2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.17.008 |
2. 苏州市中医院 江苏 苏州 215003 ;
3. 贵州昌昊中药发展有限公司, 贵州 凯里 556000
2. Suzhou Hospital of Chinese Medicine, Suzhou 215003, China ;
3. Guizhou Changhao Chinese Medicine Development Co., Ltd., Kaili 556000, China
何首乌Polygoni Multiflori Radix为蓼科（Polygonaceae）蓼属Polygonum L.植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的干燥块根。有生首乌和制首乌之分。生首乌性味苦、甘、涩，微温，具有消毒消肿、润肠通便、截疟的功效。制首乌味甘厚性温，具有补肝肾，益精血、乌须发、强筋骨的作用[1]。研究表明何首乌中主要含有二苯乙烯苷类、蒽醌类等成分[2-3]，其中二苯乙烯苷类成分具有调血脂、抗氧化等作用[4-5]，蒽醌类成分则有增强免疫、抗肿瘤等作用[6-7]。
《中国药典》2015年版对何首乌的药材加工和饮片加工进行了分别描述，即何首乌药材为“秋、冬二季叶枯萎时采挖，削去两端，洗净，个大的切成块，干燥”，饮片的炮制则规定为“除去杂质，洗净，稍浸，润透，切厚片或块，干燥”[1]。这样的工艺使得何首乌从药用植物到饮片需要经过2次水处理和干燥过程，增加了生产成本，并有可能造成有效成分的损失。与传统分段加工工艺比较，一体化加工工艺大大缩短了加工时间，同时避免了中间的储存环节。能够大大降低加工过程中所产生的电能、人工、贮藏和长途运输的成本，并且避免药材在贮藏和长途运输过程中易发生的霉变与腐烂。因此本实验探讨了“由新鲜何首乌直接加工炮制成饮片”的一体化加工工艺的可行性。
《中国药典》2015年版一部[1]中记载何首乌具有解毒、消痈、截疟、润肠通便的功效，用于疮痈、瘰疬、风疹瘙痒、久疟体虚、肠燥便秘。故本实验通过比较其润肠通便及抗炎的药理作用，比较2种工艺的差异：采取给食禁水的方法造成小鼠肠燥便秘的模型，考察何首乌的润肠通便的药理作用[8]；通过比较2种工艺所得饮片对二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型的影响，研究何首乌的抗炎作用。以期为何首乌的一体化生产提供科学依据。
1 仪器与材料Agilent1290超高效液相色谱仪，配1260 DAD检测器，美国安捷伦科技有限公司；Sartorius AG分析天平（d＝0.01 mg），瑞士Mettler-Toledo公司；DGT-G250精密鼓风恒温干燥箱，上海精宏实验设备有限公司；TGL-16B高速离心机，上海安亭科学仪器厂；超声清洗器（250 W，50 kHz），南京以马内利仪器设备有限公司。乙腈为色谱纯，购自德国Merck公司；甲醇为色谱纯，购自美国ROE公司；超纯水自制。二苯乙烯苷（批号F-022-130512）、大黄素（批号D-029-130401）、大黄素甲醚（批号D-004-130315）对照品购自成都瑞芬思生物科技有限公司，质量分数均大于98%。何首乌由贵州昌昊中药发展有限公司提供，经南京中医药大学段金廒教授鉴定为蓼科何首乌属植物何首乌Polygonum multiflorum Thunb.的新鲜块根。麻仁丸（批号140504）购自南京同仁堂药业有限公司；阿司匹林（批号140601）购自南京白敬宇制药有限责任公司。
ICR小鼠，雄性，体质量18～22 g，购自上海杰思捷实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（沪）2013-0006。
2 方法与结果 2.1 一体化工艺的优选 2.1.1 何首乌处理方法取大小均匀新鲜何首乌30 kg，切6 mm厚片[9]，置于干燥箱内，在一定温度下，烘干，即得。
2.1.2 因素水平的选择前期研究表明，何首乌切6 mm厚片较优[9]，故该工艺采取切6 mm厚片。文献研究及企业实地考察表明，中药材产地加工和饮片炮制过程中，比较重要的因素是烘干温度（A）和烘干时间（B）[10-11]，所以本实验模拟产地加工过程，以A、B为考察因素，进行正交试验，在前期研究基础上，确定因素水平表见表 1。
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表 1 一体化工艺优化正交试验结果以及产品性状 Table 1 Optimization of orthogonal test and product appearance of integration technology |
2.1.3 一体化工艺优选结果及方差分析
按照正交试验设计表（表 1），进行正交试验。饮片打粉，过4号筛，按照《中国药典》方法[1]对何首乌中二苯乙烯苷、结合蒽醌进行定量分析，采取加权综合评分法[12]对实验结果进行评价。同时运用SPSS 20.0对实验结果进行方差分析。《中国药典》2015年版以二苯乙烯苷及结合蒽醌的量为何首乌的质量控制标准，因此规定二苯乙烯苷、结合蒽醌的权重系数分别设定为0.5、0.5。综合评分＝(二苯乙烯苷质量分数/最高二苯乙烯苷质量分数)×0.5＋(结合蒽醌质量分数/最高结合蒽醌质量分数)×0.5，其结果见表 1，方差分析见表 2。
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表 2 方差分析 Table 2 Analysis of variance |
综合评分结果显示，虽然A1B2工艺得分最高，但A1B2工艺得到的饮片含水量＞10%，不能满足《中国药典》2015年版要求。从表 1中直观分析可知，A2B3为最佳工艺参数，且综合评分结果也显示A2B3工艺得分仅次于A1B2工艺。方差分析结果显示因素A和B对二苯乙烯苷和结合蒽醌质量分数均无显著性影响，故最后选择A2B3为最佳优化工艺，即“新鲜何首乌切6 mm厚片，置于干燥箱内50 ℃，16 h烘干”。
2.1.4 最佳工艺验证及与传统工艺的比较取大小均匀的新鲜何首乌18 kg，分别按照最佳工艺（新鲜何首乌切6 mm厚片，置于干燥箱内50 ℃、16 h烘干）和《中国药典》2015年版一部[1]中规定方法炮制何首乌饮片。对2种工艺制得何首乌饮片中的二苯乙烯苷、结合蒽醌进行定量分析，验证一体化工艺的合理性。其结果见表 3。
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表 3 最佳工艺验证以及传统工艺结果 Table 3 Results of integration technology and traditional technology |
由2个成分质量分数可知，2种工艺之间无显著性差异（P＞0.05）；由综合评分结果可知，验证工艺平均得分0.90，传统工艺平均得分为0.86，以上结果表明该最佳工艺切实可行，可操作性强。
2.2 一体化工艺与传统工艺饮片对便秘小鼠排便情况的影响 2.2.1一体化工艺与传统工艺饮片对便秘小鼠小肠推进的影响取ICR小鼠90只，随机分成9组，依照临床剂量[1]换算小鼠给药量且设置高、中、低剂量组，即对照组、模型组、何首乌一体化工艺/传统工艺饮片低、中、高剂量（1.2、2.4、4.8 g/kg）组、麻仁丸（3.6 g/kg）组。各组按20 mL/kg给药体积ig给药，分组及给药剂量见表 4，每日给药1次，连续7 d，于给药后第4天，除对照组外每组仅喂食饲料，断绝水源，连续3 d，末次给药前12 h各组禁食禁水、给药30 min后，按10 mL/kg剂量各组小鼠ig炭末混悬液，20 min后脱颈椎处死，剖腹剪取上端至幽门，下端至盲部的肠管，计算小肠推进率（小肠推进率＝小肠炭末推进长度/小肠长度）。结果表明，一体化工艺与传统工艺所得饮片高、中、低剂量均能增加便秘小鼠的小肠推进率，且与模型组相比有显著性差异（P＜0.05、0.01），均呈现一定的剂量依赖性，一体化工艺组与传统工艺组相比未见显著性差异（P＞0.05）。
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表 4 不同工艺何首乌饮片对便秘小鼠小肠推进的影响 Table 4 Effect of different process of PMR pieces with for intestinal propulsion in constipation mice |
2.2.2
一体化工艺与传统工艺饮片对便秘小鼠首次排便时间及粪便含水量的影响取ICR小鼠90只，随机分成9组，依照临床剂量[1]换算小鼠给药量且设置高、中、低剂量组，即对照组、模型组、何首乌一体化工艺/传统工艺饮片低、中、高剂量（1.2、2.4、4.8 g/kg）组、麻仁丸（3.6 g/kg）组。各组按20 mL/kg给药体积ig给药，每日给药1次，连续7 d，于给药后第4天，除对照组外每组只喂干饲料，断绝一切水源，连续3 d，对照组正常饲养，末次给药前12 h各组禁食禁水、给药30 min后，按10 mL/kg给药体积，各组小鼠ig炭末混悬液，各组小鼠单笼饲养，记录自ig炭末混悬液到首次排黑便的时间（排便潜伏期），以及小鼠8 h内所排粪便的含水量。结果见表 5。
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表 5 不同工艺何首乌饮片对便秘小鼠首次排便时间及粪便含水量的影响 Table 5 Effects of PMR pieces with different process on constipation mice first time and fecal water content |
2.3 一体化工艺与传统工艺饮片对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的抗炎作用研究
取ICR小鼠90只，随机分成9组，每组10只，依照临床剂量[1]换算小鼠给药量且设置高、中、低剂量组，即对照组、模型组、何首乌一体化工艺/传统工艺饮片低、中、高剂量（1.2、2.4、4.8 g/kg）组、阿司匹林（0.6 g/kg）组。各组按20 mL/kg给药体积灌胃给药，分组及给药剂量见表 6、7。二甲苯致炎前7 d ig给药，每天1次。末次给药1 h后，除对照组外，各组小鼠于左耳正反两面涂抹0.04 mL二甲苯致炎，右耳做对照。二甲苯致炎45 min后眼框取血，血样3 000 r/min离心10 min，取上清液，EILSA检测血清中肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-1β（IL-1β）、IL-6、IL-8的水平；随后将小鼠脱颈处死，沿耳廓基线剪下两耳，用直径7 mm的打孔器分别在同一部位打下圆耳片，称质量，以左右耳片质量之差为肿胀度。
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表 6 不同工艺何首乌饮片对小鼠耳廓肿胀度的影响 Table 6 Effect of two kinds of technology of PMR pieces on auricle swelling of mice |
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表 7 不同工艺何首乌饮片对耳廓肿胀模型小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8水平的影响 Table 7 Effects of PMR pieces by two techenologies on levels of TNF-α, IL-1β, IL-6, and IL-8 contents in serum of ear swelling model of mice |
肿胀率＝(左耳质量－右耳质量)/右耳质量
与模型组比较，阿司匹林组、一体化/传统工艺高、中、低剂量组均能够非常显著降低小鼠耳廓肿胀度（P＜0.01），且与用药剂量呈现正相关。同时2种工艺同剂量组比较，一体化工艺组抗炎效果显著优于传统工艺组（P＜0.01）。
3 讨论在正交试验的基础上，本实验采用多指标综合评分法对何首乌的加工工艺进行优选，结果表明方差分析及综合评分的结果具有一致性，确定了何首乌的最佳一体化工艺；一体化工艺与传统分段加工工艺的定量分析结果显示，一体化工艺优于传统分段加工工艺。
对小鼠排便情况影响结果表明，一体化工艺与传统工艺饮片高、中、低剂量均能增加便秘小鼠的小肠推进率，与模型组比较有显著性差异（P＜0.05、0.01），均呈现一定的剂量依赖性。虽然一体化工艺组与传统工艺组比较未见显著性差异（P＞0.05），但是一体化工艺的饮片对小鼠的小肠推进率有大于传统工艺饮片的趋势；2种工艺所得饮片均能够有效地缩短失水燥结型便秘小鼠的首次黑便时间及显著提高粪便含水量，其中一体化工艺高、中、低剂量组有优于传统工艺组效果的趋势，并无显著性差异。有研究表明结合蒽醌具有泻下作用，且在一定范围内呈现剂量依赖性[13]，实验结果显示一体化工艺所得饮片所含结合蒽醌高于传统工艺所得饮片，与药理效应评价结果具有一致性，符合结合蒽醌具有泻下作用的论述。相关研究[14]表明蒽醌类成分能够通过增高肠道中5-HT及其受体水平，刺激肠道蠕动、刺激肠液的分泌从而体现泻下的作用。故小鼠粪便含水量增加的原因可能是由于肠道的蠕动导致其对水分重吸收的作用减弱，肠液分泌量增加，导致其水分的增多。
对二甲苯致小鼠耳廓肿胀模型的影响结果表明，通过模型组与对照组比较可以看出，各项指标模型组与对照组有显著性差异（P＜0.01），表明模型复制成功。一体化工艺与传统工艺高、中、低剂量组均能够有效地减轻二甲苯致小鼠耳廓肿胀的炎症反应，且一体化工艺所得饮片效果优于传统工艺组。有研究表明，蒽醌类成分（大黄素、大黄素甲醚等）多具有抗菌、消炎、抗氧化的功效[15]，其药理实验结果与成分定量测定结果具有一致性，其具体机制需要进一步研究。
总体来讲，一体化工艺与传统工艺相比化学成分无显著性差异，药效方面，2种工艺产品均能够显著提高便秘小鼠的小肠推进率，缩短排便时间，提高粪便含水量，且一体化工艺所得饮片有优于传统工艺饮片的趋势，但无显著性差异；2种工艺均能够有效地减小小鼠耳廓肿胀度，降低炎症因子水平，一体化工艺显著优于传统工艺组。同时一体化工艺相对传统工艺来说，降低了时间、劳动力及经济投入，大大提高了经济效益。故此一体化工艺切实可行，可操作性强。
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