细胞色素P450还原酶（EC 1.6.2.4，cytochrome P450 reductase，简称CPR或POR）是一种在许多代谢进程中必需的酶，主要参与细胞色素P450氧化酶系（cytochrome P450 oxidoreductase system，P450s）催化的初级及次级代谢反应，如萜类物质代谢、药物代谢、外源化合物代谢等^[1-2]。在此氧化系统中，CPR的功能是从底物NADPH获取电子，通过FMN和FAD辅因子传递给细胞色素P450，氧化底物；CPR与P450s间的电子传递是P450s氧化反应的限速步骤^[3]。此外，CPR还能向细胞色素b5、鲨烯单氧化酶、血红素加氧酶提供电子，能直接催化一些前体药物的单原子还原活化^{[2, 4]}。

茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf是一种腐生或寄生在松科植物赤松和马尾松根部的高等真菌，隶属于担子菌门（Basidiomycetes）多孔菌科（Polyporaceae）^[5]。茯苓菌核是一种传统中药，约10%的中成药（约300种）原料配方中含有茯苓，也被用于食品添加剂、膳食、保健品、化妆品等^[6-7]。茯苓具有抗肿瘤、抗氧化、抗惊厥等多种生物活性，其主要化学成分为多糖及三萜类化合物^[5]。

P450参与萜类物质代谢已有大量研究报道，如CYP71AV1参与青蒿素的生物合成^[8]、CYP88D6与CYP72A154参与甘草酸的生物合成^[9-10]、CYP76AH1参与丹参酮的生物合成^[11]、在灵芝中大量CYP基因被推测与灵芝三萜合成相关^[12]。此外，研究发现担子菌基因组中存在大量CYP基因，且数量较其他真菌多；另有认为棕腐菌比白腐菌拥有丰富的CYP基因，这都让CYP被认为与担子菌的生物学、生态、进化密切相关^[13-14]。

本实验室通过对茯苓转录组测序及分析，提出了茯苓中主要活性成分三萜骨架的生物合成途径，并注释出了249个Unigene为CYP，且推测多个参与茯苓酸、土莫酸等三萜化合物的生物合成^[15]。本研究在上述研究基础之上，利用茯苓的高通量测序结果，挖掘出茯苓CPR（PcCPR）基因相关序列，通过RACE（rapid-amplification of cDNA ends）技术扩增得到PcCPR基因cDNA全长，PCR得到对应基因组DNA序列。通过生物信息学方法分析PcCPR基因及其编码蛋白，为阐释PcCPR基因功能提供理论依据。从而为研究茯苓CYP基因功能乃至解析茯苓三萜的生物合成途径奠定基础。

茯苓Poria cocos (Schw.) Wolf菌核于2012年采自湖北省英山县石头咀镇的栽培田间，并通过分离纯化得到纯培养。28℃下，在马铃薯葡萄糖培养基（PDA）上培养7 d，收集得到菌丝体。

茯苓菌丝总RNA的提取使用RNAiso Plus（Takara，大连）试剂提取，提取方法依据其说明书进行。茯苓DNA的提取采用CTAB法。

根据茯苓的转录组数据^[15]中注释为CPR基因的Unigene设计RACE引物CPR-31、CPR-32、CPR-51、CPR-52（表 1）。3’RACE方法^[16]使用经典3’RACE方法，使用PrimeScript Ⅱ 1^st strand cDNA synthesis试剂盒（Takara，大连），以Q_T引物对提取的茯苓总RNA进行反转录，得到第1链cDNA产物用Tricine-EDTA稀释10倍作为PCR模版。3’RACE第1轮PCR反应体系：0.2μmol/L dNTPs，0.25μmol/L Q_O，0.25μmol/L CPR-31，1 U Ex Taq酶，1μL cDNA模版，20μL体系。PCR程序为94℃、5 min预变性；94℃、30 s，67℃、30 s，72℃、2 min，每个循环退火温度降1℃，共10个循环；后为25个循环94℃、30 s，57℃、30 s，72℃、2 min扩增；最后加72℃10 min延伸。巢式PCR第2轮使用CPR-32、Q_I引物，以1μL稀释20倍的第1轮PCR产物为模版，从66℃开始进行降落PCR反应。PCR产物使用胶回收试剂盒（Axygen，杭州）回收，TA克隆连接至pMD18-T载体（Takara，大连），转化Trans1-T1E. coli感受态细胞（全式金，北京）。单克隆进行菌落PCR鉴定，阳性菌株测序。

表 1(Table 1)

表 1 实验中使用的引物 Table 1 Primers used in this study 名称 序列(5’→3’) CPR-31 GAATGTGGAGGAGGGTCAGGG CPR-32 ACGATGCAAAGAACCCGTACC CPR-51 GATTACGCCAAGCTTGACGACCGGCGACGGCGCTAATG CPR-52 GATTACGCCAAGCTTCCGCATTGGACGGCCAAACACC CPR-g1 CCATGCTGAATGGAGATTCTGAC CPR-g2 GTTGATCCTGCGATCATTGTGG CPR-1 ATGGCGTCGTCTTCGGACA CPR-2 TCAGCTCCAGACATCGAGCA QTa CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAG-CTTTTTTTTTTTTTTTTT QOa CCAGTGAGCAGAGTGACG QIa GAGGACTCGAGCTCAAGC a引物序列参考文献报道[16] aPrimers’sequences from reference[16]

表 1 实验中使用的引物 Table 1 Primers used in this study

5’RACE利用SMARTer RACR 5’/3’试剂盒（Clontech，日本），依据其说明书进行5’RACE的反转录，得到相应的第一链cDNA。根据试剂盒说明书使用引物CPR-51、CPR-52分别进行第1轮PCR和巢式第2轮PCR。PCR产物胶回收，In-Fusion克隆至pRACE载体中，转化。菌落PCR验证单克隆，阳性菌落测序。

根据3’RACE及5’RACE测序拼接结果设计引物CPR-1、CPR-2，PCR并测序验证。利用转录组数据，在茯苓的基因组数据^[17]中找到PcCPR基因位置，在其上下游设计引物CPR-g1、CPR-g2。以提取的茯苓DNA为模版，克隆PcCPR基因。PCR体系：在GC buffer I中加入0.4μmol/L dNTPs，0.2μmol/L CPR-g1，0.2μmol/L CPR-g2，1.5 U LA Taq酶，1μL DNA模版，共25μL体系。反应程序：95℃预变性1 min；98℃变性20 s；57℃退火30 s；68℃延伸7 min，且延伸时间每个循环加10 s；共35个循环反应，后加72℃反应15 min。

使用DNAMAN 8软件对3’和5’RACE得到的基因序列进行拼接，得到基因全长mRNA序列。利用NCBI BlastX比对，以确定得到的为PcCPR基因，并得到其开放阅读框（ORF）。利用DNAMAN 8翻译得到PcCPR蛋白质氨基酸序列。从GenBank下载真菌CPR蛋白序列，使用MAFFT v7，在默认参数下进行序列多重比对，比对结果使用MEGA 6进行系统发育分析。使用邻接法（Neighbor-Joining，NJ），Poisson模型构建系统发育树，建树可靠性使用Bootstrap，重复1 000次进行验证。

利用GSDS 2.0（Gene Structure Display Server，http://gsds.cbi.pku.edu.cn/）在线分析PcCPR的基因结构。使用ExPASy-ProtParam tool（http://web.expasy.org/protparam/）分析PcCPR蛋白的基本理化性质，应用ExPASy-ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）分析蛋白质氨基酸的亲疏水性。PcCPR蛋白质信号肽预测采用SignalP 4.1 server（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）；跨膜区预测采用TMHMM Server v. 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）；蛋白亚细胞定位预测则采用ProtComp v. 9.0（http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=protcompan & group=programs & subgroup=proloc）进行。应用I-TASSER（http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/I-TASSER/）进行蛋白质三级模拟。应用NCBI的CDD（Conserved Domain Database）数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）进行蛋白质保守结构域分析。

利用茯苓转录组数据中注释为cytochrome P450 oxidoreductase的Unigene序列直接设计引物进行3’RACE及5’RACE，结果见图 1。3’RACE得到1 647 bp含有17 bp Poly（A）尾的序列；5’RACE得到1 002 bp序列。使用DNAMAN拼接得到2 514 bp的基因全长mRNA序列，并通过基因全长序列PCR测序验证正确。通过Blast确认所得为CPR基因序列，并将其命名为PcCPR。利用分离自美国弗罗里达州阿拉楚瓦郡的茯苓单孢培养菌株MD-104 SS10的基因组测序结果设计的引物扩增得到5 292 bp的PcCPR基因的基因组DNA序列（图 1-D）。将PcCPR基因的mRNA及基因组DNA序列提交至Genbank，获得Genbank登录号分别为KP768251、KP896487。利用GSDS 2.0在线工具分析PcCPR基因结构，如图 2所示，其含有4个外显子、3个内含子。PcCPR基因含2 199 bp的编码区（CDS），编码732个氨基酸；含有80 bp的5’非编码区（5’UTR）、218 bp的3’非编码区（3’UTR）。

图 1 PcCPR基因扩增产物电泳结果 Fig.1 Agarose gel electrophoretic analysis of PCR products of PcCPR gene

图 2 PcCPR基因结构 Fig.2 Gene structure of PcCPR gene

利用克隆得到的PcCPR mRNA序列，翻译得到PcCPR的氨基酸序列。使用ExPASy-ProtParam tool预测PcCPR蛋白的性质，见表 2。预测该蛋白为相对分子质量81 147的蛋白，等电点（pⅠ）为5.39，不稳定系数（Ⅱ）40.02，平均疏水性（grand average of hydropathy，GRAVY）为−0.337。根据工具定义，不稳定系数（Instability index，Ⅱ）值大于40时，蛋白预测为不稳定，小于40时为稳定蛋白；GRAVY值范围为−2～2，正值表明此蛋白为疏水蛋白，负值表明为亲水蛋白。因此，PcCPR为不稳定的亲水蛋白。此外，利用ProtScale工具预测蛋白一级结构上的亲疏水性，使用默认的Hphob./Kyte & Doolittle标度打分，窗口大小（window size）为9，线性加权模型（linear weight variation model）。从预测结果（图 3）可知，PcCPR在一级结构上，多数区域的打分值为负，即表现亲水性，其结果与ExPASy-ProtParam tool预测结果一致。其中，第11位具有最高正值3.122，疏水性最强；第195位具有最低负值−2.967，亲水性最强。

表 2(Table 2)

表 2 PcCPR理化性质预测 Table 2 Predicted physicochemical properties of PcCPR 理化指标 预测结果 氨基酸数/个 732 相对分子质量 81 147 pⅠ 5.39 负电荷残基数（Asp+Glu）/个 101 正电荷残基数（Arg+Lys）/个 82 分子式 C3615H5645N977O1097S25 Ⅱ 40.02 GRAVY −0.337 脂肪系数（AI） 82.21

表 2 PcCPR理化性质预测 Table 2 Predicted physicochemical properties of PcCPR

图 3 PcCPR氨基酸亲水性/疏水性预测 Fig.3 Predicted hydrophobicity/hydrophilicity of the amino acid sequence of PcCPR

使用在线工具SignalP 4.1 server预测PcCPR的N端信号肽，使用默认参数设置，预测结果如图 4所示。预测结果显示，在第18位氨基酸有最高的C分值（原始剪切位点的分值，raw cleavage site score）0.325，即蛋白可能在此位置被切割；而最大S分值（0.627，信号肽分值，signal peptide score）在第1位氨基酸，蛋白第1～17位氨基酸的平均S分值为0.387；几何平均分C值与S分值打分的斜率得到的Y分值（combined cleavage site score）最大在第18位氨基酸，为0.342。对第1～17位氨基酸平均S分值及最大Y分值加权平均后得到的D分值（discrimination score）为0.360，小于设定阈值0.500。因此，预测PcCPR不含有信号肽，说明此蛋白为非分泌蛋白且不具有信号识别功能。

图 4 PcCPR信号肽预测 Fig.4 Signal peptide prediction of PcCPR

使用TMHMM Server v. 2.0预测PcCPR的跨膜区，结果（图 5）表明PcCPR有一段跨膜螺旋区，即蛋白的第7～22位氨基酸。蛋白第1～6位氨基酸在膜内侧，第23～732位氨基酸在膜外侧。

图 5 PcCPR跨膜区预测 Fig.5 Transmembrane helices prediction of PcCPR

ProtComp 9.0是一种结合多种方法对蛋白进行亚细胞定位预测的软件。通过直接对比已知亚细胞定位的同源性蛋白，得出总分为10分的打分结果LocDB；而对比数据库中具有有力理论推测定位的蛋白结果，则得到总分为5分的打分结果（PotLocDB）；基于神经网络分析预测的打分则定义为总分3分的Neural Nets分值；基于序列与数据库五聚体分布对比计算打分结果得到总分5分的Pentamers分值；最后，对这4项打分进行加权后，得到总分为10分的最终结果（Integral）。对PcCPR使用ProtComp 9.0进行亚细胞定位预测，结果如表 3所示。预测结果表明，PcCPR应定位于内质网上，其软件综合打分结果最高，为9.90。

表 3(Table 3)

表 3 PcCPR亚细胞定位预测 Table 3 Sub-cellular location prediction of PcCPR 亚细胞 分值 LocDB PotLocDB Neural Nets Pentamers Integral 细胞核 0.0 0.0 0.23 0.00 0.02 质膜 0.0 0.0 0.37 0.00 0.06 胞外 0.0 0.0 0.20 0.00 0.00 细胞质 0.0 0.0 0.31 0.00 0.01 线粒体 0.0 0.0 1.11 0.17 0.00 内质网 10.0 3.0 0.19 3.20 9.90 过氧化物酶体 0.0 0.0 0.19 0.00 0.01 溶酶体 0.0 0.0 0.14 0.00 0.00 高尔基体 0.0 0.0 0.02 0.29 0.00 液泡 0.0 0.0 0.25 0.00 0.00

表 3 PcCPR亚细胞定位预测 Table 3 Sub-cellular location prediction of PcCPR

I-TASSER是一款蛋白高级结构及功能预测软件，能利用蛋白序列模拟预测出高质量、高分辨的蛋白3D结构。利用I-TASSER对PcCPR的高级结构进行模拟预测，模型结果利用Swiss-PdbViewer 4.1.0软件查看。模型预测结果如图 6所示，PcCPR蛋白的空间结构以螺旋和无规则卷曲为主。模型预测结果与PDB数据库中酿酒酵母（2bf4A）、褐家鼠（1ja1A、1tllA）CPR蛋白的结构相似度高。

图 6 应用I-TASSER模拟PcCPR蛋白三级结构 Fig.6 Predicted three-dimensional structure of PcCPR with I-TASSER

PcCPR的保守结构域分析预测使用NCBI中的CDD数据库（Conserved Domain Database），结果如图 7所示。该蛋白N端第65～208位与NADPH依赖的FMN还原酶超家族（FMN_red superfamily）蛋白保守相似，第264～731位氨基酸的C端则与类似铁氧还蛋白还原酶超家族（FNR_like superfamily）蛋白保守相似；属于CysJ多保守域蛋白。结果显示，PcCPR蛋白的第264～731位极相似于NADPH cytochrome p450 reductase（CYPOR）保守域，且在此区域中预测出多个FAD结合位点、NADP结合位点、催化残基等。

图 7 PcCPR保守结构域分析 Fig.7 Conserved domain prediction of PcCPR

从Genbank中下载不同分类下的真菌的18条CPR蛋白质序列，以及黏菌盘基网柄菌的序列。使用BioEdit 7对PcCPR蛋白与其他物种蛋白进行同源性分析显示（表 4），PcCPR氨基酸序列与同属于担子菌亚门的黄孢原毛皮革菌、异孔异担子菌、毛韧革菌的序列相似度较高，相似性分别为91%、87%、86%；序列一致性为82%、79%和76%；而与黑曲霉、裂殖酵母等子囊菌的CPR蛋白的相似度相对较低为54%～60%，序列一致性为37%～44%；与分类为黏菌的盘基网柄菌的相似为49%，一致性为32%。对这20条蛋白序列使用MAFFT软件进行多序列比对。使用MEGA软，采用NJ法构建系统发育树。结果显示（图 8），PcCPR蛋白与黄孢原毛皮革菌中该蛋白的亲缘关系最近，同时与另2种担子菌异孔异担子菌、毛韧革菌聚为一支。这与它们的分类地位一致，茯苓与黄孢原毛皮革菌同属于多孔菌目（Polyporales）；而后两者则属于红菇目（Russulales）。不仅如此，真菌CPR蛋白的聚类结果与其分类基本一致。

表 4(Table 4)

表 4 PcCPR与不同真菌CPR蛋白序列一致性及相似性 Table 4 Identities and similarities between PcCPR and CPR proteins from different fungi 物种名 序列登录号 序列一致性/% 序列相似性/% 茯苓Poria cocos KP768251 — — 黄孢原毛平革菌Phanerochaete chrysosporium Q9HDG2.1 82 91 异孔异担子菌Heterobasidion irregular XP_009545907.1 79 87 毛韧革菌Stereum hirsutum XP_007304804.1 76 86 黑曲霉Aspergillus niger A2QS05.1 44 59 构巢曲霉Aspergillus nidulans Q5BFT5.1 44 59 烟曲霉Aspergillus fumigatus Q4WM67.1 44 59 灰葡萄孢Botrytis cinerea CAE76653.1 43 60 米曲霉Aspergillus oryzae Q2UHA7.1 43 59 土曲霉Aspergillus terreus Q0CMM0.1 43 59 稻瘟菌Magnaporthe oryzae ELQ61488.1 43 58 蛹虫草Cordyceps militaris XP_006671968.1 42 59 禾谷镰刀菌Fusarium graminearum ESU16412.1 42 59 粗糙脉孢菌Neurospora crassa EAA35207.1 42 59 里氏木霉Trichoderma reesei XP_006962366.1 41 59 麦芽糖假丝酵母Candida maltosa P50126.1 38 57 热带假丝酵母Candida tropicalis P37201.1 38 56 酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae P16603.3 38 55 裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe P36587.1 37 54 盘基网柄菌Dictyostelium discoideum XP_646400.1 32 49

表 4 PcCPR与不同真菌CPR蛋白序列一致性及相似性 Table 4 Identities and similarities between PcCPR and CPR proteins from different fungi

图 8 不同真菌CPR蛋白系统发育关系 Fig.8 Phylogenetic relationships among CPR proteins from different fungi

在真核生物体内，CPR是唯一必需的中间体黄素蛋白，是P450s的重要组成部分^[3]，而后者因其参与了生物体的许多重要代谢途径，在各物种里均成为了研究热点。CPR基因已在许多动物、植物、酵母中克隆出来，而在丝状真菌仅有黄孢原毛皮革菌、黑曲霉等少量报道^{[1, 3, 18]}，PcCPR基因尚未见报道。

本研究从茯苓中克隆出PcCPR基因，基因cDNA全长2 514 bp，其中2 199 bp的编码区编码732个氨基酸，与黄孢原毛皮革菌的CPR同源性最高。同时获得相应的含有上下游序列的基因组基因序列5 292 bp，PcCPR基因的结构与报道的近缘种黄孢原毛皮革菌相似，均有3个内含子^[18]。与分离自美国的茯苓菌株MD-104 SS10的高通量测序结果对比分析，基因组基因的序列一致性为93.56%，MD-104 SS10菌株基因序列长度增加115 bp，主要是在基因上游约−1 030 bp位置多出一段78 bp的序列；基因编码区序列一致性为98.59%，在30个位点有31 bp的碱基差异，这些碱基差异造成编码蛋白的共7个氨基酸的变异。

生物信息学分析结果显示，PcCPR是一个相对分子质量为81 147，PI为5.39的不稳定性亲水蛋白。蛋白为非分泌蛋白，且不具有信号识别功能。蛋白的第7～22位氨基酸被预测为跨膜区，这与报道的黄孢原毛平革菌的前22个氨基酸为跨膜区的结果相似^[18]。同时，预测出蛋白定位于内质网上，这与一般报道的CPR蛋白的定位结果一致；且研究表明这种定位是P450s功能所必需的，若将N端锚定序列去除，CPR蛋白不能定位在膜上则CPR不能支撑P450反应，只能向细胞色素C、小分子化合物等提供电子^[2]。对蛋白的亲疏水性、信号肽及跨膜区的预测也支持了蛋白定位于膜上的预测。

CPR蛋白的活性需要FMN和FAD 2个辅因子才能从底物NADPH获取并传递电子。PcCPR蛋白预测出多个FAD、NADP的结合位点，这些位点在模拟的蛋白三级结构空间上是各自相邻近的。并且预测得到2个黄素结合的保守结构域，分别与FMN还原酶超家族、类似铁氧还蛋白还原酶（ferredoxin NADP oxidoreductase，FNR）超家族保守相似，其中FMN与前者结合，FAD结合至后者上。这一预测结果与学者研究认为的CPR基因是由2个分别编码黄素氧还蛋白（flavodoxin，Fld）和FNR基因融合而成的结果相一致^{[2, 18]}。

综上所述，本研究首次从茯苓中克隆出PcCPR基因，通过各种生物信息学分析方法对蛋白序列进行预测和分析，为深入研究该酶提供基础及参考。同时，CPR在细胞色素P450酶系中具有关键作用，也为研究茯苓细胞色素P450酶系奠定基础。