积雪草皂苷酸水解产物中1个新苷元的分离和鉴定

引用本文	doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.18.002

曹家庆, 周康, 时圣明, 赵余庆 . 积雪草皂苷酸水解产物中1个新苷元的分离和鉴定[J]. 中草药, 2016, 47(18): 3155-3158. 复制到剪切板

CAO Jia-qing, ZHOU Kang, SHI Sheng-ming, ZHAO Yu-qing . Isolation and idetification of a new aglycone from acid hydrolysis products of saponin in Centella asiatica[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs, 2016, 47(18): 3155-3158 . 复制到剪切板

积雪草皂苷酸水解产物中1个新苷元的分离和鉴定

曹家庆^1,3, 周康¹, 时圣明², 赵余庆^1,3

1. 沈阳药科大学功能食品与葡萄酒学院, 辽宁沈阳 110016 ;
2. 天津药物研究院, 天津 300193 ;
3. 沈阳药科大学基于靶点的药物设计与研究教育部重点实验室, 辽宁沈阳 110016

收稿日期: 2016-04-08

基金项目: 国家自然科学基金面上项目（81273389）

作者简介: 曹家庆(1975-), 男, 副教授, 沈阳药科大学, 主要从事天然产物研究。Tel:(024)23986522, E-mail:jiaqingcao@163.com

通信作者: 赵余庆(1957-), 男, 教授, 沈阳药科大学, 主要从事抗肿瘤活性天然产物及食品药学研究。Tel:(024)23986521, E-mail:zyq4885@126.com

摘要: 目的研究积雪草Centella asiatica皂苷水解产物的化学成分，以期发现新的三萜皂苷元。方法通过硅胶、凝胶柱色谱对积雪草皂苷酸水解产物进行分离，经核磁共振、质谱、红外光谱、紫外光谱等波谱手段对化合物的结构进行鉴定。并对部分化合物的体外抗肿瘤活性进行了测试。结果从积雪草皂苷酸水解产物中分离得到4个单体苷元化合物，鉴定为2α, 3β, 23-三羟基乌苏-6, 12-二烯-28-酸（1）、积雪草酸（2）、6β-羟基积雪草酸（3）、terminolic acid（4）。结论化合物1为1个新的乌苏烷型苷元，命名为积雪草-6-烯，并且其对所测试的肿瘤细胞HL-60、A549、U873无抑制活性。

关键词: 积雪草酸水解乌苏烷苷元积雪草酸 6β-羟基积雪草酸积雪草-6-烯 2α, 3β, 23-三羟基乌苏-6, 12-二烯-28-酸

Isolation and idetification of a new aglycone from acid hydrolysis products of saponin in Centella asiatica

CAO Jia-qing^1,3, ZHOU Kang¹, SHI Sheng-ming², ZHAO Yu-qing^1,3

1. School of Functional Food and Wine, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, China ;
2. Tianjin Institute of Pharmaceutical Research, Tianjin 300193, China ;
3. Key Laboratory of Structure-Based Drug Design and Discovery, Shenyang Pharmaceutical University, Ministry of Education, Shenyang 110016, China

Abstract: Objective To study the chemical constituents of the acid hydrolysis products, in order to find some new aglycones from the hydrolysate of the saponin of Centella asiatica. Methods The acid hydrolytic product was separated by repeated silica gel, Sephadex LH-20 chromatography.The cytotoxic activities in vitro of some compounds isolated were evaluated.Their structures isolated were identified by analysis of their spectral data of NMR, MS, IR, and UV. Results Four aglycones, 2α, 3β, 23-trihydroxyurs-6, 12-dien-28-oic acid(1), asiatic acid(2), 6β-hydroxy asiatic acid(3), terminolic acid(4), were isolated from the hydrolysis product. Conclusions Compound 1, named centella-6-ene, was a new ursane-type aglycone and it showed no cytotoxic activities against the tested cancer cell lines.

Key words: Centella asiatica(L.) Urban acid hydrolysis ursane-type aglycone asiatic acid 6β-hydroxy asiatic acid centella-6-ene 2α, 3β, 23-trihydroxyurs-6, 12-dien-28-oic acid

积雪草Centella asiatica (L.) Urban为伞形科（Umbelliferae）积雪草属Centella L.植物，其性寒，味苦、辛，具有清热利湿、解毒消肿之功效^[1-2]。研究表明，积雪草中的主要活性成分是乌苏烷型和齐墩果烷型三萜化合物^[3-4]，对多种肿瘤细胞株具有不同程度的抑制活性^[3-7]。植物提取物的酸水解反应可以获得更多活性天然产物衍生物（尤其是新皂苷元）。本实验对积雪草皂苷进行酸水解反应，对水解产物的化学成分进行了分离和结构鉴定。采用硅胶柱色谱、凝胶柱色谱等方法进行分离、纯化，分离并鉴定了4个苷元化合物，分别为2α, 3β, 23-三羟基乌苏-6, 12-二烯-28-酸（2α, 3β, 23-trihydroxyurs-6, 12-dien-28-oic acid，1）、积雪草酸（asiatic acid，2）、6β-羟基积雪草酸（6β-hydroxy asiatic acid，3）、terminolic acid（4）。其中，化合物1鉴定为新的乌苏烷苷元化合物，命名为积雪草-6-烯。此外，本实验还对新化合物的体外抗肿瘤活性进行了测试，结果显示化合物1对所测试的肿瘤细胞无抑制活性。

1 仪器与材料

Shimadzu UV-2201（日本岛津仪器有限公司）；Bruker ARX-600型超导核磁共振仪（德国布鲁克公司）；TOF-Q质谱仪（美国布鲁克海文仪器公司）；X-4数字显示显微熔点测定仪（温度计未校正，北京华乐达科技有限公司）；MIR-253超低温冰箱（日本SANYO公司）；YXQG01高压蒸汽灭菌锅（山东新华医疗器械厂）；450型酶标定量测试仪（美国Bio-Rad公司）；BS-124S精密电子天平（德国赛多利斯公司）。柱色谱用硅胶（300～400目）和薄层色谱用硅胶（10～40 μm）均为青岛海洋化工有限公司生产；Sephadex LH-20为Pharmacia公司出品；胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）；MTT（美国Sigma公司）。所用试剂均为分析纯。

积雪草总皂苷（批号20120913），购于陕西惠科植物开发有限公司，含总皂苷大于50%，含积雪草苷大于10%。

2 化合物的分离

应用文献报道的方法^[8]，对积雪草总皂苷200 g进行水解反应。用醋酸乙酯萃取，得萃取物83 g。硅胶柱色谱（300～400目）分离；石油醚-丙酮（40:1、20:1、10:1、6:1、4:1、2:1、1:1、0:1）梯度洗脱，合并流分后得到A～J部分[A（1.2 g），B（2.3 g），C（4.6 g），D（5.5 g，fractions 21～35），E（3.0 g），F（7.5 g），G（6.7 g），H（8.5 g），I（9.2 g），J（8.2 g）]，再经硅胶柱色谱分离、反复重结晶，得到4个化合物。其中从H部分得到化合物1（14 mg）和2（80 mg）；G部分得到化合物3（130 mg）和4（230 mg）。

3 体外抗肿瘤活性测试

应用MTT法，对分离得到的化合物1进行了人白血病细胞株HL-60、人肺癌细胞株A549、人脑胶质瘤细胞株U87增殖抑制活性的研究^[9]。实验以依托泊苷为阳性对照，采用SPSS（16.0）统计软件进行检验分析，用IC₅₀值来评估样品抗肿瘤活性^[10]。

4 结构鉴定

化合物1：无色鳞片状结晶（甲醇），[α]_D²⁵+24.4。(c 0.34, 甲醇)。HR-ESI-TOF-MS显示准分子离子峰m/z 509.323 4 [M+Na]⁺（理论值509.323 7）。结合NMR数据推测分子式为C₃₀H₄₆O₅。UV : 204 (2.14)；IR : 3 421, 2 925, 1 695, 1 454, 1 380, 1 249, 1 053。

¹H-NMR (600 MHz, C₅D₅N)谱中，可以看到6个甲基质子信号，其中δ 0.90 (3H, d, J=6.6 Hz)和0.97 (3H, d, J=6.8 Hz)为乌苏烷典型的29，30位甲基氢信号，此外还有4个甲基单峰δ 1.06 (3H, s), 1.11 (3H, s), 1.16 (3H, s), 1.26 (3H, s)。氢谱中还显示4组连氧碳上的氢信号δ 3.80 (1H, d, J=10.2 Hz)；4.18 (1H, d, J=10.2 Hz)；4.24 (1H, brd, J=12.6 Hz)；4.34 (1H, m)；3个连在双键上的氢信号δ 5.63 (1H, brs)；5.61(1H, dd, J=10.5, 2.4 Hz)；6.00 (1H, d, J=10.5 Hz)，其中后2个氢呈相互偶合关系。该化合物¹³C-NMR (150 MHz, C₅D₅N)谱显示了30个碳原子信号。羰基碳信号δ 179.5以及2个烯碳信号δ 126.4，139.7，提示该化合物可能为乌苏酸型苷元衍生物。3个连氧碳信号δ 65.8，68.6，77.92为积雪草中常见的2α, 3β, 23-三羟基乌苏酸的特征碳信号。通过与化合物3（6β-羟基积雪草酸）的核磁共振碳谱数据对比^[11]，发现除了C-5, 6, 7, 8的化学位移值有很大变化外，其余的碳谱数据十分接近。在核磁共振碳谱中，除了12和13位双键碳外，尚余1组化学位移为δ 133.8，126.7的sp²杂化碳信号，结合HSQC和氢谱，可知它们为“-CH=CH-”片段，因此，这个双键可能位于B环的C-6与C-7间。HMBC谱（图 1，表 1）

图 1 化合物1的主要的HMBC及NOESY相关 Fig.1 Key HMBC and NOESY correlations of compound 1

表 1 化合物1的¹H-NMR和¹³C-NMR数据 Table 1 ¹H-NMR and ¹³C-NMR spectral data of compound 1

碳位	δ_C	δ_H	DEPT	HMBC (H→C)
1	45.0	2.20 (m), 1.40(m)	CH₂	C-2, 3
2	68.6	4.34 (m)	CH	C-1, 3
3	77.9	4.24 (brd, J=12.6 Hz)	CH	C-2, 4, 5, 23
4	42.4		C
5	47.0	2.70 (m)	CH	C-6, 7, 10
6	133.8	5.61 (dd, J=10.5, 2.4 Hz)	CH	C-5, 7, 10
7	126.7	6.00 (d, J=10.5 Hz)	CH	C-6, 8, 9, 26
8	44.0		C
9	47.5	2.18 (m)	CH	C-7, 26
10	36.9		C
11	22.8	1.90 (m), 1.98 (m)	CH₂	C-8, 12, 13
12	126.4	5.63 (brs)	CH	C-13, 18
13	139.7		C
14	43.5		C
15	30.2	1.98 (m), 2.01 (m)	CH₂	C-14, 27
16	24.4	2.00 (m), 2.18 (m)	CH₂	C-17
17	48.3		C
18	54.4	2.63 (d, J=11.6 Hz)	CH	C-12, 17, 28
19	38.3	0.98 (m)	CH	C-30
20	39.0	1.41 (m)	CH	C-19, 29
21	30.6	1.40 (m), 1.45 (m)	CH₂	C-19
22	36.7	1.92 (m), 1.95 (m)	CH₂	C-20
23	65.8	3.80 (d, J=10.2 Hz), 4.18 (d, J=10.2 Hz)	CH₂	C-3, 4, 24
24	14.2	1.10 (s)	CH₃	C-3, 4, 23
25	18.0	1.06 (s)	CH₃	C-5, 10
26	17.7	1.16 (s)	CH₃	C-7
27	24.0	1.26 (s)	CH₃	C-13, 14
28	179.5		C
29	20.9	0.90 (d, J=6.6 Hz)	CH₃	C-19
30	17.3	0.97 (d, J=6.8 Hz)	CH₃	C-19, 20

表 1 化合物1的¹H-NMR和¹³C-NMR数据 Table 1 ¹H-NMR and ¹³C-NMR spectral data of compound 1

显示下列远程相关，证实了C-6、C-7之间双键的存在：H-5 (δ 2.70)与C-6 (δ 133.8)、C-7 (δ 126.7)、C-10 (δ 36.9)；H-6(δ 5.61)与C-5 (δ 47.0)、C-7 (δ 126.7)、C-10(δ 36.9)；H-7 (δ 6.00)与C-6 (δ 133.8)、C-8(δ 44.0)、C-9 (δ 47.5)、C-26 (δ 17.7)；H-9(δ 2.18)与C-7 (δ 126.7)。NOESY（图 1）显示H-5与H-3、H-9均相关，说明H-5和H-9均在α位；H₃-25与H-2、H₃-26均相关，说明H-2在β位。根据以上数据综合解析，化合物1的结构鉴定为2α, 3β, 23-三羟基乌苏-6, 12-二烯-28-酸，为新化合物，命名为积雪草-6-烯。其NMR数据归属见表 1。

另外，通过化合物2～4的¹³C-NMR数据（表 2）与文献报道对照^[12-14]，鉴定化合物2为积雪草酸，化合物3为6β-羟基积雪草酸，化合物4为terminolic acid。

表 2 化合物2～4的¹³C-NMR (150 MHz, C₅D₅N)数据 Table 2 ¹³C-NMR (150 MHz, C₅D₅N) spectral data of compounds 2—4

碳位	δ_C
碳位	2	3	4
1	48.0	48.3	46.3
2	68.8	68.7	68.7
3	77.9	78.0	78.0
4	42.4	44.2	44.2
5	48.1	48.3	48.3
6	18.0	67.2	67.2
7	33.1	39.1	39.2
8	40.4	39.2	40.9
9	48.0	48.3	48.9
10	38.0	37.9	37.9
11	24.2	24.6	24.6
12	126.0	125.7	122.9
13	138.3	138.3	143.9
14	43.6	44.2	42.4
15	28.3	28.3	27.9
16	25.8	25.9	23.4
17	48.2	48.3	42.7
18	53.4	53.3	41.7
19	38.0	37.9	46.3
20	39.1	39.2	30.6
21	30.5	30.8	33.9
22	36.9	37.8	32.9
23	65.8	65.8	65.8
24	15.0	15.7	15.7
25	17.3	17.2	17.2
26	18.0	18.3	18.3
27	23.8	23.6	23.6
28	179.0	179.6	179.6
29	23.4	23.8	32.9
30	21.1	21.0	23.7

表 2 化合物2～4的¹³C-NMR (150 MHz, C₅D₅N)数据 Table 2 ¹³C-NMR (150 MHz, C₅D₅N) spectral data of compounds 2—4

5 生物活性研究

采用MTT法，对化合物1进行了HL-60、A549、U873细胞株的增殖抑制活性测试，以依托泊苷为阳性对照。结果表明化合物1对3种肿瘤细胞株的IC₅₀均大于100 μmol/L，显示无细胞毒活性。

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中草药 2016, Vol. 47 Issue (18): 3155-3158	0	PDF