糖尿病是一种严重危害人类健康的慢性疾病，是由于胰岛素绝对不足或相对不足而引起糖、脂肪、蛋白质代谢紊乱的代谢性疾病，至今仍然无法根治。糖尿病易引起肾小球功能与结构改变，包括肾小球超滤、肾小球基底膜增厚及其系膜细胞基质分泌增加等^[1]，从而导致肾功能衰竭。肾小球系膜细胞（glomerular mesangial cells，GMCs）是肾小球内重要的固有细胞，在糖尿病肾病（DN）的发生发展中起着关键性的作用^[2]。研究发现，在DN病变初期，GMCs活化，发生增殖，亚细胞器损伤，并分泌大量的细胞因子，使细胞外基质（ECM）堆积，产生炎症反应等^[3]，导致肾小球硬化及纤维化。

山茱萸中环烯醚萜苷类成分能有效改善DN，通过抑制氧化应激来降低糖基化终末产物（AGEs）诱导的肾系膜损伤，马钱苷为环烯醚萜苷类成分中的主要药效成分^[4]，研究表明，马钱苷可有效降低AGEs诱导的GMCs增殖，改善GMCs的形态变化，抑制GMCs的细胞周期^[5]。另外，马钱苷能调节肾脏细胞内的炎症因子，抑制氧化应激表达^[6]。而在DN状态下，AGEs的刺激可以导致肾脏细胞产生内质网应激，进而诱导细胞出现凋亡、死亡或增殖等，使细胞内炎症等相关细胞因子表达增加，氧化应激增强，从而加剧DN的病变。因此，本实验采用AGEs诱导GMCs产生内质网应激，观察马钱苷通过干预GMCs内质网应激的影响，减轻GMCs炎症反应，探讨其改善DN的作用机制，为其临床应用提供依据。

人肾小球系膜细胞（GMCs），购自湖南湘雅医学院。

马钱苷，上海源叶生物科技有限公司，质量分数≥98%，批号20100528；氨基胍，Sigma公司进口分装。DMEM培养基、0.25%胰蛋白酶，美国Hyclone公司；胎牛血清（FBS），南美GEMINI；MTS，Promega公司；RIPA裂解液，碧云天生物技术研究所；前列腺素E₂（PGE₂），Mlbio公司；糖基化终末产物受体（RAGE）、葡萄糖调节蛋白78（GRP78）、抑制物阻抗性酯酶（IRE1）、X盒结合蛋白1（XBP1）、环氧合酶-2（COX-2）抗体，美国Abcam公司；磷酸化核转录因子-κB（p-NF-κB）、核转录因子-κB（NF-κB）抗体，CST公司。

Synergy HT酶标仪，美国Bio-Tek公司；二氧化碳细胞培养箱，日本Sanyo公司；超净工作台，苏州净化设备有限公司；Ti型倒置荧光显微镜，日本Nikon公司。

以0.2 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）为溶剂制备AGEs：将50 g/L的牛血清白蛋白（BSA）与0.5 mol/L葡萄糖溶于PBS中，37 ℃避光孵育3个月，使其形成AGEs。平行条件下配制不加入葡萄糖的上述BSA溶液，以制备无糖基化BSA作为对照。待AGEs形成后，用孔径为相对分子质量10 000的透析袋低温透析24 h，除去未反应的葡萄糖，用0. 22 μm滤膜滤过除菌。

GMCs用含10% FBS的DMEM低糖培养基在37 ℃、5% CO₂培养箱中培养，取对数生长期细胞用于实验。

取对数生长期的分化成熟细胞，调整细胞密度至2×10⁴/mL接种于96孔板，每孔100 μL，于37 ℃、5% CO₂培养箱中静置培养24 h。当细胞贴壁生长至80%~90%融合状态时，换无血清的DMEM低糖培养液饥饿培养23 h，分别加入氨基胍（终浓度分别为10.0、1.0、0.1 μmol/L）、马钱苷（终浓度分别为10.0、1.0、0.1 μmol/L）预孵1 h后，加入200 mg/L AGEs刺激，同时设模型组（200 mg/L AGEs）和对照组（200 mg/L BSA），每组设6个复孔。24 h后每孔加入MTS溶液20 μL，继续孵育1 h，酶标仪测定490 nm处各孔的吸光度（A）值，计算细胞增殖抑制率。

取对数生长期的分化成熟细胞，调整细胞密度至1×10⁵/mL接种于培养皿内，每个皿5 mL，于37 ℃、5% CO₂培养箱中静置培养24 h。当细胞贴壁生长至80%~90%融合状态时，换无血清的DMEM低糖培养液饥饿培养23 h，加入氨基胍（终浓度为1.0 μmol/L）、马钱苷（终浓度为1.0 μmol/L）预孵1 h后，加入AGEs（200 mg/L）刺激，同时设模型组和对照组（处理同“2.3”项）。24 h后收集细胞，用不含EDTA的0.25%胰蛋白酶消化收集后，再用预冷的PBS清洗1遍，800 r/min离心5 min，弃上清，去除细胞碎片，再用PBS使细胞重悬，1 500 r/min离心10 min，使细胞压缩成团，加入适量2.5%戊二醛固定，用透射电镜观察细胞超微结构变化。

取对数生长期的分化成熟细胞，调整细胞密度至5×10⁴/mL接种于24孔板，每孔500 μL，于37 ℃、5% CO₂培养箱中静置培养24 h。当细胞贴壁生长至80%~90%融合状态时，换无血清的DMEM低糖培养液饥饿培养23 h，加药及分组同“2.3”项，每组设4个复孔。24 h后3 000 r/min离心10 min，提取上清液，ELISA法检测细胞上清中PGE₂水平，操作按试剂盒说明进行。

取对数生长期细胞以1.5×10⁵/mL接种于培养皿内，每个皿5 mL，于37 ℃、5% CO₂培养箱中静置培养24 h。当细胞贴壁生长至80%~90%融合状态时，换无血清的DMEM低糖培养液饥饿培养23 h，加药及分组同“2.3”项（氨基胍只设1.0 μmol/L组），处理24 h后3 000 r/min离心10 min，收集细胞，用RIPA裂解液提取细胞总蛋白，并测定蛋白浓度。蛋白样品加入1/4体积的4×蛋白上样缓冲液，95 ℃煮沸5 min，进行SDS-PAGE凝胶电泳，然后转印至PVDF膜上，用含5% BSA的封闭液封闭1 h，一抗4 ℃过夜。次日PBST漂洗3次，加入辣根过氧化酶标记的二抗室温孵育2 h，ECL显色。利用Image J软件分析各组灰度值，以β-actin为内参计算各蛋白相对表达量。

实验结果使用GraphPad Prism 6软件进行统计分析，数据以x±s表示，采用One-Way ANOVA统计方法进行方差分析。

给予AGEs刺激24 h后，与对照组比较，模型组A值显著升高（P＜0.01）；与模型组比较，氨基胍组在终浓度10.0 μmol/L时，马钱苷在终浓度1.0、10.0 μmol/L时，对AGEs引起的细胞增殖具有明显的抑制作用（P＜0.05、0.01），且呈浓度相关性，结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 马钱苷对AGEs诱导的GMCs增殖的影响(x±s, n=6) Table 1 Effect of loganin on proliferation of GMCs induced by AGEs (x±s, n=6) 组别 C/(μmol·L-1) A值 增殖抑制率/% 对照 - 0.60±0.05 - 模型 - 0.96±0.11## - 马钱苷 10.0 0.64±0.08** 33.4 1.0 0.74±0.12 22.4 0.1 0.78±0.09 19.2 氨基胍 10.0 0.69±0.21 28.5 1.0 0.78±0.16 18.7 0.1 0.95±0.19 0.6 与对照组比较：##P＜0.01；与模型组比较：P＜0.05 **P＜0.01 ##P < 0.01 vs control group; P < 0.05 **P < 0.01 vsmodel group

表 1 马钱苷对AGEs诱导的GMCs增殖的影响(x±s, n=6) Table 1 Effect of loganin on proliferation of GMCs induced by AGEs (x±s, n=6)

给予AGEs刺激24 h后，与对照组比较，模型组细胞内出现亚细胞器损伤，内质网管腔肿胀，排列杂乱；与模型组比较，马钱苷、氨基胍（1.0 μmol/L）可明显改善AGEs引起的亚细胞器损伤，减轻内质网的病变，见图 1。

图 1 马钱苷对AGEs刺激GMCs超微结构的影响 Fig.1 Effect of loganin on ultrastructure of GMCs exposed to AGEs

给予AGEs刺激24 h后，与对照组比较，模型组的RAGE蛋白表达显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，氨基胍、马钱苷各剂量组均能使RAGE的蛋白表达显著降低，且呈剂量相关性（P＜0.01），见图 2。

与对照组比较：##P＜0.01；与模型组比较：**P＜0.01 ##P < 0.01 vs control group; **P < 0.01 vs model group 图 2 马钱苷对AGEs刺激GMCs后RAGE蛋白表达的影响(x±s, n=3) Fig.2 Effect of loganin on protein expression of RAGE in GMCs exposed to AGEs (x±s, n=3)

给予AGEs刺激24 h后，与对照组比较，模型组的GRP78、IRE1蛋白表达显著增加，XBP1的分化显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，氨基胍、马钱苷各剂量组均能使GRP78、IRE1的蛋白表达降低，XBP1分化的蛋白减少，且呈剂量相关性（P＜0.05、0.01），见图 3。

与对照组比较：##P＜0.01；与模型组比较：P＜0.05 **P＜0.01，图 4和5同 ##P < 0.01 vscontrol group; P < 0.05 **P < 0.01 vsmodel group, figures 4 and 5 are same 图 3 马钱苷对AGEs刺激GMCs后GRP78、IRE1和XBP1蛋白表达的影响(x±s, n=3) Fig.3 Effect of loganin on expression of GRP78, IRE1, and XBP1 in GMCs exposed to AGEs (x±s, n=3)

给予AGEs刺激24 h后，与对照组比较，模型组的NF-κB、COX-2蛋白表达显著增加（P＜0.01）；与模型组比较，氨基胍、马钱苷各剂量组均能使NF-κB、COX-2的蛋白表达降低，且呈剂量相关性（P＜0.05、0.01），见图 4。

图 4 马钱苷对AGEs刺激GMCs后NF-κB和COX-2蛋白表达的影响(x±s, n=3) Fig.4 Effect of loganin on expression of NF-κB and COX-2 in GMCs exposed to AGEs (x±s, n=3)

给予AGEs刺激24 h后，与对照组比较，模型组细胞上清中PGE₂水平显著上升（P＜0.01）；与模型组比较，氨基胍（除0.1 μmol/L）、马钱苷各剂量组均能使细胞上清中PGE₂水平降低，且呈剂量相关性（P＜0.01），见图 5。

图 5 马钱苷对AGEs刺激GMCs后PGE2水平的影响(x±s, n=4) Fig.5 Effect of loganin on level of PGE2 in GMCs exposed to AGEs (x±s, n=4)

DN的发病机制与多种因素密切相关，包括糖代谢紊乱及非酶糖基化反应等。而非酶糖基化反应是目前关于DN研究的热点。研究表明，AGEs能引起细胞内糖基化，交联形成胶原，以及与RAGE的结合。AGEs及其受体RAGE结合后能引起下游的信号通路的激活，包括NF-κB的活化，细胞因子和黏附分子的表达增加，诱导氧化应激，增加细胞内的活性氧（ROS）等^[7]。在DN的发病进程中，AGEs能引起系膜细胞增殖，从而导致ECM增加和基底膜增厚。研究表明，系膜细胞合成ECM的异常增加是DN肾小球基底膜增厚和系膜区ECM过度沉积并扩张，最终进展为肾小球硬化的重要病理基础^[3]。本实验研究发现，不同浓度的马钱苷能抑制AGEs引起的GMCs增殖，下调AGEs引起GMCs RAGE表达升高，且随着浓度升高而抑制作用增强，说明马钱苷对GMCs的保护作用可能与RAGE有关。

近年来研究发现，内质网应激在肾脏病理生理学发挥着关键的作用，包括DN^[8-10]。AGEs、高血糖及环孢霉素等能导致内质网内折叠蛋白积累，细胞内出现内质网应激，从而能引起未折叠蛋白效应（UPR）。UPR途径是目前内质网应激中作用机制较为明确，UPR途径通过激活3种跨膜蛋白，形成3条不同的通路。正常情况下，跨膜蛋白都与糖调节蛋白GRP78、GRP94、钙网蛋白、钙联接蛋白等伴侣分子结合而处于无活性状态。在内质网应激条件下，GRP78等链接蛋白与IRE1解离，IRE1通过二聚化或者自身磷酸化被激活^[11-12]。IRE1的激活会导致XBP1 mRNA的非常规剪接，进而产生这种转录因子的活性形式，进而诱导UPR的主要转录程序^[13-15]。Wu等^[16]的研究发现，AGEs引起内皮细胞产生炎症反应，这与内质网应激有关。Rasheed等^[17]的实验证明，在AGEs诱导的软骨细胞中，内质网应激通过激活eIF2α、p-38-MAPK以及NF-κB促进COX-2的表达增加。本实验结果证明，马钱苷能改善AGEs引起的GMCs亚细胞器损伤，显著降低内质网应激相关蛋白GRP78、IRE1的表达，减少XBP1蛋白的分化，降低NF-κB的活化以及COX-2蛋白的表达，下调PGE₂水平，提示马钱苷通过抑制IRE1通路，能改善AGEs引起GMCs的内质网应激，抑制NF-κB的活化，减轻GMCs的炎症反应。

综上所述，马钱苷可有效调节AGEs诱导GMCs产生的内质网应激，减轻GMCs的炎症反应，进而改善DN，其作用机制可能与下调RAGE的表达，抑制IRE1通路有关，但其确切机制仍需要进一步深入研究。