拨云退翳丸由菊花、蛇蜕、荆芥穗、薄荷、川芎、地骨皮、楮实子、甘草、蒺藜（盐炙）、木贼、蝉蜕、蔓荆子、当归、黄连、花椒、天花粉17味药材组成，主要用于散风清热、退翳明目，主治风热上扰所致的目翳外障、视物不清、隐痛流泪^[1-2]。关于其质量控制研究的报道，主要是测定其中的甘草酸^[3]、盐酸小檗碱^[4-5]，《中国药典》2015年版规定以蒙花苷为控制指标。《中国药典》2015年版中当归的指标成分为阿魏酸，甘草的主要指标成分为甘草苷和甘草酸铵，木贼的主要指标成分为山柰素，黄连的主要指标成分为盐酸小檗碱，荆芥穗的主要指标成分为胡薄荷酮，菊花的主要指标成分为绿原酸和3, 5-O-二咖啡酰基奎宁酸，蔓荆子的主要指标成分为蔓荆子黄素，密蒙花的主要指标成分为蒙花苷。为更有效地控制拨云退翳丸的质量，本实验采用HPLC-DAD法在同一色谱条件下测定该制剂中甘草苷、甘草酸铵、蔓荆子黄素、胡薄荷酮、阿魏酸、绿原酸、3, 5-O-二咖啡酰基奎宁酸、盐酸小檗碱、山柰素、蒙花苷10种成分。结果表明，该方法良好，可为全面控制拨云退翳丸内在质量提供参考。

Waters e2695高效液相色谱仪，DAD紫外检测器，Waters公司；梅特勒ME204E型电子分析天平，十万分之一，瑞士梅特勒公司；甘草苷（批号111610-201106，质量分数93.7%）、甘草酸铵（批号110731-201418，质量分数93.1%）、蔓荆子黄素（批号111554-201304，质量分数99.7%）、胡薄荷酮（批号111706-201205，质量分数99.8%）、阿魏酸（批号110773-201313，质量分数99.6%）、绿原酸（批号110753-201415，质量分数96.2%）、盐酸小檗碱（批号110713-201212，质量分数96.2%）、山柰素（批号110861-201310，质量分数93.2%）、蒙花苷（批号111528-201509，质量分数97.5%），均购自中国食品药品检定研究院；3, 5-O-二咖啡酰基奎宁酸（批号MUST-15112111，质量分数99.74%），成都曼斯特生物科技有限公司；拨云退翳丸（规格：9 g/丸），吉林紫鑫药业股份有限公司，批号150712、150715、150820；陕西华西制药股份有限公司，批号151014、151016、151018；甲醇与乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他试剂均为分析纯。

取甘草苷、甘草酸铵、蔓荆子黄素、胡薄荷酮、阿魏酸、绿原酸、3, 5-O-二咖啡酰基奎宁酸、盐酸小檗碱、山柰素、蒙花苷对照品适量，精密称定，用50%甲醇配制成含甘草苷20 μg/mL、甘草酸铵200 μg/mL、蔓荆子黄素30 μg/mL、胡薄荷酮20 μg/mL、阿魏酸12 μg/mL、绿原酸35 μg/mL、3, 5-O-二咖啡酰基奎宁酸80 μg/mL、盐酸小檗碱90 μg/mL、山柰素20 μg/mL、蒙花苷30 μg/mL的混合对照品溶液，即得。

取质量差异项下的本品5丸，剪碎，混匀，取约1 g，精密称定，加硅藻土1 g，研匀，置索氏提取器中，用甲醇适量分次洗涤乳钵，洗液并入索氏提取器中，加入适量甲醇，加热回流3.0 h，提取液移至蒸发皿中，浓缩至约15 mL，放冷，转移至25 mL量瓶中，用适量的50%甲醇洗涤容器数次，洗液并入量瓶中，加50%甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

按拨云退翳丸处方比例和工艺，分别制备缺少密蒙花药材的阴性对照样品、缺少木贼和蔓荆子药材的阴性对照样品、缺少当归、菊花、荆芥穗、黄连药材的阴性对照样品、缺少甘草药材的阴性对照样品，并按“2.2”项下方法制备各阴性对照溶液。

色谱柱为Shim-pack VP-ODS C₁₈（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱；流动相为甲醇-乙腈（50:50，A）和0.05%磷酸水溶液（B），梯度洗脱程序为0～5 min，50% A；5～30 min，50%～80% A；30～32 min，80%～50% A；32～40 min，50% A；体积流量1.0 mL/min；柱温40 ℃；进样体积10 μL；检测波长（分段变波长测定）：0～5 min为250 nm，5～9 min为316 nm，9～20 min为350 nm，20～30 min为326 nm，30～40 min为250 nm。

分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液，按照“2.4”项下方法进样检测，结果表明供试品色谱图中呈现与对照品主峰保留时间一致的色谱峰，阴性对照无干扰。甘草苷、甘草酸铵、蔓荆子黄素、胡薄荷酮、阿魏酸、绿原酸、3, 5-O-二咖啡酰基奎宁酸、盐酸小檗碱、山柰素、蒙花苷与其相邻色谱峰的分离度均大于2.0。结果见图 1。

1-甘草苷2-甘草酸铵3-蔓荆子黄素4-胡薄荷酮5-阿魏酸6-绿原酸7-3, 5-O-二咖啡酰基奎宁酸8-盐酸小檗碱9-山柰素10-蒙花苷 1-liquiritin 2-ammonium glycyrrhizinate 3-vitexicarpin 4-pulegone 5-ferulic acid 6-chlorogenic acid 7-3, 5-dicaffeoyl quinic acid 8-berberine hydrochloride 9-kaempferol 10-buddleoside 图 1 混合对照品(A)、供试品(B)、缺密蒙花阴性对照(C)、缺木贼和蔓荆子阴性对照(D)、缺当归、菊花、荆芥穗、黄连阴性对照(E)、缺甘草阴性对照(F)的HPLC-DAD图 Fig.1 HPLC-DAD of mixed reference substances (A), sample (B), negative control without Buddlejae Flos (C), negative control without Equiseti hiemalis Herba and Viticis Fructus (D), negative control without Angelica Sinensis Radix, Chrysanthemi Flos, Schizonepetae Spike, and Coptidis Rhizoma (E), and negative control without Glycyrrhizae Radix (F)

取“2.1”项下混合对照品溶液，精密量取1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，分别置于10 mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，得系列溶液。按“2.4”项色谱条件，分别精密吸取上述溶液各10 μL，测定峰面积，以质量浓度为横坐标（X），峰面积积分值为纵坐标（Y）进行线性回归，结果表明，甘草苷、甘草酸铵、蔓荆子黄素、胡薄荷酮、阿魏酸、绿原酸、3, 5-O-二咖啡酰基奎宁酸、盐酸小檗碱、山柰素、蒙花苷在相应质量浓度范围内呈良好线性关系，线性范围、回归方程、相关系数分别为甘草苷Y=11.42 X+452.8，r=0.999 2，线性范围2～20 μg/mL；甘草酸铵Y=−4.352 X+873.5，r=0.999 5，线性范围20～200 μg/mL；蔓荆子黄素Y=342.1 X+6 738.9，r=0.999 4，线性范围3～30 μg/mL；胡薄荷酮Y=0.472 X-3.847，r=0.999 7，线性范围2～20 μg/mL；阿魏酸Y=23.65 X-87.38，r=0.999 5，线性范围1.2～12.0 μg/mL；绿原酸Y=−3.728 X+56.93，r=0.999 2，线性范围3.5～35.0 μg/mL；3, 5-O-二咖啡酰基奎宁酸Y=53.21 X+688.3，r=0.999 3，线性范围8～80 μg/mL；盐酸小檗碱Y=843.5 X+55.44，r=0.999 3，线性范围9～90 μg/mL；山柰素Y=−0.538 X+6.473，r=0.999 6，线性范围2～20 μg/mL；蒙花苷Y=6.444 X+78.39，r=0.999 5，线性范围3～30 μg/mL。

精密吸取“2.1”项下的混合对照品溶液，连续进样6次，按上述色谱条件测定峰面积，计算，求得甘草苷、甘草酸铵、蔓荆子黄素、胡薄荷酮、阿魏酸、绿原酸、3, 5-O-二咖啡酰基奎宁酸、盐酸小檗碱、山柰素、蒙花苷峰面积的RSD分别为0.56%、1.11%、1.25%、1.31%、0.98%、0.94%、0.77%、0.59%、0.86%、0.61%。

取同一批号样品（批号为150712），按照“2.2”项下方法制备6份供试品溶液，按“2.4”项色谱条件分别进样，测定峰面积，计算质量分数。结果甘草苷、甘草酸铵、蔓荆子黄素、胡薄荷酮、阿魏酸、绿原酸、3, 5-O-二咖啡酰基奎宁酸、盐酸小檗碱、山柰素、蒙花苷平均质量分数的RSD分别为0.73%、0.51%、0.55%、1.18%、0.83%、1.06%、0.99%、0.74%、0.82%、0.49%。

取同一批号样品（批号为150712），按照“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于0、2、6、4、8、10、12、16、18、24 h，按照“2.4”项下色谱条件进行测定，计算其峰面积。结果甘草苷、甘草酸铵、蔓荆子黄素、胡薄荷酮、阿魏酸、绿原酸、3, 5-O-二咖啡酰基奎宁酸、盐酸小檗碱、山柰素、蒙花苷峰面积的RSD分别为0.98%、0.95%、1.03%、1.03%、0.97%、1.01%、0.89%、0.94%、0.97%、0.85%。表明供试品溶液在24 h内稳定。

取同一批号样品（批号为150712），每份约1.0 g，精密称定，分成3组，分别按已知质量分数的50%、100%、150% 3个水平加入混合对照品溶液，按照“2.2”项下方法平行制备供试品溶液，进样分析，计算回收率。结果甘草苷、甘草酸铵、蔓荆子黄素、胡薄荷酮、阿魏酸、绿原酸、3, 5-O-二咖啡酰基奎宁酸、盐酸小檗碱、山柰素、蒙花苷的平均回收率分别为99.1%、101.1%、100.2%、99.4%、101.9%、98.5%、100.5%、101.7%、100.8%、99.7%，RSD分别为0.62%、0.79%、0.77%、0.83%、0.47%、0.38%、0.97%、1.05%、0.86%、1.11%。

分别取不同批号的拨云退翳丸适量，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下色谱条件测定，记录色谱图，计算10种成分质量分数。结果见表 1。6批次供试品中甘草苷、甘草酸铵、蔓荆子黄素、胡薄荷酮、阿魏酸、绿原酸、3, 5-O-二咖啡酰基奎宁酸、盐酸小檗碱、山柰素、蒙花苷质量分数分别为0.505～0.685、1.793～2.012、0.227～0.268、0.183～0.206、1.258～1.324、0.348～0.381、0.648～0.720、1.544～1.722、1.543～1.627、3.434～3.883 mg/丸。结果表明本品各批次之间10种成分略有差异，相同厂家的批次差异较小，不同厂家的差异较大，这可能是由于不同厂家采购的药材不同导致的。

表 1(Table 1)

表 1 6批拨云退翳丸样品中10种成分定量测定结果 Table 1 Detemination of 10 constituents in six batches of BTP 批号 质量分数/(mg∙丸−1) 甘草苷 甘草酸铵 蔓荆子黄素 胡薄荷酮 阿魏酸 绿原酸 3, 5-O-二咖啡酰基奎宁酸 盐酸小檗碱 山柰素 蒙花苷 150712 0.505 2.012 0.236 0.183 1.258 0.370 0.713 1.563 1.611 3.734 150715 0.511 1.997 0.227 0.187 1.266 0.354 0.718 1.544 1.623 3.682 150820 0.509 1.994 0.238 0.178 1.199 0.348 0.720 1.559 1.627 3.883 151014 0.677 1.802 0.256 0.198 1.311 0.381 0.655 1.709 1.554 3.572 151016 0.685 1.793 0.261 0.191 1.324 0.374 0.648 1.722 1.543 3.551 151018 0.683 1.812 0.268 0.206 1.322 0.359 0.651 1.706 1.564 3.434

表 1 6批拨云退翳丸样品中10种成分定量测定结果 Table 1 Detemination of 10 constituents in six batches of BTP

以10种目标成分的提取率为考察指标，分别考察了影响索氏提取的因素，包括提取溶剂（甲醇、乙醇、50%甲醇、70%甲醇）、提取时间（1.0、1.5、2.0、3.0 h），最终确定甲醇为提取溶剂，提取时间为3.0 h。

对于多指标成分的控制，一般选择分段变波长检测^[6-9]。根据《中国药典》2015年版，甘草苷、甘草酸铵、蔓荆子黄素、胡薄荷酮、阿魏酸、绿原酸、3, 5-O-二咖啡酰基奎宁酸、盐酸小檗碱、山柰素、蒙花苷的检测波长分别为237、237、258、252、316、348、348、345、365、326 nm；根据实验结果确定了250、316、350、326 nm 4个检测波长，分段变波长对10种成分进行检测。结果表明各指标成分峰形良好，分离度高。

本实验首次建立变波长HPLC-DAD法同时测定拨云退翳丸中10种活性成分的方法，方法简便、结果可靠，可作为拨云退翳丸多指标定量测定方法。