2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.21.011 |
2. 新疆医科大学中医学院, 新疆 乌鲁木齐 830054
2. Institute of Traditional Chinese Medicine, Xinjiang Medical University, Urumqi 830054, China
香青兰Dracocephalum moldavica L.，维吾尔名为巴迪然吉布亚，是新疆地区产的唇形科植物香青兰的干燥地上部分[1-3]，其中主要活性成分为木犀草苷[4-5]、迷迭香酸[6-7]和田蓟苷[8-9]。经过多年的药理实验与临床研究，表明其具有明确的抗心肌缺血、抗氧化、抗炎和降压等作用[10-12]，在维吾尔医学和民间用于治疗冠心病和心绞痛等疾病[13-16]；香青兰总黄酮还具有抗动脉粥样硬化作用[17-18]。目前，已上市药品益心巴迪然吉布亚颗粒（香青兰单味药材）已收载于《中华人民共和国卫生部药品标准•维吾尔药分册》1999年版[19]。同时，课题组现已获其制备工艺的国家发明专利[20]。
但是，根据初步实验表明，香青兰提取物（EDM）体内半衰期短、肠道渗透率不好、口服生物利用度低[21-22]。因此，为了开发其潜能和剂型合理性，本实验对EDM在不同介质中的平衡溶解度、表观油水分配系数（P）和体外胃肠液中的稳定性等理化参数进行测定，为今后进一步设计和开发出改善EDM生物利用度和增加药效的新剂型提供实验数据。
1 仪器与材料赛默飞UltiMate3000型高效液相色谱仪，美国赛默飞世尔科技有限公司；Millipore simplicity-185超纯水器，美国密理博公司；AB135-S梅特勒-托利多电子天平，梅特勒-托利多国际股份有限公司；KQ-100 DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；TGL-16K型台式高速冷冻离心机，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司；SHA-B水浴恒温振荡器，金坛市医疗仪器厂。
EDM，新疆西部加斯特药业有限公司，批号20150721；对照品木犀草苷，质量分数＞98%，上海一林生物科技有限公司；对照品迷迭香酸，质量分数＞98%，批号111871-201001，中国食品药品检定研究院；对照品田蓟苷，实验室自制，其结构是通过1H-NMR和13C-NMR数据与文献报道的数据[4]比对而确定的，质量分数经HPLC归一法测定在98%以上；胃蛋白酶，南京奥多福尼生物科技有限公司，批号20151221；胰酶，河南金诚生物科技有限公司，批号20141001；乙腈，色谱纯，美国Fisher公司，质量分数≥99%；水为超纯水；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果 2.1 EDM分析方法的建立 2.1.1 色谱条件色谱柱为Shim-pack VP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为乙腈-0.5%甲酸水溶液，梯度洗脱：0～30 min，15%乙腈；30～55 min，15%～25%乙腈；55～75 min，25%～35%乙腈；检测波长330 nm；体积流量1.0 mL/min；柱温35℃，进样量10 μL。
2.1.2 溶液的配制（1）木犀草苷对照品贮备液：精密称取对照品2.8 mg，置25 mL量瓶中，加70%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得112 μg/mL木犀草苷对照品贮备液，置于4℃冰箱低温避光保存备用。
（2）迷迭香酸对照品贮备液：方法同上，精密称取对照品3.6 mg，得144 μg/mL的对照品贮备液。
（3）田蓟苷对照品贮备液：方法同上，精密称取对照品5.2 mg，得208 μg/mL的对照品贮备液。
（4）混合对照品贮备液：方法同上，精密吸取上述3种对照品贮备液各5 mL，制得22.4、28.2、41.6 μg/mL的木犀草素、迷迭香酸和田蓟苷的混合对照品贮备液。
（5）不同pH值溶液[23]：按《中国药典》2015年版二部附录XV D缓冲液的配制方法，分别配制pH值1.2盐酸溶液和pH值为2.0、3.0、4.0、5.6、6.8、7.0、7.4、8.0的磷酸盐缓冲液（PBS），测定pH值，若有pH值偏离，用H3PO4或NaOH校正。
（6）人工胃液：取稀盐酸16.4 mL，加水约800 mL与胃蛋白酶10 g加水稀释成1 000 mL，即得。同时，配制同体积不含胃蛋白酶的人工胃液。
（7）人工肠液：取磷脂二氢钾6.8 g，加水300 mL使溶解，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调节pH值至6.8；另取胰酶10 g，加水适量使溶解，将二者混合，加水稀释至1 000 mL，即得。同时，配制同体积不含胰酶的人工肠液。
2.1.3 系统适用性试验精密量取木犀草苷、迷迭香酸和田蓟苷的混合对照品贮备液1 mL于10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀。按“2.1.1”项下色谱条件进样，记录色谱峰，见图 1。结果表明在上述色谱条件下木犀草苷、迷迭香酸和田蓟苷峰形对称，保留时间分别为27.31、47.54、66.21 min。
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图 1 混合对照品(A)、EDM样品(B)和空白对照(C)的HPLC图 Fig.1 HPLC of mixed reference substances (A), EDM sample (B), and blank control (C) |
2.1.4 线性关系考察
精密吸取上述对照品贮备液0.1、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀。按“2.1.1”项下色谱条件分别进行测定，以对照品质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线，得线性回归方程分别为木犀草苷Y＝19.379 X＋13.988，r＝0.999 5；迷迭香酸Y＝16.69 X－2.274 4，r＝0.999 3；田蓟苷Y＝21.147 X－1.214 9，r＝0.999 2；结果表明木犀草苷在1.12～89.6 μg/mL、迷迭香酸在1.44～115.2 μg/mL、田蓟苷在2.08～166.4 μg/mL质量浓度与峰面积呈良好的线性关系。
2.1.5 精密度考察分别选择质量浓度为1.12、22.4、89.6 μg/mL的木犀草苷，1.44、28.8、115.2 μg/mL的迷迭香酸和2.08、20.8、166.4 μg/mL的田蓟苷对照品溶液作为低、中、高3种质量浓度，1 d内早、中、晚各进样分析2次，连续测定6 d，考察其日内和日间精密度，结果木犀草苷高、中、低质量浓度的日内和日间精密度分别为0.56%、0.48%、0.73%和0.67%、0.54%、0.68%，迷迭香酸高、中、低浓度的日内和日间精密度分别为0.51%、0.42%、0.89%和0.58%、0.52%、1.23%，田蓟苷高、中、低浓度的日内和日间精密度分别为1.13%、0.66%、1.02%和1.38%、0.84%、1.24%，结果均小于2%，表明日内和日间精密度良好。
2.1.6 稳定性考察用70%乙醇配制质量浓度为500 μg/mL的EDM溶液，置具塞离心管中，37℃水浴振荡器中振摇72 h，分别于0、24、48、72 h取样，10 μL注入高相液相色谱仪，记录各峰面积。结果EDM溶液在37℃可稳定放置72 h，指标成分木犀草苷、迷迭香酸和田蓟苷的RSD分别为0.95%、0.68%、1.03%、0.82%，1.17%、0.49%、0.62%、1.22%，0.77%、0.51%、0.86%、1.37%，表明此方法稳定性良好。
2.1.7 重复性考察取EDM适量，6份，精密称定，分别加70%乙醇定容至25 mL量瓶中，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，按“2.1.1”项色谱条件测定，结果EDM中指标成分木犀草苷、迷迭香酸和田蓟苷质量分数的RSD分别为1.62%、1.45%、2.1%，结果表明此方法重复性良好。
2.1.8 加样回收率考察取EDM适量，9份，精密称定，均分为3组，各组分别精密加入适量混合对照品贮备液，配制成高、中、低质量浓度的供试溶液，按“2.1.1”项色谱条件测定并记录峰面积，比较实测值与理论添加值，计算得EDM中指标成分木犀草苷、迷迭香酸和田蓟苷的平均加样回收率RSD分别为1.85%、2.59%、2.26%，均＜3%，符合方法回收率要求。
2.2 EDM在不同溶剂中平衡溶解度测定分别在10 mL具塞锥形瓶中加入5 mL各种溶剂，再分别加入过量EDM，并超声至药物粉末不再溶解为止，分别用封口膜封好后放入37℃恒温水浴振荡器中，振摇72 h，在整个过程中始终保持锥形瓶有药物粉末存在，混悬液在6 000 r/min条件下离心15 min，上清液过0.22 μm微孔滤膜，续滤液用甲醇稀释后按上述色谱条件测定其峰面积，计算木犀草苷、迷迭香酸和田蓟苷在各介质中的平衡溶解度。实验测得木犀草苷、迷迭香酸和田蓟苷在37℃纯水中的平衡溶解度分别为1 026.17、845.21、850.67 μg/mL，其余结果见表 1。
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表 1 EDM在不同溶剂中的平衡溶解度考察 Table 1 Equilibrium solubility of EDM |
2.3 EDM在不同pH值缓冲溶液中的平衡溶解度
分别在10 mL具塞锥形瓶中加入5 mL pH 1.2 HCl溶液及pH值分别为2.0、3.0、4.0、5.6、6.8、7.4、8.0的PBS，处理方法同“2.2”项下操作，计算木犀草苷、迷迭香酸和田蓟苷在各介质中的平衡溶解度，结果表明3种成分的平衡溶解度随pH值的增加而逐渐增大，结果见表 2。
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表 2 EDM在不同pH值缓冲溶液中平衡溶解度 Table 2 Equilibrium solubility of EDM in various buffer solution with different pH values |
2.4 EDM在不同助溶剂溶液中的平衡溶解度
配制2、4、8、16、32 g/L系列质量浓度的聚山梨酯80（T80）、聚乙二醇4000（PEG）和十二烷基硫酸钠（SDS）。取过量EDM样品置于10 mL具塞锥形瓶中，分别加入5 mL不同质量浓度的助溶剂溶液，50℃水浴加热超声1 h至样品不再溶解，放入水浴振荡器中，温度保持37℃振摇72 h。将饱和溶液在6 000 r/min条件下离心15 min，上清液过0.22 μm微孔滤膜，弃去初滤液，取续滤液10 μL注入高效液相色谱仪，按上述色谱条件测定其峰面积，计算木犀草苷、迷迭香酸和田蓟苷在不同助溶剂溶液中的平衡溶解度。在3种不同质量浓度助溶剂溶液（T80、PEG和SDS）中的平衡溶解度如表 3所示，在32 g/L的SDS溶液中，木犀草苷、迷迭香酸和田蓟苷的平衡溶解度分别提高到1 679.61、1 249.2、2 765.3 μg/mL，其增溶效果最好，而其他助溶剂对木犀草苷、迷迭香酸和田蓟苷的增溶能力相对较弱。
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表 3 EDM在不同质量浓度助溶剂下的平衡溶解度 Table 3 Equilibrium solubility of EDM in surfactant with different concentration |
2.5 EDM的P测定
分别取适量EDM加入被水饱和的正辛醇中，超声30 min至EDM充分溶解后，溶液过0.22 μm微孔滤膜，续滤液按上述色谱条件测定，得到各指标成分的质量浓度p0。精密量取该溶液1 mL，置于10 mL玻璃离心管中，再精密加入4 mL水和缓冲液饱和的正辛醇，分别用封口膜封好后放入37℃恒温水浴振荡器中振摇48 h，使其在两相中充分平衡。静置后取下层水液在6 000 r/min离心15 min，溶液过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液按上述色谱条件进样，记录峰面积，计算得到各指标成分的质量浓度pw。按照公式计算P[24]。
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p0分别为木犀草苷、迷迭香酸和田蓟苷在正辛醇中的初始质量浓度（mg/L），V0为被水饱和的正辛醇体积（1 mL），pw为药物分配平衡时在水相中测得的木犀草苷、迷迭香酸和田蓟苷质量浓度（mg/L），Vw为水相体积（4 mL）
木犀草苷、迷迭香酸和田蓟苷在正辛醇-缓冲溶液中的P见表 4，木犀草苷、迷迭香酸和田蓟苷在水中的P分别为0.173 1（lgP＝−0.761 8）、0.068 4（lgP＝−1.165 0）和1.082 9（lgP＝0.034 6），在pH 7.4的PBS中的P最大值分别为0.239 9（lgP＝−0.619 8）、0.088 1（lgP＝−1.055 2）和1.222 9（lgP＝0.087 4），在pH 1.2 HCl中的P最小值分别为0.040 1（lgP＝−1.397 9）、0.005 1（lgP＝−2.301 0）和0.288 0（lgP＝−0.540 6）。
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表 4 EDM在不同pH值下的lgP Table 4 lgP of EDM with different pH values |
2.6 EDM的体外胃肠道稳定性考察
取EDM置于预先在37℃水浴中放置了15 min的酶溶液中，保持37℃水浴加热，分别于0、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0、12.0 h取样100 μL，加入200 μL酶终止液（胃蛋白酶终止液：pH 1.8的Tris缓冲液，胰蛋白酶终止液：pH 1.8的三氟乙酸溶液），涡旋振荡1 min，5 000 r/min 10 min，取上清液过0.22 μm微孔滤膜，续滤液按上述色谱条件测定，结果见表 5～7。结果表明木犀草苷在人工胃液中不稳定，而在人工肠液中较稳定。迷迭香酸和田蓟苷在人工胃液和人工肠液中均稳定。
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表 5 木犀草苷在人工胃肠液中的稳定性 Table 5 Concentration of luteolin in artificial gastrointestinal fluid |
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表 6 迷迭香酸在人工胃肠液中的稳定性 Table 6 Concentration of rosmarinic acid in artificial gastrointestinal fluid |
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表 7 田蓟苷在人工胃肠液中的稳定性 Table 7 Concentration of tilianin in artificial gastrointestinal fluid |
3 讨论
目前，未见有报道测定EDM的溶解度及P，本实验采用HPLC法测定了EDM（包括木犀草苷、迷迭香酸和田蓟苷）的平衡溶解度和摇瓶法测定其P[25]。通过测定EDM在介质中的量，对EDM的溶解度和P有了初步了解。
良好的药物吸收需要适宜的水溶性和脂溶性，故药物的脂溶性和水溶性是药物吸收重要影响因素，而药物的脂溶性取决于它本身的分子结构及所处pH条件下的分子型比例等[26-27]。
一般认为，对于被动吸收的药物，lgP＞5时，亲脂性极强，溶解性极差，药物极不易被吸收；lgP在0～4时，药物吸收理想；lgP＜0时，药物亲水性强，亲脂性极弱，药物在肠道中也不易被吸收，仅适于血管注射给药[28-29]。上述实验结果显示，EDM中，木犀草苷、迷迭香酸和田蓟苷在水中的lgP分别为−0.761 8、−1.165 0和0.034 6，由此可推测，木犀草苷和迷迭香酸在肠道中吸收较差，田蓟苷在肠道中吸收较好。
在体外胃肠道实验中，木犀草苷在人工胃液中的剩余量低于人工胃液（不含胃蛋白酶）中的剩余量，而在人工肠液中与人工肠液（不含胰酶）的稳定性基本一致，迷迭香酸和田蓟苷剩余量与在人工胃液（不含胃蛋白酶）和人工肠液（不含胰酶）中基本一致，由此推测迷迭香酸和田蓟苷稳定性好，可避免胃肠道酶破坏，胰蛋白酶对木犀草苷的稳定性影响较小，而pH值的变化才是引起木犀草苷稳定性下降的主要原因。同时，木犀草苷在人工肠液中的稳定性明显高于人工胃液，由此推测，直接口服EDM，从胃到达小肠，只会有一部分木犀草苷具有活性，所以在胃内酸性环境下稳定性差，在制剂时应考虑避免在胃中释放。同时，本实验在考察了EDM在一些常用的助溶剂溶液中溶解度后，建议今后制备田蓟苷制剂时，可使用适量的SDS作为溶出介质。
通过上述实验，有助于了解EDM的基本性质，可为选择新剂型的处方设计与制备工艺、确定溶出度测定方法、预测口服吸收行为提供参考，为今后临床合理用药提供有效指导。
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