2. 沈阳药科大学中药学院, 辽宁 沈阳 110016
2. School of Traditional Chinese Materia Medica, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China
杜鹃兰Cremastra appendiculata (D. Don) Makino为兰科(Orchidaceae)杜鹃兰属Cremastra Lindl.植物,《中国药典》2015年版将其作为中药山慈菇的基原植物药物之一。山慈菇是1种常用中药材,性味甘、微辛,性寒,小毒。归肝经、胃经、肺经。其主要功效为清热解毒、消肿散结。临床上主要用于痈肿疔毒、淋巴结核和蛇虫咬伤。杜鹃兰即中药山慈菇,最初见于唐代的《本草拾遗》:“山慈菇,有小毒,生山中湿地,惟处州遂昌县所产者良,叶似车前,根如慈菇。”其主要分布在云南、四川、贵州等长江以南各省区。药用部位主要为植物的干燥假鳞茎[1],生于海拔1 950~2 100 m的松林下、草地或田野,也分布于缅甸、印度、斯里兰卡、印度尼西亚、菲律宾和澳大利亚等国家。本课题组前期研究发现,杜鹃兰的乙醇提取物具有抑制人骨髓神经母细胞瘤(SH-SY5Y)凋亡的作用[2]。为了进一步探索杜鹃兰中的活性成分,为其有效部位和单体化合物的药理学研究奠定基础,本实验对杜鹃兰的化学成分进行了进一步的研究,从其55%乙醇提取物的醋酸乙酯萃取部位中分离鉴定出20个化合物,通过理化性质和波谱学数据确定了其化学结构,分别为双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯(militarine,1)、1-[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基-4-甲基苹果酸酯[1-(4-β-D-glucopyranosyloxybenzyl)-4-methyl-2-isobutylmalate,2]、1-[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-4-甲基-2-苄基苹果酸酯{1-[4-(β-D-glucopyranosyloxy)benzyl]-4-methyl-2-benzylmalate,3}、山药素III-3-葡萄糖苷(batatasin III-3-O-glucoside,4)、红果酸(eucomic acid,5)、橙皮苷(hesperidin,6)、1, 3-二甲氧基酰胺基-4-甲基苯[(4-methyl-1, 3-phenylene) dicarbamic acid methyl ester,7]、(3-甲氧基酰胺基-2-甲基苯)-氨基甲酸甲酯[(3-meth-oxycarbonylamino-2-methyl-phenyl)-cabamic acid metylester,8]、4, 4'-二甲氧基酰胺基二苯甲烷[4, 4′-diphenylmethanebis (methyl) carbamate 9]、3, 3'-二羟基-2, 6-双(p-羟基苄基)-5-甲氧基苯[3, 3′-dihydroxy-2, 6-bis (p-hydroxybenzyl)-5-methoxybibenzyl,10)、3', 5-二羟基-2-(4-羟基苄基)-3-甲氧基苯[3', 5-dihydroxy-2-(4-hydroxybenzyl)-3-methoxybibenzyl,11]、3, 3'-二羟基-2-(4-羟基苄基)-5-甲氧基苯[3, 3'-dihydroxy-2-(4-hydroxybenzyl)-5-methoxybibenzyl,12]、补骨脂宁(corylin,13)、山药素III(batatasin III,14)、新补骨脂异黄酮(neobavaisoflavone,15)、异补骨脂查耳酮(isobavachalcone,16)、2, 6, 2', 6'-四甲基-4, 4-双(2, 3-环氧基-1-羟基丙基)联苯[2, 6, 2′, 6′-tetramethoxy-4, 4′-bis(2, 3-epoxy-1-hydroxypropyl)biphenyl,17]、coelonin(18)、石斛酚(gigantol,19)、β-谷甾醇(β-sitostero,20)。其中化合物7~9、13、15~17为首次从该属植物中分离得到,化合物5、6为首次从该植物中分离得到。体外实验结果显示化合物1和17可以剂量依赖性地抑制由H2O2诱导产生的神经细胞凋亡,并且推测其发挥神经保护作用的机制可能是通过减轻氧化损伤实现的。
1 仪器与材料JASCO制备型高效液相色谱仪,PU-2087 Pump加压泵,SPD-10 AV紫外检测器(日本Jasco公司);Bruker ARX-300核磁共振光谱仪(瑞士Bruker公司);EYELA-N1000、N1100旋转蒸发仪(日本东京理化);CO2培养箱(日本Sanyo公司);水平层流洁净工作台(上海上净净化设备有限公司);倒置显微镜(日本Olympus公司);低/高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);酶标仪(伯乐生命医学产品有限公司);紫外线分析灯(德国Heruens公司);Shimadzu AUW120D十万分之一分析天平(日本Himadzu公司);YMC-Pack Pro ODS-A C18制备反相色谱柱(250 mm×10 mm,10μm)。
药材于2013年12月购自辽宁省沈阳市,经沈阳药科大学路金才教授鉴定为杜鹃兰的假鳞茎,标本(LS2013CA)保存于沈阳军区总医院药剂科。
神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株(由沈阳药科大学杨静玉教授实验室惠赠);DMEM培养液(美国Hyclone公司);胎牛血清(56 ℃灭活30 min,美国Hyclone公司);胰酶(美国Sigma公司);EDTA(美国Sino公司);台盼蓝(美国Amresco公司);四甲基偶氮唑蓝(MTT,美国Sigma公司);LDH检测试剂盒(南京建成生物科技有限公司);H2O2(国药集团);薄层色谱硅胶G、硅胶GF254、柱色谱硅胶(青岛海洋化工厂);Sephadex LH-20(美国Amersham Biosciences公司);氘代试剂(美国CIL公司);HPLC使用的试剂为色谱纯(美国Sigma公司);活性测试中使用的DMSO为生物级;其他化学试剂均为分析纯(国药集团化学试剂有限公司,天津博迪化工股份有限公司)。
2 提取与分离山慈菇(10.0 kg)干燥后粉碎,药材粉末加3倍体积55%乙醇加热回流提取3次,每次2 h,合并提取液,减压回收溶剂,浓缩后得总浸膏。总浸膏用水分散后,依次用石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯、正丁醇萃取3次,收集石油醚、二氯甲烷、醋酸乙酯和正丁醇层,减压浓缩回收溶剂,蒸干,最终得到石油醚部位浸膏20 g、二氯甲烷部位浸膏22 g、醋酸乙酯部位浸膏42 g、正丁醇部位浸膏91 g。
取醋酸乙酯部位浸膏42 g,经硅胶柱色谱分离,以二氯甲烷-甲醇(100:0→0:100)梯度洗脱,得到8个流分Fr. 1~8。其中Fr. 5经ODS柱色谱,甲醇-水(100:0→0:100)梯度洗脱,Sephadex LH-20甲醇-水(1:1)等度洗脱,半制备高效液相分离纯化,得到化合物1(12.3 mg)、2(10.2 mg)和3(9.8 mg);Fr. 4经ODS柱色谱,甲醇-水(100:0→0:100)梯度洗脱,半制备高效液相分离纯化,得到化合物4(20.4 mg)、5(6.4 mg)、6(17.4 mg)和7(14.8 mg);Fr. 6经ODS柱色谱,甲醇-水(100:0→0:100)梯度洗脱,Sephadex LH-20甲醇-水(1:1)等度洗脱,半制备高效液相分离纯化,得到化合物11(11.6 mg)、12(21.3 mg)、13(7.8 mg)和14(6.9 mg);Fr. 3经硅胶柱色谱分离,以二氯甲烷-甲醇(100:0→0:100)梯度洗脱,Sephadex LH-20二氯甲烷-甲醇(1:1)等度洗脱,半制备高效液相分离纯化,得到化合物15(17.4 mg)、16(14.8 mg)、17(10.2 mg)和18(9.8 mg)。Fr. 8经ODS柱色谱,甲醇-水(100:0→0:100)梯度洗脱,半制备高效液相分离纯化,得到化合物8(11.3 mg)、9(14.4 mg)、10(13.2 mg)和19(8.5 mg)。其中Fr. 2用硅胶柱色谱分离,以二氯甲烷-甲醇(100:0→0:100)梯度洗脱,经重结晶得化合物20(26.3 mg)。
3 结构鉴定化合物1:C34H46O17,黄色油状物(甲醇),GF254薄层板在254 nm紫外下有暗斑,365 nm下为蓝色荧光。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 2.64 (1H, d, J=15.7 Hz, H-3a), 2.93 (1H, d, J=15.7 Hz, H-3b), 1.56 (1H, m, H-5a), 1.71 (1H, m, H-5b), 1.64 (1H, m, H-6), 0.79 (3H, d, J=6.5 Hz, H-7), 0.91 (3H, d, J=6.5 Hz, H-8), 7.07 (4H, m, H-3′, 3″, 5′, 5″), 7.25 (4H, m, H-2′, 2″, 6′, 6″), 4.99 (4H, s, H-7′, 7″), 4.90 (2H, m, H-1′′′, 1′′′′), 3.40~3.90 (12H, m)为2个糖上的氢信号;13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 171.6 (C-1), 76.6 (C-2), 46.1 (C-3), 176.0 (C-4), 46.1 (C-5), 24.7 (C-6), 23.9 (C-7), 25.0 (C-8), 130.8 (C-1′), 131.0 (C-2′), 117.5 (C-3′), 159.1 (C-4′), 117.5 (C-5′), 131.0 (C-6′), 67.9 (C-7′), 131.1 (C-1″), 131.2 (C-2″), 117.5 (C-3′′), 159.2 (C-4′′), 117.5 (C-5′′), 131.2 (C-6″), 67.2 (C-7″), 102.2 (C-1′′′, 1′′′′), 74.8 (C-2′′′, 2′′′′), 77.9 (C-3′′′, 3′′′′), 71.3 (C-4′′′, 4′′′′), 78.1 (C-5′′′, 5′′′′), 62.5 (C-6′′′, 6′′′′)。以上数据与文献报道[3]基本一致,故鉴定化合物1为双[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基苹果酸酯。
化合物2:C23H32O11,黄色油状物(甲醇),GF254薄层板在254 nm紫外下有暗斑,365 nm下为蓝色荧光。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 2.64 (1H, d, J=15.7 Hz, H-3a), 2.93 (1H, d, J=15.7 Hz, H-3b), 1.56 (1H, m, H-5a), 1.71 (1H, m, H-5b), 1.64 (1H, m, H-6), 0.79 (3H, d, J=6.5 Hz, H-7), 0.91 (3H, d, J=6.5 Hz, H-8), 3.57 (3H, s, H-OCH3), 7.34 (2H, d, J=8.60 Hz, C-2′, 6′), 7.10 (2H, d, J=8.60 Hz, C-3′, 5′), 5.12 (2H, dd, J=12.2, 18.4 Hz, H-7′a, 7′b), 4.91 (1H, m, H-1′′′), 3.40~3.90 (6H, m)为糖上的氢信号;13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 171.6 (C-1), 76.6 (C-2), 46.1 (C-3), 176.0 (C-4), 46.1 (C-5), 24.7 (C-6), 23.9 (C-7), 25.0 (C-8), 52.1 (-OCH3), 130.8 (C-1′), 131.0 (C-2′), 117.5 (C-3′), 159.1 (C-4′), 117.5 (C-5′), 131.0 (C-6′), 67.9 (C-7′), 102.2 (C-1″), 74.8 (C-2″), 77.9 (C-3″), 71.3 (C-4″), 78.1 (C-5″), 62.5 (C-6″)。以上数据与文献报道[4]基本一致,故鉴定化合物2为1-[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-2-异丁基-4-甲基苹果酸酯。
化合物3:C25H30O11,黄色油状物(甲醇),GF254薄层板在254 nm紫外下有暗斑,365 nm下为蓝色荧光。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 2.62 (1H, d, J=15.7 Hz, H-3a), 2.98 (1H, d, J=15.7 Hz, H-3b), 7.28 (2H, d, J=8.5 Hz, H-2′, 6′), 7.11 (2H, d, J=8.5 Hz, H-3′, 5′), 5.07 (2H, s, H-7′), 7.08 (2H, m, H-2″, 6″), 7.20 (2H, m, H-3″, 5″), 3.00 (1H, d, J=13.7 Hz, H-7″a), 2.93 (1H, d, J=13.7 Hz, H-7″b), 3.38 (3H, s, H-OCH3), 4.93 (1H, m, H-1′′′), 3.40~3.90 (6H, m)为糖上的氢信号;13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 175.2 (C-1), 71.1 (C-2), 44.1 (C-3), 172.3 (C-4), 130.8 (C-1′), 131.0 (C-2′), 117.5 (C-3′), 159.1 (C-4′), 117.5 (C-5′), 131.0 (C-6′), 136.6 (C-1″), 131.5 (C-2″), 129.1 (C-3″), 127.9 (C-4″), 129.1 (C-5″), 131.5 (C-6″), 46.4 (C-7″), 102.3 (C-1′′′), 74.9 (C-2′′′), 78.0 (C-3′′′), 71.4 (C-4′′′), 78.2 (C-5′′′), 62.5 (C-6′′′)。以上数据与文献报道[4]基本一致,故鉴定化合物3为1-[4-(β-D-吡喃葡萄糖氧)苄基]-4-甲基-2-苄基苹果酸酯。
化合物4:C21H26O8,黄色油状物(甲醇),GF254薄层板在254 nm紫外下有暗斑,365 nm下为蓝色荧光。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 6.51 (2H, m, H-2, 4), 6.40 (1H, m, H-6), 6.62 (3H, m, H-2′, 4′, 6′), 7.05 (1H, t, J=7.7 Hz, H-5′), 3.72 (3H, s, 5-OCH3), 2.81 (4H, m, -CH2-CH2-), 4.81 (1H, d, J=7.3 Hz, H-1″), 3.35~3.88 (6H, m)为糖上其余的氢信号;13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 144.6 (C-1), 110.3 (C-2), 158.3 (C-3), 102.4 (C-4), 162.0 (C-5), 109.4 (C-6), 145.4 (C-1′), 116.4 (C-2′), 160.2 (C-3′), 113.8 (C-4′), 130.2 (C-5′), 120.9 (C-6′), 38.7, 39.1 (-CH2-CH2-), 55.7 (-OCH3), 101.6 (C-1″), 78.1 (C-2″), 78.0 (C-3″), 74.9 (C-4″), 71.4 (C-5″), 62.5 (C-6″)。以上数据与文献报道[5]基本一致,故鉴定化合物4为山药素III-3-葡萄糖苷。
化合物5:C11H12O6,无色针状晶体(甲醇),GF254薄层板在254 nm紫外下有暗斑,365 nm下为蓝色荧光。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 2.96 (1H, d, J=16.2 Hz, H-3a), 2.56 (1H, d, J=16.2 Hz, H-3b), 7.07 (2H, d, J=8.6 Hz, H-2′, 6′), 6.69 (2H, d, J=8.6 Hz, H-3′, 5′), 2.95 (1H, d, J=14.0 Hz, H-7′a), 2.85 (1H, d, J=14.0 Hz, H-7′b);13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 174.2 (C-1), 76.8 (C-2), 43.6 (C-3), 177.6 (C-4), 127.6 (C-1′), 132.5 (C-2′, 6′), 115.8 (C-3′, 5′), 157.3 (C-4′)。以上数据与文献报道[6]基本一致,故鉴定化合物5为红果酸。
化合物6:C28H34O15,白色无定形粉末(甲醇),GF254薄层板在254 nm紫外下有暗斑,365 nm下为蓝色荧光。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 5.50 (1H, m, H-3a), 2.77 (1H, dd, J=3.1, 7.2 Hz, H-3b), 12.02 (1H, s, 5-OH), 6.11 (1H, d, J=1.9 Hz, H-6), 6.13 (1H, d, J=1.9 Hz, H-8), 6.93 (3H, m, H-2′, 5′, 6′), 3.37 (3H, s, 4′-OCH3), 4.98 (1H, t, J=6.8 Hz, H-1″), 4.51 (1H, brs, H-1′′′), 1.08 (3H, dd, J=6.1, 2.0 Hz, H-6″), 3.15~3.63 (12H, m)为糖上其余的质子信号;13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 78.3 (C-2), 42.2 (C-3), 197.0 (C-4), 162.5 (C-5), 96.3 (C-6), 163.0 (C-7), 95.6 (C-8), 165.1 (C-9), 103.3 (C-10), 130.9 (C-1′), 118.0 (C-2′), 146.4 (C-3′), 148.0 (C-4′), 112.0 (C-5′), 114.1 (C-6′), 55.7 (-OCH3), 99.4 (C-1″), 73.0 (C-2″), 70.2 (C-3″), 75.5 (C-4″), 76.2 (C-5″), 66.0 (C-6″), 100.6 (C-1′′′), 69.6 (C-2′′′), 70.7 (C-3′′′), 72.0 (C-4′′′), 68.3 (C-5′′′), 17.8 (C-6′′′)。以上数据与文献报道[7]基本一致,故鉴定化合物6为橙皮苷。
化合物7:C11H14N2O4,淡黄色无定形粉末(甲醇),GF254薄层板在254 nm紫外下有暗斑,365 nm下为蓝色荧光。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 7.52 (1H, s, H-2), 7.17 (1H, d, J=8.3 Hz, H-5), 7.09 (1H, d, J=8.3 Hz, H-6), 3.73 (3H, s, 2″-OCH3), 3.72 (3H, s, 2′-OCH3), 2.18 (3H, s, 4-CH3);13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ: 137.2 (C-1), 115.0 (C-2), 136.5 (C-3), 125.6 (C-4), 130.3 (C-5), 115.0 (C-6), 17.1 (4-CH3), 154.8 (C-2″), 154.0 (C-2′), 51.6 (2″-OCH3), 51.5 (2′-OCH3)。以上数据与文献报道[8]基本一致,故鉴定化合物7为1, 3-二甲氧基酰胺基-4-甲基苯。
化合物8:C11H14N2O4,淡黄色粉末(甲醇),GF254薄层板在254 nm紫外下有暗斑,365 nm下为蓝色荧光。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.12 (3H, s, H-4, 5, 6), 2.03 (3H, s, 2-CH3), 3.63 (6H, s, 2′, 2″-OCH3);13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ: 136.8 (C-1, 3), 127.6 (C-2), 125.3 (C-5), 22.3 (C-4, 6), 155.0 (C-2′, 2″), 51.6 (2′, 2″-OCH3), 17.1 (2-CH3)。以上数据与文献报道[9]基本一致,故鉴定化合物8为(3-甲氧基酰胺基-2-甲基苯)-氨基甲酸甲酯。
化合物9:淡黄色粉末(甲醇),GF254薄层板在254 nm紫外下有暗斑,365 nm下为蓝色荧光。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 7.31 (4H, d, J=8.6 Hz, H-2, 6, 2′, 6′), 7.09 (4H, d, J=8.6 Hz, H-3, 5, 3′, 5′), 3.86 (2H, s, H-9), 3.71 (6H, s, 8, 8′-OCH3);13C-NMR (150 MHz, DMSO-d6) δ: 137.1 (C-1, 1′), 135.5 (C-4, 4′), 128.9 (C-2, 6, 2′, 6′), 118.4 (C-3, 5, 3′, 5′), 154.0 (C-8, 8′), 51.6 (C-OCH3), 17.1 (C-9)。以上数据与文献报道[10]基本一致,故鉴定化合物9为4, 4'-二甲氧基酰胺基二苯甲烷。
化合物10:C29H28O5,无色粉末(甲醇),GF254薄层板在254 nm紫外下有暗斑,365 nm下为蓝色荧光。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 2.29 (2H, m, α-CH2-), 2.69 (2H, m, β-CH2-), 3.91 (2H, s, 2-CH2-), 3.94 (2H, s, 6-CH2-), 3.76 (3H, s, 5-OCH3), 6.48 (1H, s, H-4), 6.62 (2H, d, J=8.5 Hz, H-3″, 5″), 6.86 (2H, d, J=8.5 Hz, H-2″, 6″), 6.64 (2H, d, J=8.5 Hz, H-3′′′, 5′′′), 6.93 (2H, d, J=8.5 Hz, H-2′′′, 6′′′), 7.02 (1H, t, J=7.8 Hz, H-5′), 6.50 (1H, m, H-2′), 6.46 (1H, m, H-4′), 6.56 (1H, m, H-6′);13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 142.7 (C-1), 120.3 (C-2), 158.3 (C-3), 98.1 (C-4), 158.4 (C-5), 119.6 (C-6), 145.2 (C-1′), 113.7 (C-2′), 155.9 (C-3′), 116.0 (C-4′), 130.2 (C-5′), 120.5 (C-6′), 55.9 (-OCH3), 37.7, 33.3 (-CH2-CH2-), 31.3 (6-CH2-), 31.1 (2-CH2-), 134.3 (C-1″), 115.9 (C-3″, 5″), 129.9 (C-2″, 6″), 155.9 (C-4″, 4′′′), 134.4 (C-1′′′), 116.0 (C-3′′′, 5′′′), 130.0 (C-2′′′, 6′′′)。以上数据与文献报道[11]基本一致,故鉴定化合物10为3, 3'-二羟基-2, 6-双(p-羟基苄基)-5-甲氧基苯。
化合物11:白色粉末(甲醇),GF254薄层板在254 nm紫外下有暗斑,365 nm下为蓝色荧光。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 6.30 (1H, d, J=2.2 Hz, H-4), 6.35 (1H, d, J=2.2 Hz, H-6), 6.65 (2H, d, J=8.5 Hz, H-3′, 5′), 6.88 (2H, d, J=8.5 Hz, H-2′, 6′), 3.85 (2H, s, -CH2-), 2.57(2H, m, α-CH2-), 2.71 (2H, m, β-CH2-), 3.76 (3H, s, H-OCH3), 6.55 (1H, s, H-2′), 6.57 (1H, m, H-4′), 7.05 (1H, t, J=8.5 Hz, H-5′), 6.59 (1H, m, H-6′);13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 143.7 (C-1), 119.9 (C-2), 160.1 (C-3), 97.9 (C-4), 157.5 (C-5), 109.3 (C-6), 144.9 (C-1′), 113.7 (C-2′), 158.3 (C-3′), 116.2 (C-4′), 130.2 (C-5′), 120.7 (C-6′), 134.2 (C-1″), 130.0 (C-2″, 6″), 115.9 (C-3″, 5″), 156.0 (C-4″), 38.6, 36.4 (-CH2-CH2-), 30.5 (-CH2-), 55.9 (-OCH3)。以上数据与文献报道[12]基本一致,故鉴定化合物11为3', 5-二羟基-2-(4-羟基苄基)-3-甲氧基苯。
化合物12:C22H22O4,白色粉末(甲醇),GF254薄层板在254 nm紫外下有暗斑,365 nm下为蓝色荧光。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 6.32 (1H, d, J=2.2 Hz, H-2), 6.25 (1H, d, J=2.2 Hz, H-4), 6.66 (2H, d, J=8.5 Hz, H-3′, 5′), 6.95 (2H, d, J=8.5 Hz, H-2′, 6′), 3.89 (2H, s, -CH2-), 2.56 (2H, m, α-CH2-), 2.73 (2H, m, β-CH2-), 3.72 (3H, s, H-OCH3), 6.56 (1H, s, H-2′), 6.57 (1H, m, H-4′), 7.05 (1H, t, J=8.5 Hz, H-5′), 6.60 (1H, m, H-6′);13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 143.7 (C-1), 119.9 (C-2), 157.5 (C-3), 100.1 (C-4), 160.0 (C-5), 107.2 (C-6), 144.9 (C-1′), 113.7 (C-2′), 158.3 (C-3′), 116.2 (C-4′), 130.2 (C-5′), 120.7 (C-6′), 134.2 (C-1″), 130.0 (C-2″, 6″), 115.9 (C-3″, 5″), 156.0 (C-4″), 38.5, 36.6 (-CH2-CH2-), 30.7 (-CH2-), 55.5 (-OCH3)。以上数据与文献报道[12]基本一致,故鉴定化合物12为3, 3'-二羟基-2-(4-羟基苄基)-5-甲氧基苯。
化合物13:C20H16O4,黄色针状结晶(甲醇),GF254薄层板在254 nm紫外下有暗斑,365 nm下为蓝色荧光。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.33 (1H, s, H-2), 7.96 (1H, d, J=8.6 Hz, H-5), 7.20 (2H, m, H-6, 8), 6.86 (1H, d, J=2.0 Hz, H-2′), 6.78 (1H, d, J=8.2 Hz, H-5′), 6.93 (1H, dd, J=2.0, 8.2 Hz, H-6′), 5.77 (1H, d, J=9.9 Hz, H-8′), 6.42 (1H, d, J=9.9 Hz, H-7′), 1.39 (6H, s, -CH3);13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 152.2 (C-2), 123.1 (C-3), 174.5 (C-4), 127.3 (C-5), 115.5 (C-6), 162.6 (C-7), 102.1 (C-8), 157.4 (C-9), 115.5 (C-10), 123.1 (C-1′), 129.6 (C-2′), 116.6 (C-3′), 153.1 (C-4′), 121.7 (C-5′), 131.2 (C-6′), 121.7 (C-7′), 129.6 (C-8′), 76.2 (C-9′), 27.7 (-CH3)。以上数据与文献报道[12]基本一致,故鉴定化合物13为补骨脂宁。
化合物14:C15H16O3,无色粉末(甲醇),GF254薄层板在254 nm紫外下有暗斑,365 nm下为蓝色荧光。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 6.24 (1H, s, H-2), 6.20 (1H, s, H-4), 6.26 (1H, s, H-6), 6.64 (1H, s, H-2′), 6.61 (1H, d, J=8.1 Hz, H-4′), 7.07 (1H, t, J=8.1 Hz, H-5′), 6.66 (1H, d, J=8.1 Hz, H-6′), 3.71 (3H, s, H-OCH3), 2.78 (4H, m, -CH2-CH2-);13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 145.4 (C-1), 109.0 (C-2), 159.3 (C-3), 99.9 (C-4), 162.2 (C-5), 106.5 (C-6), 144.7 (C-1′), 116.3 (C-2′), 158.3 (C-3′), 113.7 (C-4′), 130.2 (C-5′), 120.8 (C-6′), 55.5 (-OCH3), 38.8, 39.2 (-CH2-CH2-)。以上数据与文献报道[13]基本一致,故鉴定化合物14为山药素Ⅲ。
化合物15:C20H18O4,白色粉末(甲醇),GF254薄层板在254 nm紫外下有暗斑,365 nm下为蓝色荧光。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 8.23 (1H, s, H-2), 7.95 (1H, d, J=8.3 Hz, H-5), 6.81 (1H, d, J=8.3 Hz, H-6), 6.84 (1H, d, J=2.0 Hz, H-8), 7.23 (1H, d, J=2.0 Hz, H-2′), 6.93 (1H, dd, J=2.0, 8.3 Hz, H-5′), 7.20 (1H, dd, J=2.0, 8.3 Hz, H-6′), 5.30 (1H, m, H-1″), 3.23 (2H, d, J=7.4 Hz, H-2″), 1.68 (6H, s, -CH3);13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 152.7 (C-2), 123.7 (C-3), 174.7 (C-4), 127.3 (C-5), 115.1 (C-6), 162.6, (C-7), 102.1 (C-8), 157.4 (C-9), 116.7 (C-10), 131.1 (C-1′), 122.5 (C-2′), 127.2 (C-3′), 154.8 (C-4′), 114.5 (C-5′), 127.1 (C-6′), 28.2 (C-1″), 122.9 (C-2″), 130.0 (C-3″), 17.6 (C-4″), 25.5 (C-5″)。其余碳信号均为查耳酮骨架上碳的信号。以上数据与文献报道[14]基本一致,故鉴定化合物15为新补骨脂异黄酮。
化合物16:C20H20O4,黄色粉末(甲醇),GF254薄层板在254 nm紫外下有暗斑,365 nm下为蓝色荧光。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 8.02 (1H, d, J=8.9 Hz, H-5), 6.47 (1H, d, J=8.9 Hz, H-6), 6.83 (2H, d, J=8.5 Hz, H-3′, 5′), 7.47 (4H, m, H-α, β, 2′, 6′), 3.23 (2H, d, J=7.0 Hz, H-1″), 5.17 (1H, t, J=7.0 Hz, H-2″), 1.61 (3H, s, H-4″), 1.72 (3H, s, H-5″);13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 191.8 (-C=O-), 117.4 (C-α), 144.1 (C-β), 129.8 (C-1′), 131.2 (C-2′, 6′), 115.9 (C-3′, 5′), 160.3 (C-4′), 114.5 (C-1), 163.6 (C-2), 117.4 (C-3), 162.3 (C-4), 107.3 (C-5), 129.8 (C-6), 25.5 (C-1″), 122.3 (C-2″), 130.5 (C-3″), 17.7 (C-4″), 21.3 (C-5″)。其余碳信号均为查耳酮骨架上碳的信号。以上数据与文献报道[14]基本一致,故鉴定化合物16为异补骨脂查耳酮。
化合物17:C22H26O8,无定形粉末(甲醇),GF254薄层板在254 nm紫外下有暗斑,365 nm下为蓝色荧光。1H-NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ: 6.60 (4H, m, H-3, 3′, 5, 5′), 4.61 (2H, d, J=4.2 Hz, H-7, 7′), 3.05 (2H, m, H-8a, 8a′), 3.78 (2H, m, H-9a, 9a′), 4.16 (2H, m, H-9b, 9b′), 3.75 (12H, s, 4×-OCH3);13C-NMR (100 MHz, DMSO-d6) δ: 131.4 (C-1, 1′), 147.9 (C-2, 2′, 6, 6′), 103.6 (C-3, 3′, 5, 5′), 134.9 (C-4, 4′), 85.3 (C-7, 7′), 53.6 (C-8, 8′), 71.1 (C-9, 9′), 56.0 (4×-OCH3)。以上数据与文献报道[15]基本一致,故鉴定化合物17为2, 6, 2', 6'-四甲基-4, 4-双(2, 3-环氧基-1-羟基丙基)联苯。
化合物18:C15H14O3,无色粉末(甲醇),GF254薄层板在254 nm紫外下有暗斑,365 nm下为蓝色荧光。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 6.41 (1H, d, J=2.5 Hz, H-1), 6.31 (1H, d, J=2.5 Hz, H-3), 8.02 (1H, d, J=9.4 Hz, H-5), 6.64 (1H, m, H-6), 6.62 (1H, m, H-8), 2.63 (4H, m, -CH2-CH2-), 3.82 (3H, s, -OCH3);13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 108.3 (C-1), 156.0 (C-2), 99.2 (C-3), 159.1 (C-4), 116.8 (C-4a), 126.2 (C-4b), 130.0 (C-5), 115.0 (C-6), 157.4 (C-7), 113.6 (C-8), 141.8 (C-8a), 31.2 (C-9), 31.8 (C-10), 140.5 (C-10a), 55.8 (-OCH3)。以上数据与文献报道[16]基本一致,故鉴定化合物18为coelonin。
化合物19:C16H18O4,白色粉末(甲醇),GF254薄层板在254 nm紫外下有暗斑,365 nm下为蓝色荧光。1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ: 6.68 (1H, s, H-2″), 6.61 (1H, d, J=8.3 Hz, H-5″), 6.70 (1H, d, J=8.3 Hz, H-6″), 6.23 (2H, m, H-2′, 6′), 6.19 (1H, d, J=1.3 Hz, H-4′), 2.77 (4H, m, -CH2-CH2-), 3.79 (3H, s, 3′-OCH3), 3.71 (3H, s, 3″-OCH3);13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ: 38.5 (C-1), 39.6 (C-2), 145.5 (C-1′), 109.2 (C-2′), 159.4 (C-3′), 99.99 (C-4′), 162.2 (C-5′), 106.7 (C-6′), 134.7 (C-1″), 116.0 (C-2″), 148.6 (C-3″), 145.5 (C-4″), 113.4 (C-5″), 121.9 (C-6″)。以上数据与文献报道[17]基本一致,故鉴定化合物19为石斛酚。
化合物20:无色针晶(二氯甲烷),薄层TLC检测,365 nm下无荧光,254 nm处无暗斑,10%硫酸乙醇均成紫红色,与β-谷甾醇对照品共薄层,不同的展开系统氯仿-丙酮、石油醚-丙酮、环己烷-醋酸乙酯中展开,其薄层斑点Rf值和显色均一致,故鉴定化合物20为β-谷甾醇。
4 神经保护实验 4.1 SH-SY5Y细胞株H2O2损伤模型的建立取对数生长期的SH-SY5Y细胞,接种于96孔培养板中,调整细胞密度为8×104个/mL,每孔加入100 μL含细胞的培养液,置37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h使其贴壁。然后分别对其进行损伤时间和损伤浓度的考察。
4.1.1 损伤浓度考察设定6个浓度梯度(25~800 μmol/L),每个浓度设3个复孔,每孔分别给予100 μL不同浓度的含H2O2的培养液,置37 ℃、5% CO2培养箱中培养。同时设定3个空白对照孔。2 h后弃去上清,每孔中加入MTT(5 mg/mL)150 μL,继续在孵箱中孵育4 h。弃去上清,每孔加入150 μL DMSO,震荡10 min后,在490 nm处测定吸光度(A)值。实验平行重复3次。按照公式计算各浓度损伤组的细胞存活率,结果如图 1所示。
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图 1 不同浓度的H2O2对细胞存活率的影响(x±s, n=3) Fig.1 Effect of H2O2at different concentration on cell survival rate (x±s, n=3) |
细胞存活率=样品组A值平均值/对照组A值平均值
4.1.2 损伤时间考察设定6个时间点(30~180 min),每个点设3个复孔,每孔中分别给予100 μL浓度为200 μmol/L的含H2O2的培养液,置37 ℃、5% CO2培养箱中培养不同时间。同时设定3个空白对照孔。弃去上清,每孔中加入MTT(5 mg/mL)150 μL,继续在孵箱中孵育4 h。弃去上清,每孔加入150 μL DMSO,震荡10 min后,在490 nm处测定A值。实验平行重复3次。按照公式计算各浓度损伤组的细胞存活率,结果如图 2所示。
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图 2 H2O2不同作用时间对细胞存活率的影响(x±s, n=3) Fig.2 Effect of H2O2 in different acting time on cell survival rate (x±s, n=3) |
根据实验结果选取200 μmol/L的H2O2与SH-SY5Y细胞作用2 h作为造模条件。
4.2 MTT实验测试单体化合物的神经保护活性每个化合物加DMSO溶解配制成浓度为100 mmol/L的储备液备用,取对数生长期的SH-SY5Y细胞,接种于96孔培养板中,细胞数密度为8×104个/mL,每孔加入100 μL含细胞培养液,置于培养箱中培养24 h。然后对照组和造模组加入单纯培养液,其余加入待测药物,给药终浓度设置为25、50、100 μmol/L,每个浓度设3个复孔。置于CO2培养箱中培养4 h后,对照组加单纯培养液,其余各组给予100 μL含H2O2的培养液使H2O2终浓度为200 μmol/L,放入培养箱中继续培养2 h后吸去每孔中的上清液,再向每孔加入含MTT(5 mg/mL)的培养液150 μL,培养箱中孵育4 h。弃去上清,每孔加入150 μL DMSO震荡10 min,在490 nm处测定A值。结果见图 3。
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图 3 MTT实验结果(x±s, n=3) Fig.3 MTT assay (x±s, n=3) |
实验结果显示,化合物1和17可以剂量依赖性地减轻由H2O2诱导产生的氧化损伤,表现出显著的神经保护活性。
5 结论在分离鉴定的化合物中,化合物7~9、13、15~17为首次从该属植物中分离得到,化合物5、6为首次从该植物中分离得到。MTT实验结果显示,化合物1和17可以显著地剂量依赖性地抑制由H2O2诱导产生的神经细胞凋亡,其发挥神经保护作用的机制很可能是通过减轻氧化损伤实现的,但具体的作用靶点以及影响的信号通路还需进一步实验证实。
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