2016, Vol. 47
表 1(Table 1)
UPLC-Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用快速分析粗茎秦艽化学成分
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.18.006 |
王长生, 董红娇, 包雅婷, 陈晓虎, 海洋, 曾锐 . UPLC-Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用快速分析粗茎秦艽化学成分[J]. 中草药, 2016, 47(18): 3175-3180.
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UPLC-Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用快速分析粗茎秦艽化学成分
1. 西南民族大学药学院, 四川 成都 610041
;
2. 重庆市食品药品检验所, 重庆 401121
2. 重庆市食品药品检验所, 重庆 401121
摘要:
目的
利用UPLC-Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪联用技术，对粗茎秦艽块根中的化学成分快速识别和鉴定。
方法
以100%甲醇作为提取液制备供试液，采用ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）分离，以乙腈-0.1%甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，质谱采用正负离子监测模式、全扫描及自动触发二级质谱扫描的功能，快速识别和鉴定粗茎秦艽中的化学成分。
结果
通过高分辨数据共鉴定34个化学成分，包括环烯醚萜类13个、黄酮类5个、酯类5个、三萜类3个、有机酸类2个、苯丙素类1个、其他类5个，其中12个成分经与对照品比对而准确鉴定，15个化学成分为首次从该植物中分得。
结论
UPLC-Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用技术可以快速鉴定粗茎秦艽中的化学成分，为粗茎秦艽化学成分的提取分离及其药效物质基础提供科学依据。
关键词:
粗茎秦艽
UPLC-Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱
环烯醚萜类
黄酮类
三萜类
Rapid analysis on chemical constituents from roots of Gentiana crasicaulis by ultra-high performance liquid chromatography coupled with hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometry
1. School of Pharmacy, Southwest University for Nationaities, Chengdu 610041, China
;
2. Chongqing Institute for Food and Drug Control, Chongqing 401121, China
2. Chongqing Institute for Food and Drug Control, Chongqing 401121, China
Abstract:
Objective
An ultra-high performance liquid chromatography coupled with hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometry(UPLC-hybrid quadrupole-orbitrap MS) method was developed to rapidly analyze and identify the chemical constituents from the roots of Gentiana crasicaulis.
Methods
The 100% methanol extract was separated on an ACQUITY UPLC BEH C18 column(100 mm×, 2.1 mm, 1.7 μm), and eluted with a gradient of methanol-water containing 0.1% formic acid.Constituents in the roots of G.crasicaulis were identified by HRMS in the positive and negative ion modes using both full scan and two-stage threshold-triggered mass modes.
Results
A total of 34 compounds, including 13 iridoids, 5 flavonoids, 5 esters, 3 triterpenoids, 2 organic acids, 1 phenylpropanoid, and 5 others compounds were identified.Among them, 12 compounds were unambiguously identified by comparing with reference standards.Fifteen compositions wre reported for the first time in the roots of G.crasicaulis.
Conclusion
Chemical constituents in the roots of G.crasicaulis were identified fast with UPLC-Q-Exactive hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometer technology to provide the scientific basis for the study on the material basis of the separation and crassicaulis chemical constitents.
Key words:
roots of Gentiana crasicaulis
UPLC-hybrid quadrupole-orbitrap mass spectrometry
iridoids
flavonoids
triterpenoids
粗茎秦艽为龙胆科（Gentianaceae）植物Gentiana crasicaulis Duthie ex Burk.的干燥根，秦艽是中国重要的传统中药之一，始载于《神农本草经》，列为中品，“秦艽主寒热邪气，寒湿风痹，肢节痛、下水、利小便”。其具有祛风湿、清湿热、止痹痛和退虚热功效[1]，主要用于治疗风湿痹痛、中风半身不遂、筋脉拘挛、骨节酸痛、湿热黄疸、骨蒸潮热、小儿疳积发热。现代药理研究表明其具有保肝、抗炎、抗菌和镇痛效果[2]，在心血管系统、内分泌系统具有明显的药理作用[2-3]。秦艽中主要含环烯醚萜苷类、黄酮类和三萜类等化合物[4-5]。曾锐等[6]用HPLC法同时测定秦艽中5个活性成分，建立了对17批次秦艽样品聚类分析快速鉴别的方法；吴靳荣等[5]用HPLC法对秦艽和习用品中5种环烯醚萜类成分进行定量测定的方法研究；李雨蔚等[7]分别对藏药秦艽花的化学成分进行系统研究；李荣娇等[8]采用HPLC法对西藏秦艽花与川西秦艽花中7种主要化学成分的量进行测定。但使用高通量分辨质谱联用技术对秦艽中粗茎秦艽的多组分化合物的快速识别研究较少。本实验采用UPLC-Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱技术快速识别和鉴定了粗茎秦艽中34个化合物，包括环烯醚萜类13个、黄酮类5个、酯类5个、三萜类3个、有机酸类2个、苯丙素类1个、其他类5个，其中15个化合物为首次从该植物中分得，为粗茎秦艽的进一步研究提供物质基础。
UPLC-Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱具有高选择性四极杆的离子过滤与Orbitrap高分辨准确质量数（HR/AM）测量技术，采用全扫描和正负离子切换模式进行测定，通过提取一级质谱的精确质量数进行定性和定量，自动触发二级全扫描质谱进一步提高定性的准确性，进行高通量的目标物或非目标物筛选[9]。为进一步研究粗茎秦艽的化学成分及活性筛选奠定基础。
1 仪器与材料UPLC-Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪（赛默飞世尔科技公司，美国）；Ultimate 3000超高效液相色谱系统（戴安公司，美国）；ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，沃特世科技有限公司，美国）；HX-200型高速中药粉碎机（浙江省永康市溪岸五金药具厂）；三号筛（355±13 μm，50目）；ESJ200-4万分之一电子天平（沈阳龙腾电子有限公司）；BT25S十万分之一电子天平（北京赛多利斯科学仪器有限公司）；KQ5200E型超声波清洗器（昆山超声仪器有限公司）。
色谱纯甲醇（默克公司，美国）、色谱纯甲酸（西格玛奥德里奇，美国）均为LC-MS级，水为纯净水（Milli-Q SP Regent Water system，美国），分析纯甲醇（质量分数≥99.5%）。龙胆苦苷（批号110902）、槲皮素（批号110627）、阿魏酸（批号111020）购于四川省维克奇生物科技有限公司；马钱苷酸（批号121220）、獐牙菜苷（批号130401）、獐牙菜苦苷（批号130402）、山栀苷甲酯（批号120906）、异牡荆黄素（批号151117）、异荭草苷（批号111974 -201401）、山柰酚（批号120718）购于成都普菲德生物技术有限公司；蔗糖（批号110833-200904）、柠檬酸（批号111679-200401）购于中国食品药品检定研究院，12种对照品质量分数均≥98%。
粗茎秦艽于2015年9月采自四川省阿坝州黑水县。经中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所黄林芳教授鉴定为粗茎秦艽Gentiana crasicaulis Duthie ex Burk.的根。
2 方法 2.1 供试品的制备称取粉碎的粗茎秦艽粉末（过3号筛）0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇20 mL，称定质量，超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放冷，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，进样前用0.22 μm微孔滤膜滤过，即得。
2.2 对照品溶液的制备精密称取龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷、山栀苷甲酯、异牡荆黄素、异荭草苷、槲皮素、阿魏酸、山柰酚、柠檬酸和蔗糖对照品适量，加甲醇超声溶解、定容至5 mL，分别制成浓度为8.6、7.0、8.6、9.0、6.8、6.1、6.2、6.9、6.9、6.9、7.1和10.1 μg/mL的对照品溶液。置于4 ℃冰箱中避光保存备用，进样前用0.22 μm微孔滤膜滤过。
2.3 色谱条件和质谱条件色谱条件：色谱柱为ACQUITYUPLCBEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水（B），洗脱梯度：（0～2 min，5% A；2～20 min，5%～12% A；20～35 min，12%～40% A；35～38 min，40% A；38～48 min，40%～80% A；48～50 min，80% A；50～51 min，80%～5% A；51～55 min，5% A）；体积流量0.3 mL/min，进样室温度10 ℃，柱温35 ℃；进样量2 μL。
质谱条件：离子源为HESI源，正负离子检测模式，鞘气压力206.84 kPa；辅助气体积流量8 L/min；喷雾电压2.00 kV；离子传输管温度320 ℃；辅助气温度350 ℃；扫描模式：Full MS/dd-MS2，Full MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500，扫描范围m/z 100～1 200。MS/MS模式时，碰撞能为40 eV。
3 化合物质谱分析使用Xcalibur 3.0软件（赛默飞科技有限公司，美国）对粗茎秦艽块根的甲醇溶液进行质谱数据分析，通过高分辨率质谱信息推导其可能的分子式，质谱偏差范围δ≤3×10−6。
通过龙胆属植物Xcms数据库、化学专业数据库和相关文献检索和中药的潜在目标数据库（http://tcm.zju.edu.cn）对目标化合物进行鉴定和确证。结合化合物的一级、二级质谱及裂解规律进行分析和鉴别。粗茎秦艽(−) ESI-MS和(+) ESI-MS的质谱基峰离子流图见图 1，已鉴定的各化学成分的保留时间、质谱信息以及相关文献数据见表 1。
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图 1 粗茎秦艽UPLC-Q-Exactive MS的负离子(A)和正离子(B)质谱基峰离子流图 Fig.1 Negative (A) and positive (B) UPLC-Q-Exactive MS base peak ion flow chart roots of G. crasicaulis |
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表 1 UPLC-Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱对粗茎秦艽中化学成分的鉴定分析 Table 1 Characterization of chemical constituents in roots of G. crasicaulis by UPLC-hybrid quadrupole-orbitrap MS |
3.1 环烯醚萜苷类化合物的鉴定
吴靳荣等[5]利用HPLC法同时测定秦艽及习用品中龙胆苦苷、马钱苷酸、獐牙菜苷、獐牙菜苦苷和6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷5个环烯醚萜苷类成分的量。峰6母核离子m/z 375.130 77 [M－H]−，其二级特征碎片有m/z 213.076 34 [M－H－C6H11O5]−、179.054 93 [M－H－Glc]−和169.086 00 [M－H－C6H11O5－CHO2]−，对照品tR为9.80 min，与马钱苷酸对照品质谱比对，鉴定峰6为马钱苷酸。峰13母核离子m/z 373.114 04 [M－H]−，其二级特征碎片有m/z 163.074 34 [M－H－C10H11O4]−、141.018 16 [M－H－Glc－C2H3－CO]−，对照品tR为12.97 min，与獐牙菜苦苷对照品质谱比对，鉴定峰13为獐芽菜苦苷。峰18母核离子m/z 355.103 73 [M－H]−，其二级特征碎片有m/z 177.054 79和149.059 65，对照品tR为15.19 min，与龙胆苦苷对照品质谱比对，鉴定峰18为龙胆苦苷。峰21母核离子m/z 375.130 77 [M－H＋46]−，其二级特征碎片有m/z 179.070 04 [M－H＋46－C6H11O6]−，对照品tR为16.54 min，与獐牙菜苷对照品质谱比对，鉴定峰21为獐芽菜苷。峰15化合物C22H30O14的tR为13.52 min，母核离子m/z 517.156 31 [M－H]−，另外有m/z 193.049 93、161.044 49、134.036 03碎片，分别对应[M－H－Glc－OGlc]−、[M－H－Glc－O－OGlc]−、[M－H－Glc－OGlc－O－C2H3]−碎片，通过裂解规律推测峰15为6′-O-β-D-葡萄糖基龙胆苦苷。
母核离子m/z 519 [M－H]−，化合物中有2个tR，14.54 min和27.30 min。利用Xcalibur 3.0软件中Formula finder功能，峰16分子式C22H32O14，峰24分子式C26H32O11，相对分子质量偏差均小于3×10−6。峰24二级有m/z 357.134 12 [M－H－Glc]−、342.111 42 [M－H－OGlc]−特征碎片，通过化合物精确相对分子质量、二级质谱碎片信息及裂解规律推测峰16为紫药苦苷，峰24为6′-O-β-D-葡萄糖基獐牙菜苷。
3.2 黄酮类化合物的鉴定李雨蔚等[7]利用IR、ESI-MS、1H-NMR、13C-NMR分析鉴定西藏秦艽花中皂草黄苷、异牡荆黄素、异荭草苷黄酮类成分。峰22母核离子m/z 593.150 82 [M－H]−，其二级有m/z 473.109 50、311.056 55，分别为[M－H－CO－C6H5O]−和[M－H－CO－C6H5O－Glc]−特征碎片离子，根据文献报道[7]，鉴定峰22为皂草黄苷；峰23母核离子m/z 431.099 67 [M－H]−，其二级有m/z 341.067 05、283.061 49、311.056 70，分别为[M－H－C3H6O3]−、[M－H－C3H6O3－C2H4O2]−、[M－H－C6H5O－CO2]−特征碎片离子，对照品tR为25.90 min，与异牡荆黄素对照品质谱比对，鉴定为异牡荆黄素；峰25母核离子m/z 477.104 58 [M－H]−其二级有m/z 285.070 74、151.002 30、133.028 31，分别为[M－H－Glc]−、[M－H－Glc－C8H6O2]−、[M－H－Glc－C7H3O4]−特征碎片离子，对照品tR为27.78 min，与异荭草苷对照品质谱比对，鉴定为异荭草苷。
3.3 三萜类化合物的鉴定熊果酸和齐墩果酸均为三萜类化合物，母核为m/z 456，样品中化合物C30H48O3的tR为50.81、51.21 min，在负离子模式下响应较好，齐墩果酸对照品tR为51.21 min，根据对照品tR、同位素分布和二级碎片信息，鉴定峰35为熊果酸，峰36为齐墩果酸。
3.4 有机酸类化合物的鉴定阿魏酸为有机酸类化合物，母核相对分子质量m/z 195 [M＋H]+，相关文献报道该属植物中含有该化合物[12]。峰17在正离子模式下响应较好，阿魏酸对照品tR为15.18 min，二级碎片有m/z 177.054 47、149.069 65，分别对应[M＋H－OH]+、[M＋H－OH－CO]+。根据正离子模式二级质谱碎片信息和对照品质谱，及与文献报道[16]比较，鉴定17号峰为阿魏酸。
3.5 其他类化合物的鉴定据相关文献报道[7]，秦艽中含有蔗糖。峰1在负离子下响应较好，对照品tR为0.89 min，与蔗糖对照品质谱比对，鉴定为蔗糖。在正离子模式下，峰34母核相对分子质量m/z 413 [M＋H]+只有1个tR值，其二级碎片有m/z 255.211 35、213.164 14，分别为[M＋H－C6H13－CH4－C3H6]+、[M＋H－C6H13－CH4－C3H6－CH3－C2H3]+特征离子碎片。根据正离子模式下精确相对分子质量和二级质谱碎片信息及与文献报道[17]比较，鉴定34号峰为豆甾醇。
4 讨论 4.1 液质联用条件的优化本研究针对流动相考察了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水，流动相中加入少量酸，能有效改善峰形及离子化效果。甲醇和乙腈的比较研究发现，用乙腈-0.1%甲酸水样品各个峰之间分离度较好，因此选用乙腈-0.1%甲酸水为流动相。
4.2 Q-Exactive质谱联用技术优势UPLC-Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱采用全扫描直接进样分析，正负离子切换模式扫描，自动触发二级质谱，通过软件Xcalibur 3.0得到的特征碎片与实际测定碎片质量偏差均小于3×10−6，完全保证筛查结果的准确性。对于未知化合物的鉴定，正负离子切换扫描模式，在一次进样的同时采集不同离子化极性下的数据，以兼顾各种不同化合物，进一步提高定性的准确性。相比传统的三重四级杆质谱，Q-Exactive具有更高分辨率、高质量精度、高灵敏度等特点。这些性能特点可以实现高灵敏度准确定性，适用于大规模化合物的筛查、识别和鉴定。
本实验建立粗茎秦艽UPLC-Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用技术，基于化合物相关数据库、参考文献和精确相对分子质量，鉴定了粗茎秦艽中34个化合物，其中有15个成分首次从该品种中分得，该方法使用少量对照品即可快速分析鉴定出多个化学成分，表明了UPLC-Q-Exactive四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱在快速鉴别药物植物多种次生代谢产物领域具有的强大能力。
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