2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.16.019 |
2. 北京军区总医院 干四科, 北京 100700
, LU Teng-fei1, ZHOU Hao-bo1, YAO Lu2, LI Pei-chun1, GAO Shu-ming1, LI Lin1, GAO Shan1
, YU Chun-quan1
2. Department of Forth Cadre, The Military General Hospital of Beijing PLA, Beijing 100700, China
抑郁症是严重危害人类身心健康的常见精神障碍性疾病，主要表现为明显的思维迟缓、运动抑制和情绪低落等，其中临床上最常见的是以持久性的情绪低落为主要特征，严重者常有自杀倾向[1]。同时抑郁症还伴随共病情况，如患有糖尿病[2]、风湿病[3]、心血管疾病[4]、神经系统等疾病的患者常与抑郁症共患病[5]。据世界卫生组织（WHO）公布的最新资料显示，预测到2020年抑郁症将成为全球第二大威胁人类身心健康的疾病[6]，仅次于心脏病。然而抑郁症是一种多因素疾病，目前只是对临床上表现出的症状描述分类，而对其复杂的发病机制尚未明确定论，随着研究的深入已涉及到多个领域，并出现了多个观点和假说，归纳起来主要有以下几种：单胺递质假说[7]、受体假说[8-9]、神经内分泌假说[10]、神经元损伤假说[11]。
本研究前期实验[12]通过建立大鼠慢性温和不可预知性应激（CUMS）模型，观察给予柴胡白芍药对后对大鼠的体质量、糖水消耗情况以及开场活动行为学的影响，验证了柴胡白芍药对明显的抗抑郁作用。本实验在此基础上进一步探究柴胡-白芍（1:1）药对抗抑郁的作用机制。基于大鼠脑内海马、皮质和下丘脑中单胺类神经递质去甲肾上腺素（NE）、五羟色胺（5-HT）、五羟吲哚乙酸（5-HIAA）的量变化来揭示柴胡白芍药对的抗抑郁作用。
1 材料 1.1 仪器及试剂Agilent1100高效液相色谱系统（美国Agilent公司）。色谱甲醇（美国Sigma-Aldrich公司）；色谱乙腈（美国Fisher公司）；辛烷磺酸钠（OSA，分析纯，美国Fisher Chemical公司）；乙二胺四乙酸（EDTA•Na2，北京索莱宝科技有限公司）；磷酸二氢钾（KH2PO4，天津市光复科技发展有限公司）；对照品NE（批号A7257-500MG）、5-HT（批号H9523-25MG）、5-HIAA（批号H8876-100MG）均为美国Sigma-Aldrich公司产品；乙醇（天津市智恩生物科技有限公司）。
1.2 药品柴胡Bupleuri Radix（产地河北）、白芍Paeoniae Alba Radix（产地安徽）药材均购于安徽省亳州市药材总公司中西药公司，均由天津中医药大学中药学院李天祥教授鉴定，分别为伞形科（Umbelliferae）植物柴胡Bupleurum chinense DC.或狭叶柴胡Bupleurum scorzonerifolium Willd.的干燥根及毛茛科（Ranunculaceae）植物芍药Paeonia lactiflra Pall.的干燥根。盐酸氟西汀胶囊（百优解，礼来苏州制药有限公司，批号4482A）。
1.3 动物健康雄性SD大鼠，体质量180～220 g，由北京维通利华动物实验中心提供，动物合格证号SCXK（京）2012-0001。饲养于天津中医药大学实验动物中心，实验期间保持自由饮水和进食，饲养环境温度为（24±1）℃，湿度为（55±5）%，实验前适应性喂养1周。
2 方法 2.1 柴胡白芍药对及单味药提取物的制备[12]分别取柴胡、白芍药材各0.35 kg，柴胡药材0.7 kg，白芍药材0.7 kg，均粉碎为粒径0.5 cm粗颗粒，分别用10倍量70%乙醇回流提取2次，每次1.5 h，合并提取液，静置后滤过，滤液蒸发至近干，真空干燥，干燥后称量所得膏状物质量或粉末质量，计算浸膏得率（柴胡白芍药对、柴胡、白芍提取物浸膏得率分别为18.2%、14.2%、15.0%），4℃冰箱保存备用。全部药物使用之前用生理盐水配制成溶液或混悬液，超声溶解。
2.2 分组与给药经旷场实验行为学测试后，选择行为比较接近的大鼠144只，随机分为12组，分别为对照组，模型组，阳性药组（盐酸氟西汀15 mg/kg），柴胡白芍药对低、中、高剂量（生药8、16、32 g/kg，柴胡白芍配比1:1）组，柴胡低、中、高剂量（生药8、16、32 g/kg）组，白芍低、中、高剂量（生药8、16、32 g/kg）组。各给药组从应激刺激第21天开始按照10 mL/kg对大鼠进行ig给药，连续14 d，对照组和模型组ig给予等量的生理盐水。
2.3 大鼠CUMS抑郁模型的制备参照Willner等[13]的方法并加以改进，建立大鼠CUMS抑郁模型。对照组的大鼠正常供给饲料及饮水，不接受任何刺激。其他各组接受35 d CUMS，主要包括4℃冰水游泳、昼夜颠倒、捆绑束缚、夹尾、振荡、禁食（24 h）和禁水（24 h）等。每组动物每天随机给予1种刺激，同1种刺激累计使用不超过5次。每种应激的具体操作方法如下：冰水游泳，将大鼠放入盛有4℃冷水（冰水混合物）的20 L水桶中，持续5 min；昼夜颠倒，白天将大鼠置于黑布围成的黑暗空间中，持续12 h，夜晚将大鼠置于白炽灯照射的明亮空间中，持续12 h；捆绑束缚，将大鼠置于550 mL矿泉水瓶中，使其不能自由活动，持续3 h；夹尾，用竹夹子夹住距尾根部1 cm处（使大鼠发出哀鸣即可），持续2 min；振荡，将大鼠置于水平振荡器中，振荡2 min后停止；禁食，停止供给饲料24 h；禁水，停止供水24 h。
2.4 脑组织样品制备及单胺类神经递质测定在整个实验完成之后，冰上取出大鼠脑组织，并迅速分离出海马、皮质和下丘脑组织，超声匀浆，在4℃、14 000 r/min离心20 min，取上清液待测。使用Agilent 1100电化学检测系统，检测主要单胺类神经递质及其代谢产物（NE、5-HT、5-HIAA）的量。测定条件[14]：色谱柱为Waters Symmetry C18柱（150 mm×3.9 mm，5μm）；流动相为乙腈-甲醇-水（3:19:78）；柱温35℃；体积流量为1.0 mL/min；进样量为10μL；检测器电压为0.7 V，参比电极为Ag/AgCl。
2.5 统计学分析实验数据以表示，使用SPSS 18.5软件进行数据统计分析。组间比较使用单因素方差分析（One-Way ANOVA）。
3 结果 3.1 海马组织中神经递质及其代谢产物水平与对照组比较，模型组海马组织中NE和5-HT水平明显下降，5-HIAA水平明显升高，差异显著（P＜0.01）；与模型组比较，阳性药组海马组织中NE和5-HT水平明显升高，5-HIAA的水平明显下降，差异显著（P＜0.01）；与模型组比较，柴胡白芍药对高、中剂量组海马组织中NE和5-HT水平明显升高，柴胡白芍药对低剂量组海马组织中NE的水平明显升高，柴胡白芍药对各剂量组海马组织中5-HIAA水平均明显下降，差异显著（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，柴胡高、中剂量组海马组织中NE和5-HT水平明显升高，柴胡高剂量组海马组织中5-HIAA的水平明显下降，差异显著（P＜0.05）；与模型组比较，白芍高剂量组海马组织中NE和5-HT水平明显升高，5-HIAA的水平明显下降，白芍中剂量组海马组织中5-HT水平明显升高，差异显著（P＜0.05）；模型组5-HIAA/5-HT比值明显高于对照组及各给药组，差异显著（P＜0.01）。结果见表 1。
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表 1 柴胡白芍药对对CUMS大鼠海马组织中神经递质及其代谢产物的影响(x±s, n=4) Table 1 Effect of herb pair of Bupleuri Radix and Paeoniae Alba Radix on neurotransmitters in hippocampal tissue of CUMS rats and their metabolites (x±s, n=4) |
3.2 皮质组织中神经递质及其代谢产物水平
与对照组比较，模型组皮质组织中NE和5-HT水平明显下降，5-HIAA水平明显升高，差异显著（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，阳性药组皮质组织中NE和5-HT的水平明显升高，5-HIAA的水平明显下降，差异显著（P＜0.01）；与模型组比较，柴胡白芍药对高、中剂量组皮质组织中NE和5-HT水平均明显升高，柴胡白芍药对低剂量组皮质组织中5-HT水平均明显升高，柴胡白芍药对各剂量组皮质组织中5-HIAA水平均明显下降，差异显著（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，柴胡高剂量组皮质组织中NE和5-HT的水平明显升高，柴胡中剂量组皮质组织中NE水平明显升高，差异显著（P＜0.05）；与模型组比较，白芍中剂量组皮质组织中NE和5-HT水平明显升高，白芍高、中剂量组皮质组织中5-HIAA的水平均明显降低，差异显著（P＜0.05）；模型组5-HIAA/5-HT比值明显高于对照组及各给药组，差异显著（P＜0.01）。结果见表 2。
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表 2 柴胡白芍药对对CUMS大鼠皮质中神经递质及其代谢产物的影响(x±s, n=4) Table 2 Effect of herb pair of Bupleuri Radix and Paeoniae Alba Radix on neurotransmitters in cortex tissue of CUMS rats and their metabolites (x±s, n=4) |
3.3 下丘脑组织中神经递质及其代谢产物水平
与对照组比较，模型组NE和5-HT水平明显下降，5-HIAA水平明显升高，差异显著（P＜0.01）；与模型组比较，阳性药组下丘脑组织中NE和5-HT水平明显升高，5-HIAA的水平明显降低，差异显著（P＜0.01）；与模型组比较，柴胡白芍药对各剂量组下丘脑组织中NE和5-HT水平明显升高，5-HIAA的水平明显降低，差异显著（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，柴胡高剂量组下丘脑组织中NE和5-HT的水平明显升高，柴胡中剂量组下丘脑组织中NE的水平明显升高，柴胡高剂量组下丘脑组织中5-HIAA的水平明显降低，差异显著（P＜0.05）；与模型组比较，白芍高剂量组下丘脑组织中NE和5-HT水平明显升高，白芍中剂量组下丘脑组织中5-HT的水平明显升高，白芍中剂量组下丘脑组织中5-HIAA的水平明显降低，差异显著（P＜0.05）；模型组5-HIAA/5-HT比值高于对照组及柴胡白芍药对低、中剂量组，差异显著（P＜0.05）。结果见表 3。
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表 3 柴胡白芍药对对CUMS大鼠下丘脑中神经递质及其代谢产物的影响(x±s, n=4) Table 3 Effect of herb pair of Bupleuri Radix and Paeoniae Alba Radix on neurotransmitters in hypothalamus tissue of CUMS rats and their metabolites (x±s, n=4) |
4 讨论
中医学本没有抑郁症一词，根据其临床表现可归于郁证、脏躁、百合病、奔豚、梅核气等疾病范畴。中医学认为，抑郁症的主要致病原因是情志因素。抑郁症主要是心、肝、脾3脏受累及气血失调而致。心神失常、肝失疏泄、脾失运化、脏腑阴阳气血失调是抑郁症总的发病机制。柴胡白芍药对出自《太平惠民和剂局方》，是柴胡疏肝散、逍遥散、四逆散等众多疏肝解郁组方的主要配伍药对。柴胡味苦、辛，性微寒，功善疏肝解郁、升阳举陷、宣畅气血、透表泄热。白芍味苦、酸，性微寒，功善养血敛阴、平抑肝阳、柔肝止痛。白芍之酸，柴胡之辛散，二药伍用[15]，一散一收，相互制约，又相互依赖，引药直达少阳之经，而有疏肝解郁、升阳敛阴、和解表里、柔肝止痛之效。单用柴胡、白芍及提取物抗抑郁研究较多[16-17]，有关研究显示，柴胡白芍药对不仅具有抗惊厥作用[18]，而且具有镇痛[19]和调节精液[20]作用，目前柴胡白芍药对抗抑郁研究较少。
抑郁症是环境、心理和遗传等多种因素交互作用所致的人类精神情感性疾病，关于发病机制至今尚未完全阐明。传统的“单胺递质假说”认为，抑郁的发生主要与单胺类神经递质如NE、5-HT水平低下有关[16]，主要表现在体内和脑内的中枢神经系统突触间隙水平降低或是功能减退。因而单胺类神经递质成为大多传统抗抑郁药物研究治疗作用的靶点，通过直接或间接增加突触间隙中的NE和5-HT而发挥作用。近年来，抑郁症单胺假说的研究逐渐由突触水平向受体水平不断深入。研究表明[21]，长期建立CUMS大鼠抑郁模型中大鼠所呈现的行为，与临床人类抑郁症表现出的一系列情绪行为改变有一定程度的相似性。海马、下丘脑、皮质是大脑组织中情感反应的高级中枢，也是脑组织中NE、5-HT等单胺类神经递质的主要来源。而脑组织中NE、5-HT水平的变化与抑郁情感障碍的发生密切相关，并且NE、5-HT水平低下在抑郁症的发生发展过程中起重要的作用[22]。有关研究显示，在建立CUMS模型中发现[23]，大鼠抑郁模型组中NE、5-HT水平明显降低。5-HT的代谢终产物5-HIAA也能间接反映5-HT水平变化，故本实验中同时检测下丘脑、海马和皮质中的5-HT及其代谢终产物5-HIAA的水平来研究柴胡白芍药对对CUMS大鼠的影响。
本研究在柴胡白芍药对抗抑郁的药效学基础上，进一步采用HPLC法测定了CUMS模型中大鼠脑内海马组织、皮质组织和下丘脑组织的单胺类神经递质（NE、5-HT、5-HIAA）水平。结果表明，柴胡白芍药对可以通过逆转NE和5-HT的减少并且降低5-HIAA的水平达到抗抑郁的作用；单用柴胡组和单用白芍组其中个别剂量组也可以不同程度地逆转NE和5-HT的减少和降低5-HIAA的水平。说明单用柴胡或者单用白芍也可以通过调节脑内单胺类神经递质的水平达到抗抑郁的作用，但不及柴胡白芍药对联用抗抑郁效果明显。本实验通过观察大鼠脑内单胺类神经递质的水平变化揭示了柴胡白芍药对抗抑郁的作用机制，也为柴胡白芍药对更多地应用于临床治疗抑郁症提供了依据。
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