性，应在提取的过程中尽量提高挥发油提取装置收集部位的温度，这样可以加快丁香乳化芳香水的油水分离，这与“2.2.2”项的结论一致。

采用SIMCA-P＋软件对丁香挥发油理化参数进行PCA，最终拟合得2个主成分，结果见表 2，前2个主成分累计解释能力为99.4%。对各个参数对2个主成分解释的荷载大小进行分析，结果见表 3。由表 3可知，代表挥发油理化性质的相对密度、黏度、表面张力对主成分1的贡献值较大，因此主成分1主要反映的是挥发油理化参数；界面张力对主成分2的贡献值较大，因此主成分2主要反映的是界面张力。

表 2(Table 2)

表 2 PCA分析结果 Table 2 PCA analysis 主成分 解释能力 累计解释能力 交叉有效性 1 0.914 93 0.914 93 0.814 69 2 0.079 31 0.994 24 0.779 25

表 2 PCA分析结果 Table 2 PCA analysis

表 3(Table 3)

表 3 各变量对PCA第1、2主成分的贡献 Table 3 Load picture of 1 and 2 principal component analysis on each variable 理化性质 主成分1贡献值 主成分2贡献值 密度 0.515±0.073 -0.257±0.093 黏度 0.506±0.115 -0.443±0.031 表面张力 0.519±0.029 -0.068±0.141 界面张力 0.458±0.225 0.856±0.031

表 3 各变量对PCA第1、2主成分的贡献 Table 3 Load picture of 1 and 2 principal component analysis on each variable

为了考察工艺参数及挥发油理化性质与丁香乳化芳香水稳定性之间的关系，参照文献方法^[15-16]，采用SIMCA-P＋软件分别对丁香乳化芳香水的稳定性与提取工艺参数及挥发油的理化参数进行PLSR，得出挥发油提取工艺参数及理化参数对乳化芳香水稳定性的响应值（VIP，表 4），对乳化芳香水稳定性影响较大（VIP值大于1，说明该自变量对因变量影响显著）的提取工艺参数为收集温度，对芳香水稳定性影响较大的挥发油理化参数为挥发油的界面张力。说明提取过程中收集温度可显著影响乳化芳香水的稳定性，且可以通过改变挥发油的界面张力来改变乳化芳香水的稳定性，从而加速挥发油的分离速度。

表 4(Table 4)

表 4 模型工艺参数和理化性质的VIP分布 Table 4 VIP distribution of technological parameters and physicochemical property of models 理化性质 响应值 界面张力 1.289±0.269 黏度 1.034±0.327 密度 0.837±0.204 表面张力 0.753±0.434 收集温度 1.172±0.216 冷凝温度 0.791±0.310

表 4 模型工艺参数和理化性质的VIP分布 Table 4 VIP distribution of technological parameters and physicochemical property of models

分别对丁香乳化芳香水的稳定性与提取工艺参数及挥发油的理化性质进行PLSR，所得提取工艺参数、挥发油理化性质与乳化芳香水的TSI响应值见表 5。从表 5结果可知，工艺参数中丁香芳香水TSI与收集温度呈正相关，与冷凝温度呈负相关。在挥发油理化性质中，丁香芳香水的TSI与黏度、密度、表面张力均呈正相关，与界面张力呈负相关。丁香芳香水TSI与工艺参数的PLSR模型为TSI＝2.023 7－0.383 6×冷凝温度＋0.578 0×收集温度。丁香芳香水TSI与理化性质的PLSR模型为TSI＝2.023 7＋0.122 1×密度＋0.271 8×黏度＋0.036 9×表面张力-0.727 5×界面张力。这与理化参数-温度 曲线的结论一致。对挥发油稳定性影响因素最大的为理化参数界面张力。

表 5(Table 5)

表 5 模型的工艺参数和理化参数与TSI的相关系数 Table 5 Technological and physicochemical parameters of model with correlation coefficient of TSI 理化性质 相关性 密度 0.122±0.276 黏度 0.272±0.384 表面张力 0.037±0.223 界面张力 -0.728±0.476 冷凝温度 -0.281±0.623 收集温度 0.662±0.744

表 5 模型的工艺参数和理化参数与TSI的相关系数 Table 5 Technological and physicochemical parameters of model with correlation coefficient of TSI

本实验对传统的挥发油提取器进行改进，主要是目的是对挥发油提取过程中的收集温度这一工艺参数进行选择和优化。由于传统的挥发油提取器并未对收集温度进行相应的控制，导致不同的室温、不同的加热功率下会出现不同的收集温度，且普通挥发油提取器的收集温度往往较高（可达70 ℃以上）。这对于某些热不稳定性的挥发油（如川芎、当归）的提取会出现成分损失，同时对于某些需要低温收集的挥发油延长了其油水分离速度，最终导致挥发油的提取过程中即使同一批药材也出现成分含量差异较大的现象。

因此，本课题组基于加快挥发油提取速率，减少挥发油提取批间差异的角度出发，在原挥发油提取器的基础上在收集部位增加了保温夹层，从而控制其温度，来考察不同收集温度对挥发油提取速率的影响。

冷凝过程中不同的冷凝温度会产生不同粒径大小的乳化芳香水，从而改变了其稳定性，由于乳化芳香水属于热力学不稳定体系，则根据Ostwald熟化理论^[17]（在溶剂中小粒子越来越小，大粒子越来越大）可知乳滴粒径越大则其稳定性越差，这一结果与“2.2.3”项的结论一致。从“2.5”项下的PLSR结果可知，冷凝温度与界面张力呈正相关，故冷凝温度在10～50 ℃存在一个与界面张力相一致的先降低后增加的过程，但随着温度得继续增高，60～70 ℃时界面张力为负值，界面张力为负值时，此时丁香挥发油的乳化过程属于自发过程既热力学稳定体系，即此时的粒径会在60 ℃出现最小值（也是各冷凝温度条件下的最小值），随着温度继续升高至70 ℃时，随着温度的升高乳滴的稳定性逐渐降低，此时所得乳滴的粒径又出现了增大的现象。故随着冷凝温度的升高丁香乳化芳香水的稳定性出现一个先下降后升高再下降再升高的过程。

丁香挥发油提取过程中的收集器与冷凝器所起的作用不同，由于冷凝过程中乳滴与冷凝器的接触时间较少，故而其主要影响的的是乳滴的起始粒径。而收集器中所得的乳滴会在收集器中存留较长时间，故不同的收集温度对乳化芳香水的稳定性尤其是其聚集速度起决定性作用。从“2.5”项下的PLSR结果可知，挥发油提取工艺参数对乳化芳香水稳定性的VIP值最大的为收集温度，这与本实验的推测所一致。故收集温度对挥发油提取过程中的油水分离起到了决定性的作用，而在实验室的提取过程中此步骤往往忽略，因此，挥发油的提取过程中的收集器的温度这一重要参数需引起重视。

从“2.5”项下的PLSR结果可知，丁香乳化芳香水TSI与界面张力呈负相关，与黏度、密度、表面张力均呈正相关。有研究表明^[18]，降低界面张力可以增加乳化液的稳定性，但不是决定性因素，乳剂稳定性的决定因素为界面膜强度。界面张力降低的同时，界面膜的强度也随之减弱，故其体系的稳定性也会下降，即界面张力越大则乳化芳香水的稳定性越好，这与本研究所得的结果相一致，因此决定乳化芳香水的理化参数的最重要参数为界面张力，这也是在很多提起挥发油的过程中需要向乳化芳香水中加入一定量的盐来改变其界面张力，从而加快油水分离速度。

丁香乳化芳香水TSI与黏度、相对密度呈一定的正相关性，既黏度、相对密度越大TSI越大。这主要是在一定的压力和温度下，油水两相在分离器内流动过程中，由于油、水二相的密度差异，油滴在设备内上浮，水相则由于重力作用在设备内下沉。油滴的浮升速度符合Stokes公式^[19]。

V_oi为油滴浮升速度，d_i为油滴粒径，ρ_o为油的密度，ρ_w为水的密度，μ为水的黏度

从公式可知，影响乳化芳香水的关键参数为粒径、相对密度、黏度。其中黏度越大、相对密度越小则乳化芳香水的稳定性越好。随着提取过程中收集器温度的升高黏度逐渐降低，相对密度逐渐减少，而黏度的变化较相对密度的变化更大。因此随着温度的升高乳化芳香水的稳定性逐渐降低。不同温度下表面张力与乳化芳香水的TSI呈正相关，既表面张力越小乳化芳香水的稳定性越好，这与文献所得的结论相一致^[20]，表面张力越小则越容易乳化。