P-糖蛋白（P-glycoprtein，P-gp）为20世纪80年代发现的由人体多药耐药基因1（MDR1）基因编码的跨膜转运蛋白^[1]，其能在ATP酶水解释放出能量的驱动下将异源性物质“泵”出细胞外（外排功能），从而降低细胞内的药物浓度^[2-3]。白芷为我国大宗常用中药材品种之一，具有祛风散寒、燥湿排脓、止痛等功效^[4]。而其中含有的香豆素类化合物是一类重要的有效成分，具有抗肿瘤、抗病毒、抗凝血、止血、平喘、保护血管和抗骨质疏松等作用^[5]。本课题组前期研究了白芷香豆素类化合物（欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯、氧化前胡素）在Caco-2细胞的跨膜转运，结果表明欧前胡素、异欧前胡素、氧化前胡素能促进长春新碱透过Caco-2细胞单层转运，佛手柑内酯对长春新碱透过Caco-2细胞单层转运有抑制作用^[6]。本研究通过研究白芷香豆素类化合物对ATP酶活性的影响，进而探讨其对P-gp功能的影响，为阐明白芷香豆素类化合物与其他药物的相互作用提供依据。

多功能酶标仪（VariosKan Flash，Thermo Fisher Scinentific，美国）；未经处理的96孔板（美国Corning公司）；P-gp-Glo^TM检测体系（由P-gp膜、ATP检测基质、ATP检测缓冲液、P-gp检测缓冲液、维拉帕米、Mg-ATP、矾酸钠等组成，均来自美国Promega公司）；二甲基亚砜（北京索来宝科技有限公司）；佛手柑内酯对照品（上海亿欣生物科技有限公司，批号10042131）；氧化前胡素对照品（上海融禾医药科技发展有限公司，批号100420）；欧前胡素对照品（批号110826-200712）、异欧前胡素对照品（批号110827-200407），中国食品药品检定研究院，以上各对照品质量分数均≥98%。

制备Mg-ATP标准液，将Mg-ATP溶解于P-gp检测缓冲液中，使Mg-ATP标准液系列浓度分别为30、15、7.5、3.75 mmol/L，各取10μL加入96孔板。在检测前加入ATP酶检测液，使终浓度分别为3、1.5、0.75、0.375 mmol/L。最后用多功能酶标仪测得其荧光强度值，将荧光强度值与ATP浓度进行线性回归分析，绘制ATP标准曲线。

用P-gp检测缓冲液稀释维拉帕米、矾酸钠、Mg-ATP与P-gp膜，使最终浓度分别为0.5、0.25、25、1.25 mmol/L。

将待测药物溶解于P-gp检测缓冲液中，制备2.5倍浓度。在检测荧光前加入ATP检测液，使各药物终质量浓度分别为欧前胡素10、5、1μg/mL；异欧前胡素10、5、1μg/mL；佛手柑内酯10、5、1μg/mL；氧化前胡素20、5、1μg/mL；以上药物质量浓度均依据MTT实验结果确定。

（1）添加20μL P-gp检测缓冲液到标有“NT”的孔中（空白）；（2）添加20μL 0.5 mmol/L矾酸钠到标有“矾酸钠”和“ATP标准”的孔中；（3）将0.25 mmol/L维拉帕米添加到标有“Ver”的孔中；（4）添加2.5倍浓度的各测试化合物20μL至标有“TC”的孔中；（5）添加1.25 mmol/L P-gp膜20μL至各孔，在37℃孵育5 min；（6）除“ATP标准”孔外，其他孔加入25 mmol/L Mg-ATP各10μL，37℃孵育40 min；（7）在下一步操作的2 min前，添加Mg-ATP标准液至“ATP标准”相应的孔中；（8）从37℃孵育箱中取出96孔板，停止反应，每孔添加ATP检测试剂各50μL；（9）将96孔板放在振动筛上混合，在室温孵育20 min，使之产生荧光信号；（10）使用酶标仪检测，读取荧光强度值。

计算矾酸钠组平均荧光强度值（RLU_矾酸钠）与空白组平均荧光强度值（RLU_NT）的差值，得到ΔRLU_basal，反映基础P-gp ATP酶活性。计算RLU_矾酸钠与测试化合物组平均荧光强度值（RLU_TC）的差值，得到ΔRLU_TC，反映存在受试化合物的情况下P-gp ATP酶的活性。

如果RLU_TC＜RLU_NT，则受试化合物可诱导P-gp ATP酶活性；如果RLU_NT＜RLU_TC≤RLU_矾酸钠，则受试化合物可抑制P-gp ATP酶活性；如果RLU_TC=RLU_NT，则受试化合物对P-gp ATP酶无作用。

如果ΔRLU_TC＞ΔRLU_basal，则受试化合物为P-gp ATP酶活性刺激物；如果ΔRLU_TC=ΔRLU_basal，则受试化合物对P-gp ATP酶活性无影响；如果ΔRLU_TC＜ΔRLU_basal，则受试化合物是P-gp ATP酶活性抑制剂。

采用SPSS 19.0软件进行统计分析，数据以荧光强度值表示，组间采用配对样本t检验分析。

ATP标准曲线为Y=5.665 847 11×10⁶ X+1.75×10⁶，R²=0.993 2。结果表明，荧光强度值与ATP浓度呈线性关系，且相关性较好。如果反应消耗ATP，将会产生较弱的信号，反映ATP的浓度相对较低；如果不消耗ATP，荧光信号将相对较强。

本实验的空白组、阳性对照组（维拉帕米）及阴性对照组（矾酸钠）的荧光强度值如图 1所示。空白组的荧光强度比矾酸钠组的低，反映了P-gp ATP酶活性的基础水平。矾酸钠是一种P-gp选择性抑制剂，经矾酸钠处理的样品没有P-gp ATP酶活性，所以矾酸钠处理组被选为阴性对照。维拉帕米是P-gp的底物，可以激活P-gp ATP酶活性，所以被选为阳性对照底物。维拉帕米组的荧光强度值小于矾酸钠组，即维拉帕米可激活P-gp ATP酶活性。

图 1 各对照组的荧光强度值(x±s, n=3) Fig.1 Fluorescence intensity of each control group (x±s, n=3

不同质量浓度测试药物组的荧光强度值结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 不同质量浓度测试化合物的荧光强度值(x±s, n=3) Table 1 Fluorescence intensity of tested compounds at different concentration (x±s, n=3) 组别 ρ/(μg·mL−1) 荧光强度值 空白 — 1 214 386±51 511 矾酸钠 35.5 1 253 684±92 967 维拉帕米 227.3 1 203 105±81 863 欧前胡素 10 1 165 897±97 342 5 1 196 193±104 735 1 1 186 906±105 541 异欧前胡素 10 1 048 454±88 899** 5 1 234 199±52 311 1 1 335 866±47 809 佛手柑内酯 10 1 214 204±67 440 5 1 189 106±80 124 1 1 323 520±119 697 氧化前胡素 20 1 194 671±93 275 5 1 248 320±102 735 1 1 192 608±84 344 与空白组比较：**P＜0.01 **P < 0.01 vs blank group

表 1 不同质量浓度测试化合物的荧光强度值(x±s, n=3) Table 1 Fluorescence intensity of tested compounds at different concentration (x±s, n=3)

各受试物对P-gp ATP酶活性的影响通过ΔRLU_TC与ΔRLU_basal的比较来反映，结果见图 2。欧前胡素和氧化前胡素ΔRLU_TC均大于ΔRLU_basal，推测这2种化合物对P-gp有诱导作用；且这2组的RLU值都小于维拉帕米组，由此推测在反应过程中消耗的ATP较少，与P-gp的亲和力较弱；每种化合物的高、中、低3个质量浓度的RLU值均无明显差异，可推测其对P-gp的诱导作用无浓度依赖性。中、低质量浓度异欧前胡素及高、低质量浓度佛手柑内酯ΔRLU_TC均小于ΔRLU_basal，推测其可能是ATP酶抑制剂，能够抑制P-gp的活性；可推测其对P-gp的抑制作用为浓度依赖型。经典的P-gp抑制剂维拉帕米与P-gp的亲和力较高，与P-gp结合时消耗ATP，所以使得剩余ATP的量较少，测得荧光强度较弱。另外，高质量浓度的异欧前胡素、中质量浓度的佛手柑内酯，其ΔRLU_TC大于ΔRLU_basal，由此可推测出这2种化合物在此质量浓度时对P-gp有诱导作用。

图 2 各待测化合物对P-gp ATP酶活性的影响及与基础荧光值的比较 Fig.2 Effects of tested compounds on P-gp ATPase activity and their comparison with basal fluorescence value

P-gp是一种能量依赖性转运蛋白，能利用ATP水解释放的能量主动地将疏水亲脂性药物转运至细胞外，分布于人体很多正常组织，如肠道、肝、肾、胎盘屏障的上皮细胞，其对药物的吸收、分布、代谢、排泄均有重要影响。在药物的相互作用和多药耐药的产生中发挥着重要作用。

P-gp可使细胞内药物浓度低于起效浓度而产生多药耐药，降低药物疗效。为了逆转P-gp引起的多药耐药，目前已开发出许多P-gp调节剂（如维拉帕米、环孢菌素A、他莫昔芬等）。而中医临床及实验研究表明，中医方药可增加化疗的治疗效果，中药及其单体成分可逆转肿瘤的多药耐药性，如广泛存在于植物中的黄酮类成分槲皮素是P-gp的底物，可竞争P-gp，从而影响ATP发挥作用，进而抑制P-gp的外排功能^[8]。因此，充分了解药物之间在P-gp环节可能产生的相互作用，对于寻找促进药物的转运和吸收的手段，提高药物疗效具有重要意义。

在本实验中，采用ATP酶活性测试法，基于ATP产生的荧光信号强度，通过考察待测试药物对ATP酶的活性的影响来确定其是否通过干扰ATP酶活性而阻断了P-gp的功能。P-gp依赖的荧光信号的降低反映了P-gp对ATP的消耗，信号强度降低的程度越大，P-gp的活性越强。

体外实验显示，P-gp介导的底物转运需要依靠ATP水解释放能量形成底物的浓度梯度。P-gp与底物结合后，ATP酶的活性可提高3～4倍，甚至20倍^[9]。底物所致ATP酶活性的改变是双向性的，有一些物质在高浓度时起抑制作用，却在低浓度时可以增强ATP酶的活性，而另一些药物对ATP酶的增强作用存在浓度依赖性。对P-gp ATP酶活性的诱导与抑制作用都是化合物与P-gp相互作用的指标。本研究结果表明，欧前胡素、异欧前胡素、佛手柑内酯和氧化前胡素均为P-gp底物，其中，欧前胡素及氧化前胡素为非浓度依赖性的ATP酶诱导剂；异欧前胡素和佛手柑内酯为浓度依赖的ATP酶双向调节因子，高质量浓度的异欧前胡素、中质量浓度的佛手柑内酯可诱导ATP酶活性，对P-gp具有诱导作用，中、低质量浓度的异欧前胡素及高、低质量浓度的佛手柑内酯对P-gp具有抑制作用。