2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.16.027 |
2. 福建中医药大学药学院, 福建 福州 350122
, HUANG Xiao-qiang2, XU Wen2, YANG Bao-cheng1, ZHANG Shou-ren1, LIU Yi-wen2, LI Xiao-yan2
, WU Shui-sheng2
2. School of Pharmacy, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou 350122, China
泽泻系泽泻科植物泽泻Alisma orientale (Samuels) Juzep.的干燥块茎，具有利水渗湿、泄热，化浊调脂的功效[1]。现代药理学研究表明，泽泻中三萜类化合物具有利尿、调血脂、降血糖、抗动脉粥样硬化的作用[2-3]。《中国药典》2015年版只规定了23-乙酰泽泻醇B的测定，目前泽泻中三萜类化合物的定量分析方法已有HPLC-UV、HPLC-ELSD法被报道[4-6]，但是以上方法只针对2个或4个成分进行定量分析，具有很大的局限性[7-8]。因此建立泽泻多指标的综合质量评价方法十分必要。本研究建立RP-HPLC-DAD法对泽泻药材中泽泻醇C、泽泻醇F、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇L、24-乙酰泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇G、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B 11个成分进行测定，本法操作简单、准确度高，为泽泻药材的全面质量控制提供了科学依据。同时对福建和四川产泽泻主要的成分的量进行了聚类分析，比较2大主产地泽泻药材的质量异同。
1 仪器与试药Shimadzu LC-20AT高效液相色谱仪（LC-20AT输液泵，SPD-M20A检测器，CBM-20A工作站，CTO-22A柱温箱），LCsolution工作站；KQ-500E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；DV215CD型十万分之一分析天平（奥豪斯公司）；HCP-500A粉碎机（永康市金穗机械制造厂）；Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司），乙腈为色谱纯（德国Merck公司），其余试剂均为分析纯。
对照品泽泻醇C、泽泻醇F、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇L、24-乙酰泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇G、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B由本实验室自制，通过MS和1H、13C-NMR数据与文献比较确认[9]，经HPLC-DAD（面积归一法）检测质量分数均大于98.0%。25批次泽泻药材采自福建、四川等地，经福建中医药大学药药院吴水生教授鉴定为泽泻科植物泽泻Alisma orientale (Samuels) Juzep.的干燥块茎。具体样品信息见表 1。
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表 1 样品信息 Table 1 Information of samples |
2 方法与结果 2.1 色谱条件
采用Ultimate XB-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5μm），流动相为乙腈（A）-水（B），梯度洗脱，0～5 min，35% A；5～20 min，35%～55% A；20～35 min，55%～65% A；35～45 min，65%～75% A；45～55 min，75%～85% A；55～65 min，85% A；体积流量1 mL/min；检测波长为208、245 nm；柱温30℃；进样量20μL。对照品与样品的色谱图结果见图 1和2。
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图 1 对照品(A)、泽泻样品(B)在245 nm处的色谱图 Fig.1 HPLC of reference substances (A) and samples of Alismatis Rhizoma (B) at 245 nm |
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图 2 对照品(A)、泽泻样品(B)在208 nm处的色谱图 Fig.2 HPLC of reference substances (A) and samples of Alismatis Rhizoma (B) at 208 nm |
2.2 对照品溶液制备
取各对照品适量，精密称定，加入乙腈制备成泽泻醇C、泽泻醇F、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇L、24-乙酰泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇G、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B质量浓度分别为172.10、118.80、93.69、26.80、55.96、660.00、356.40、204.75、572.68、1 183.62、168.80μg/mL混合对照品储备液，备用。
2.3 供试品溶液制备将泽泻药材粉碎，过60目筛得泽泻粉末。取泽泻粉末1 g，精密称定，置具塞三角瓶中，精密加入乙腈25 mL，密塞，称定质量，超声提取30 min（功率250 W，频率50 kHz），放冷，称定质量，用乙腈补足减少的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
2.4 线性关系考察分别取“2.2”项下方法制备的混合对照品储备液，用乙腈稀释，摇匀。精密吸取20μL，按“2.1”项下色谱条件进行分析，以质量浓度为横坐标（X），以峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。用乙腈逐级稀释对照品溶液，进样。按3倍信噪比计算11个成分的检测限（LOD），按10倍信噪比计算11个成分的定量限（LOQ），结果见表 2。
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表 2 线性关系 Table 2 Linear relationship |
2.5 精密度试验
精密吸取混合对照品溶液20μL，连续进样6次，记录泽泻醇C、泽泻醇F、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇L、24-乙酰泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇G、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B的峰面积，结果11个被测物峰面积RSD分别为1.47%、1.05%、1.27%、1.48%、1.36%、1.01%、0.96%、1.46%、1.09%、1.94%、1.18%，结果表明仪器的精密度良好。
2.6 稳定性试验取供试品溶液分别于0、2、6、10、12、24、48 h进样20μL，计算得泽泻醇C、泽泻醇F、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇L、24-乙酰泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇G、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B峰面积RSD分别为0.80%、2.06%、1.56%、1.28%、2.38%、1.55%、1.57%、1.54%、0.90%、1.67%、1.14%，结果表明供试品溶液在48 h内稳定。
2.7 重复性试验精密称取同一批泽泻样品6份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别进样，测定峰面积，计算各成分质量分数的RSD。泽泻醇C、泽泻醇F、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇L、24-乙酰泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇G、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B质量分数RSD分别为1.08%、1.98%、1.63%、0.96%、1.43%、0.65%、1.07%、1.26%、1.51%、0.63%、0.67%，结果表明该法重复性良好。
2.8 加样回收率试验取已测定的泽泻粉末，每份0.5 g，精密称定。精密加入等量的11种对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下测定，结果泽泻醇C、泽泻醇F、23-乙酰泽泻醇C、泽泻醇L、24-乙酰泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇G、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B、11-去氧泽泻醇B的平均加样回收率分别为98.76%、100.24%、97.97%、100.14%、99.88%、96.54%、97.27%、98.85%、99.45%、98.85%、98.13%，RSD分别为2.00%、1.00%、1.03%、1.39%、1.16%、1.07%、1.46%、1.18%、1.94%、0.84%、1.82%。
2.9 样品测定分别取不同批次泽泻样品粉末1 g，精密称定，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，进样20μL后测定峰面积，代入标准曲线计算其质量分数，结果见表 3。
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表 3 泽泻药材中11种三萜类成分的量 Table 3 Contents of 11 triterpenes in Alismatis Rhizoma by RP-HPLC-DAD |
2.10 数据分析
运用DPS 14.50数据处理软件分析：采用系统聚类法，以11种指标成分量为变量，以卡方距离为指标，对25批泽泻样品进行聚类分析[10]。结果不同产地的药材可聚类为“川产泽泻”和“闽产泽泻”2大类，见图 3。
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图 3 25批次泽泻样品的系统聚类分析图 Fig.3 Hierarchical clustering analysis on Alismatis Rhizoma |
3 讨论 3.1 提取方法和色谱条件的优化
比较了不同体积分数甲醇和乙腈为提取溶剂，结果以100%乙腈为提取溶剂，提取率最高且提取的杂质较少。考察超声和回流2种提取法对待测成分提取率的影响，结果表明2种方法提取率无明显差异，然而回流提取杂质明显多于超声提取法。考察乙腈超声提取工艺，结果显示25倍量乙腈超声（250 W，50 kHz）提取30 min，1次即可提取完全。考察了梯度和等度洗脱以及不同流动相（甲醇-水、乙腈-水）对分离和柱效的影响。结果发现乙腈-水洗脱分离效果优于甲醇-水，并且由于泽泻三萜无共轭结构，紫外末端吸收，甲醇-水系统基线漂移明显高于乙腈-水，因此采用乙腈-水作为流动相。选择上述“2.1”项色谱条件下的梯度洗脱。在该色谱条件下，各组分的保留时间最合适，分离效果较优。
3.2 检测波长的确定对被测成分进行全波长扫描，由于泽泻醇F、24-乙酰泽泻醇F、泽泻醇A、24-乙酰泽泻醇A、泽泻醇G、泽泻醇B、23-乙酰泽泻醇B和11-去氧泽泻醇B的结构中无共轭结构，最大吸收波长在197 nm，为末端吸收，干扰因素较多，而在208 nm干扰较少。泽泻醇C和23-乙酰泽泻醇C结构中13，16，17位有共轭双键，而且16位羰基的增色作用，使他们最大吸收波长在245 nm。泽泻醇L在245 nm波长下干扰较少，故最终选用208、245 nm作为检测波长。
3.3 定量分析25批次泽泻药材均符合《中国药典》2015年版规定泽泻中23-乙酰泽泻醇B的的量不低于0.050%（0.500 0 mg/g）。然而不同来源的泽泻中11种三萜类成分量存在差异，例如福建泽泻样品中未检测到泽泻醇A，而四川泽泻中泽泻醇A含量较高，达0.425 0～1.056 mg/g。福建泽泻样品中24-乙酰泽泻醇A量（0.038 0～0.083 2 mg/g）也显著低于四川泽泻中24-乙酰泽泻醇A量（0.069 3～0.247 8 mg/g），并且发现色谱图上，在24-乙酰泽泻醇A峰号前还有一个很高的7′号峰，经对照品比较确定为泽泻倍半萜成分泽泻醇，其保留时间和24-乙酰泽泻醇A很接近，这个峰在福建泽泻和川泽泻中均有，并且峰面积较大，非常容易和24-乙酰泽泻醇A混淆，定量时应该注意勿积分错误。此外23-乙酰泽泻醇B的量各批次间差异较大，质量分数最低与最高分别为0.975 7、2.234 mg/g。而文献报道泽泻多种三萜均具有调血脂作用[11-12]，因此，采用单一某个指标来评价泽泻药材的质量显然有很大的局限性，建立泽泻多指标的综合质量评价方法十分必要。同时对福建和四川产的泽泻主要成分量进行了聚类分析，比较两大主产地泽泻药材的质量异同。该法可为泽泻的产地鉴别提供一定的参考。
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