2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.18.020 |
2. 河北医科大学, 河北 石家庄 050011 ;
3. 河北省中医院, 河北 石家庄 050011
2. Hebei Medicine University, Shijiazhuang 050011, China ;
3. Hebei Provincail Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050011, China
膜性肾病是原发性肾小球肾炎常见的病理类型之一，其发病主要是由于肾小球上皮下免疫复合物沉积，引起补体活化及膜攻击复合物形成，最终导致足细胞损伤所引起。近年来，随着细胞凋亡研究的不断深入，证实细胞凋亡参与膜性肾病的发生发展，而且是造成肾小球硬化、终末期肾病的重要因素之一[1]。
降脂通络软胶囊的主要成分为姜黄中提取的总姜黄素，具有行气活血、化瘀通络的作用，在临床上主要用于高脂血症及糖尿病、冠心病的辅助调脂治疗[2-3]。对于姜黄素在糖尿病肾病、阿霉素肾病中的应用已有相关研究[4-5]，但是在膜性肾病中的治疗应用尚未见报道。本实验就膜性肾病大鼠肾组织凋亡相关基因Bcl-2、Bad水平变化及降脂通络软胶囊干预的影响进行研究，探讨降脂通络软胶囊对膜性肾病大鼠的肾保护作用及其作用机制，为其临床应用提供理论依据。
1 材料 1.1 动物健康清洁级雄性SD大鼠60只，体质量为（180±20）g，由河北医科大学动物实验中心提供，动物许可证号SYXK（冀）2008-0026。
1.2 药物及主要试剂降脂通络软胶囊，神威药业集团有限公司生产，批号150917；盐酸贝那普利，深圳信立泰药业股份有限公司生产，批号FA20150902。牛血清白蛋白（BSA）、碳化二亚胺、弗氏不完全佐剂、羊抗大鼠IgG，美国Sigma公司；无水乙二胺，上海仪峰化学制品厂；FITC标记抗小鼠IgG、FITC标记抗山羊IgG、羊抗大鼠Bcl-2多克隆抗体、羊抗大鼠Bad多克隆抗体、SABC免疫组化试剂盒，北京中杉生物技术有限公司；小鼠抗大鼠C3，美国Santa Cruz公司；TRNzol总RNA提取试剂，天根生化科技有限公司；PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Erase，TaKaRa公司；SYBR® Premix Ex TaqTM II（Tli RNaseH Plus），ROX plus，TaKaRa公司；DL2 000 DNA Marker，TaKaRa公司；引物合成，Invitrogen公司。
1.3 仪器透析袋，美国Fisher Scientific公司；真空冷冻干燥仪，北京博医康实验仪器有限公司；Hitachi 7170A型全自动生化分析仪，日本日立；H-H·W21·600电热恒温水浴，天津太斯特设备厂；TDL-5-A高速离心机，上海安亭科技仪器厂；BX51T-PHD-J11显微镜，日本Olympus；Image-Pro Plus多功能真彩色细胞图像分析管理系统，美国Media Cybernetics公司；QL-902涡旋振荡仪，海门市其林贝尔公司；NANODROP 2000分光光度计，ABI7500Therno scientific；荧光定量PCR仪，Applied Biosystems公司；H-7650型透射电子显微镜，日本HITACHI株式会社。
2 方法 2.1 模型的制备60只SD大鼠普通饲料适应性饲养1周，检测尿蛋白均为阴性者纳入实验。随机选取10只为对照组，其余大鼠进行造模。参照改良Border法[1]制作阳离子化牛血清白蛋白（C-BSA）药物，将1 mg C-BSA加入到0.5 mL PBS中，并与等量弗氏不完全佐剂混合，充分乳化，于腋下、腹股沟多点sc进行预免疫，隔日1次，共3次。然后进行正式免疫，将2.5 mg C-BSA加入到1 mL PBS中进行尾iv，每周3次，共4周，造模结束后大鼠24 h尿蛋白定量（UTP）≥20 mg即为造模成功。
2.2 动物分组、给药及指标检测将造模成功大鼠随机分为模型组、阳性对照贝那普利（10 mg/kg）组及降脂通络软胶囊（25、50、100 mg/kg）组，每组各10只。对照组与模型组大鼠每日ig生理盐水3 mL；贝那普利组大鼠ig盐酸贝那普利（按10 mg/kg溶于3 mL蒸馏水）；降脂通络软胶囊组大鼠ig降脂通络软胶囊（按25、50、100 mg/kg溶于3 mL蒸馏水），各组均每天给药1次，连续给药4周。于实验结束前1 d禁食不禁水，留取大鼠24 h尿液，采用双缩脲法测定大鼠UTP。大鼠禁食12 h后，麻醉动物，腹主动脉取血，采用全自动生化分析仪检测大鼠血清总胆固醇（TC）、三酰甘油（TG）、总蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、尿素氮（BUN）、肌酐（Scr）水平。
2.3 电镜检查取肾下极皮质1 mm3，迅速投入4 ℃预冷的2.5%戊二醛固定液1 h，在4 ℃ 1%的锇酸中固定2 h，乙醇梯度脱水，100%丙酮脱水，丙酮和树脂混合液中浸透15 min，纯树脂中浸透30 min，环氧树脂包埋，切片，醋酸铀、柠檬酸铅双重电子染色，采用透射电镜观察肾小球基底膜、足细胞等的变化情况。
2.4 IgG和补体C3检测采用间接免疫荧光法检测lgG和补体C3的量。取新鲜肾皮质组织，在冰上制成5 μm切片后经冷丙酮固定5～10 min，晾干；然后用0.01 mol/L PBS冲洗5 min×3次；滴加1滴（5 μL）一抗（1:50），置湿盒内于37 ℃孵育30 min，冲洗5 min×3次；滴加1滴（5 μL）FITC标记二抗（1:50），置湿盒内于37 ℃孵育30 min，冲洗5 min×3次；甘油磷酸缓冲液封片，荧光显微镜下观察标本的荧光强度并拍照记录。
2.5 Bcl-2和Bad的免疫组织化学检测采用SABC法检测肾组织中Bcl-2和Bad的表达情况。大鼠肾组织经4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水（70%乙醇30 min、80%乙醇60 min、95%乙醇90 min×2、100%乙醇120 min×2），二甲苯透明40 min，60 ℃石蜡中80 min ×2，铜制模具包埋，组织切片3～5 μm，60 ℃过夜。将切片置于二甲苯20 min、100%乙醇5 min、80%乙醇5 min脱蜡，PBS冲洗2次，3%甲醇双氧水室温放置30 min，蒸馏水冲洗1次，0.1 mol/L PBS冲洗5 min×3。然后进行抗原修复，0.1 mol/L PBS冲洗5 min×3。切片上滴加正常山羊血清封闭液，室温20 min。甩去多余液体，不洗。切片上滴加一抗，4 ℃过夜，0.1 mol/L PBS冲洗5 min×3，滴加二抗，37 ℃、20 min，0.1 mol/L PBS冲洗5 min×3，滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37 ℃、20 min，0.1 mol/L PBS冲洗5 min×3。DAB显色，苏木素复染，中性树脂封片，显微镜观察，阳性结果为可见染色呈棕黄色或棕褐色颗粒表达。
2.6 Bcl-2和Bad的Real-time PCR检测采用Real-time PCR法检测肾组织中Bcl-2和Bad mRNA的表达情况。取新鲜肾皮质，采用Trizol法提取总RNA，进行RNA的浓度测定，然后经逆转录合成cDNA，反应后取5 μL cDNA进行PCR反应。PCR引物由Invitrogen公司设计，引物序列：GAPDH引物（引物长度131 bp）：上游5’-CCTTCCGT-GTTCCTACCCC-3’；下游5’-GCCCAGGATGCCC-TTTAGTG-3’；Bcl-2引物（引物长度101 bp）：上游5’-GGGCTACGAGTGGGATACTGGAG-3’；下游5’-CGGGCGTTCGGTTGCTCT-3’；Bad引物（引物长度104 bp）：上游5’-GGCAGCCAATAAC-AGTCATCA-3’；下游5’-CCTCCTCCATCCCTT-CATCTT-3’。PCR反应条件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、40 s，扩增45个循环。结果以GAPDH为内参，采用2−ΔΔCt法进行相对定量分析。
2.7 统计学处理数据分析采用SPSS 17.0统计软件，数值以x±s表示，计量资料先进行正态性检验和方差齐性检验，方差齐时多组间比较采用单因素方差分析、组间的多重比较采用LSD法，方差不齐时采用秩和检验。
3 结果 3.1 各组大鼠UTP、TC、TG、TP、ALB、BUN和Scr比较与模型组比较，各给药组UTP、TC、TG均有所降低（P＜0.05），各给药组TP、ALB均有所升高（P＜0.05）。降脂通络软胶囊50、100 mg/kg组与贝那普利组UTP、TC、TG、TP、ALB比较差异不显著（P＞0.05），效果优于降脂通络软胶囊25 mg/kg组（P＜0.05）。与对照组比较，各给药组及模型组BUN、Scr均未见明显变化，差异不显著（P＞0.05），结果见表 1。
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表 1 各组大鼠UTP及血清TC、TG、TP、ALB、BUN、Scr比较(x±s, n=10) Table 1 Comparison on UTP and TC, TG, TP, ALB, BUN, and Scr in serum of rats in each group (x±s, n=10) |
3.2 各组大鼠电镜检查结果比较
图 1结果显示，对照组大鼠肾小球基底膜均匀无增厚，足突结构正常无融合；模型组大鼠肾小球上皮下可见少量电子致密物沉积，基底膜呈不规则虫噬状增厚，足突融合、消失；各给药组大鼠肾小球上皮下未见明显电子致密物沉积，基底膜增厚、足突融合情况较模型组为轻。降脂通络软胶囊25 mg/kg组基底膜增厚、足突融合情况较降脂通络软胶囊50、100 mg/kg组与贝那普利组严重。
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图 1 各组大鼠肾组织透射电镜超微结构比较 Fig.1 Comparison on TEM ultrastructure of renal tissue of rats in each group |
3.3 各组大鼠免疫荧光检查结果比较
图 2结果显示，对照组大鼠肾小球未见IgG及C3沉积；模型组大鼠肾小球明显可见IgG和C3沉积于毛细血管攀及部分系膜区，呈粗颗粒状弥漫性分布，荧光染色强阳性；各给药组大鼠肾小球IgG和C3沉积减少，呈细颗粒状沿毛细血管壁散在分布，荧光染色强度较模型组弱。降脂通络软胶囊25 mg/kg组IgG、C3沉积情况及荧光染色强度较降脂通络软胶囊50、100 mg/kg组与贝那普利组严重。
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图 2 各组大鼠肾组织免疫荧光观察比较 Fig.2 Comparison on immunofluorescence of renal tissue of rats in each group |
3.4 各组大鼠肾组织Bcl-2和Bad免疫组化表达情况
图 3结果显示，对照组大鼠Bcl-2呈棕褐色大颗粒状表达于肾小球脏层上皮细胞及肾小管上皮细胞，染色呈强阳性；模型组Bcl-2表达较对照组明显减少，染色强度较弱；各给药组大鼠Bcl-2表达较模型组多，呈棕褐色小颗粒状表达于足细胞及肾小管，染色强度较模型组强；降脂通络软胶囊25 mg/kg组Bcl-2表达情况及染色强度较降脂通络软胶囊50、100 mg/kg组与贝那普利组少。对照组大鼠肾小球未见Bad表达，仅在肾小管上皮细胞胞浆有少量表达，染色强度较弱；模型组Bad表达较对照组明显增多，呈棕褐色颗粒状表达于肾小球足细胞及肾小管上皮细胞，染色呈强阳性；各给药组大鼠Bad表达较模型组减少，染色强度较模型组弱；降脂通络软胶囊25 mg/kg组Bad表达情况及染色强度较降脂通络软胶囊50、100 mg/kg组与贝那普利组多。
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图 3 各组大鼠肾组织Bcl-2和Bad阳性表达比较(免疫组化) Fig.3 Comparison on Bcl-2 and Bad protein expression of rats in each groups (immunohistochemical staining) |
3.5 各组大鼠肾组织Bcl-2和Bad mRNA表达情况
表 2结果显示，与对照组比较，模型组大鼠肾组织可见Bcl-2 mRNA表达减少，Bad mRNA表达增多；与模型组相比，各给药组大鼠肾组织中Bcl-2 mRNA的表达较模型组明显上调，Bad mRNA表达下调，差异显著（P＜0.05）；降脂通络软胶囊50、100 mg/kg组与贝那普利组Bcl-2、Bad mRNA表达比较差异不显著（P＞0.05），效果优于降脂通络软胶囊25 mg/kg组（P＜0.05）。
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表 2 各组大鼠肾组织Bcl-2和Bad mRNA表达比较(x±s, n=10) Table 2 Comparison on Bcl-2 and Bad mRNA in kidney tissue of rats in each group (x±s, n=10) |
4 讨论
足细胞凋亡作为引起足细胞损伤的重要原因逐渐引起人们的重视[4]。足细胞凋亡受机体内凋亡基因的调控，膜性肾病时机体凋亡调控基因激活可引起足细胞凋亡脱落，基底膜裸露，细胞外基质增多，肾小球硬化，严重可导致终末期肾病的发生。Bcl-2（抑凋亡基因）、Bad（促凋亡基因）作为细胞凋亡调控家族Bcl-2家族的主要成员，附着于线粒体外膜而存在，在细胞接受凋亡刺激后可通过调节位于线粒体外膜的渗透性转运孔（mPTP）形成，协调二者的相互作用调控细胞凋亡。在正常肾小球中，Bcl-2基因高表达于肾小球脏层上皮细胞及肾小管上皮细胞，Bad基因不表达，或仅在肾小管上皮细胞胞浆有少量表达，Bcl-2/Bad的协调平衡及相互作用在维持肾小球固有细胞数量及细胞结构方面起着重要作用；病理情况下，凋亡通路激活可上调促凋亡基因表达、下调抑凋亡基因表达，导致足细胞凋亡脱落、肾小球硬化、终末期肾病发生。
降脂通络软胶囊中的主要成分姜黄素具有调脂、抗凝、抑制细胞凋亡等作用[5-6]。周瑞等[7]研究发现，姜黄素能够上调血管阻断大鼠模型脑组织NR2A水平，下调NR2B水平，抑制大鼠后海马神经细胞凋亡，对缺血性神经细胞凋亡具有治疗作用。虞燕萍等[8]应用H9c2大鼠心肌细胞制作缺血/再灌注细胞模型，并予姜黄素进行干预，结果证实姜黄素能够通过增加丝氨酸磷酸化和减少酪氨酸磷酸化而降低细胞凋亡相关基因糖原合成酶激酶3（GSK-3）活性，延缓mPTP的开放，抑制心肌细胞凋亡的发生。张边江[9]应用降脂通络软胶囊干预阿霉素肾病大鼠，发现降脂通络软胶囊可明显减轻阿霉素造成的肾小球系膜细胞和系膜基质沉积，减轻肾小管间质损伤程度，延缓肾小球硬化进程。本研究结果发现，降脂通络软胶囊能够降低膜性肾病大鼠蛋白尿、改善血脂代谢、提高血浆蛋白水平，对于减轻基底膜增厚、足突融合也有一定效果，且降脂通络软胶囊50、100 mg/kg组效果优于降脂通络软胶囊25 mg/kg组。同时应用免疫组化及Real Time PCR技术检测肾组织Bcl-2、Bad基因水平，发现降脂通络软胶囊能够上调肾组织Bcl-2基因水平，下调肾组织Bad水平，且降脂通络软胶囊50、100 mg/kg组效果优于降脂通络软胶囊25 mg/kg组，这也提示只有在一定剂量范围内降脂通络软胶囊才能达到较好的抑制细胞凋亡作用。
综上所述，降脂通络软胶囊对于膜性肾病大鼠肾功能有保护作用，可能通过上调肾组织Bcl-2基因表达，下调肾组织Bad基因表达，抑制足细胞凋亡、修复受损足细胞有关，为降脂通络软胶囊在临床上进一步应用提供了理论依据，但其具体作用机制还不十分明确，值得进一步探讨。
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