血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是一种能特异作用于血管内皮细胞的生长因子，是一种促血管生成活性的功能性蛋白。有研究表明，实体瘤的进展取决于血管生成，而VEGF为关键的促血管生成因子，其基因包括8个外显子、7个内含子和若干单核苷酸多态性，这些因子使VEGF在肿瘤细胞的诱导分化中起重要作用；阻断VEGF可使血管网恢复，并抑制肿瘤生长^[1-2]。血管内皮抑素（endostatin，ES）采自胶原蛋白的非胶原域，是一种内源性血管生成抑制因子，可特异性地作用于新生微血管的内皮细胞，具有抗肿瘤作用^[3-4]。健脾消癌方是湖南省名中医蒋益兰教授的经验方，本项目组前期临床研究表明^[5]，健脾消癌方可有效拮抗大肠癌术后复发，提高生存质量，有效延长生存期；实验研究^[6]表明健脾消癌方可有效延长裸鼠生存期，增加其体质量，降低VEGF、VEGF受体（VEGFR-2）蛋白表达量。本研究在前期研究基础上，进一步观察健脾消癌方对结直肠癌转移模型裸鼠各组织中VEGF和ES mRNA表达的影响，探讨健脾消癌方抗结直肠癌癌转移的血管生成调节作用。

SPF级BALB/c-nu裸鼠60只，雌性，4～6周龄，购自湖南斯莱克实验动物有限公司，合格证号43004700012242，许可证号SCXK（湘）2011-0003。人结肠癌细胞株HCT116购买于中国科学院细胞库，编号TCHu 99。

健脾消癌方由党参、白术、茯苓、法半夏、黄芪、灵芝、炒枳壳、薏苡仁、仙灵脾、郁金、莪术、白花蛇舌草、半枝莲、重楼、甘草组成。上述药物按《中国药典》2010年版标准规格采购，购自湖南省中医药研究院附属医院中药房。取以上15味中药，5倍量处方，提取2次，第1次加8倍量水浸泡0.5 h，加热煎煮1 h，滤过；第2次加6倍水，煎煮1 h，滤过；合并滤液，静置24 h，离心，上清液减压浓缩至约850 mL，冰箱内冷藏48 h。将冷藏液离心，上清液滤过，得药液约800 mL，灭菌。制成每毫升含2.1 g生药的水煎液，密封后，4℃保存备用。5-氟尿嘧啶（5-FU），上海旭东海普药业有限公司生产，批号FA130908。

逆转录试剂盒，Fermentas；Trizol，Invitrogen；Taq酶，Genstar；引物，上海生工生物工程有限公司；DEPC，Sigma；DL2000 DNA Marker，Genstar；dNTP，Genstar；EB，Sigma；SYBGREEN PCR Mix，ABI。

荧光定量RCP仪，Thermo；恒温水浴箱，Thermo；J-MAX旋涡混合器，其林贝尔仪器制造有限公司；电泳仪，北京六一生物科技有限公司；电动匀浆器，宁波新芝生物科技股份有限公司。

按文献方法^[7]，于无菌环境下用2.5%戊巴比妥钠ip麻醉裸鼠，左下腹切开约2.5 cm切口，暴露盲肠。用微量注射器将50μL HCT116细胞（浓度约4×10⁷/mL）注入盲肠浆膜和肌层之间，用3%碘酒清洁注射区域，缝合腹壁。接种细胞15～20 d，可见裸鼠腹部有小肿块，表明肿瘤形成，开始向淋巴、肝、肺转移。

裸鼠购进后，适应性饲养3 d后随机抽取8只作为对照组。取32只造模成功且存活的裸鼠按照随机数字表随机分为4组，即健脾消癌方高、低剂量组，5-FU阳性对照组及模型组。按照人体体表面积与小鼠体表面积比例换算，健脾消癌方低、高剂量组裸鼠分别ig 10、40 g/kg（相当于临床等效剂量的1、4倍）健脾消癌方水煎液，每天1次；5-FU组ip 0.13 g/kg 5-FU，隔3 d给药1次；模型组及对照组ig生理盐水，连续给药4周。末次给药2 h后处死动物，即刻打开腹腔，取肝、肺（有转移结节者以结节为中心取材）、结肠及盲肠肿瘤组织约0.5 g，液氮冷冻。

采用qRT-PCR测定组织中WEGF和ES的mRNA表达。取约0.1 g组织在液氮下研磨碎，用1 mL Trizol提取组织总RNA，紫外分光光度计测定浓度。用1%变性琼脂糖凝胶，0.2 g琼脂糖，0.5μL EB（10 mg/mL），混匀制胶；取2μL提取的RNA，按1:5的比例与loading buffer premix混匀，170 V恒压电泳，溴酚蓝前沿迁移至凝胶总长2/3处停止电泳；凝胶成像系统下观察。以组织总mRNA为模板，逆转录cDNA。β-actin引物序列F：5’-CATCCTGCGTCTGGACCTGG-3’，R：5’-TAAT-GTCACGCACGATTTCC-3’；VEGF引物序列F：5’-TCGGAGAGCAACGTCACTATG-3’，R：5’-TTTAA-ACCGGGATTTCTTG-3’；ES引物序列F：5’-GCA-TCAAGGCCGAACATC-3’，R：5’-TCCAGTGCG-GGACCAAG-3’。实时定量PCR，SYBR法，定量PCR扩增程序：预变性，95℃、10 min；变性，95℃、10 s；40个循环。退火/延伸：VEGF，58℃、50 s；ES，60℃、50 s。

采用2^−ΔCt法计算目的基因mRNA转录水平，实验结果采用SPSS 17.0统计软件进行统计分析。实验结果以形式表示，两组间比较符合方差齐性者用t检验，不符合方差齐性者用t′检验。

与对照组比较，模型组裸鼠结肠、肝、肺和盲肠肿瘤组织的VEGF mRNA表达量明显升高（P＜0.05、0.01）。与模型组比较，健脾消癌方2组裸鼠结肠、肝、肺和盲肠肿瘤组织的VEGF mRNA表达量明显降低（P＜0.05、0.01）。4个部位以盲肠肿瘤组织中VEGF mRNA水平最低，结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 各组裸鼠不同组织中VEGF mRNA表达量的比较(x±s) Table 1 Comparison on mRNA expression level of VEGF in different tissues of nude mice in each group (x±s) 组别 剂量/(g·kg−1) 动物数/只 VEGF mRNA相对表达量(×10−3) 结肠 肝 肺 盲肠肿瘤 对照 — 8 1.66±0.74 1.93±0.97 1.75±0.82 0.97±0.49 模型 — 8 5.38±1.80** 4.80±1.42** 5.08±1.30** 4.96±1.43** 健脾消癌方 40 7 2.71±0.96## 2.30±0.91## 3.23±1.01## 1.73±0.90## 10 8 3.11±1.19 2.86±1.15## 3.26±1.15# 2.11±0.97## 5-FU 0.13 8 6.14±2.04 5.02±1.23 4.62±1.24 3.85±1.34 与对照组比较：*P＜0.05 **P＜0.01；与模型组比较：#P＜0.05 ##P＜0.01，下同 *P < 0.05 **P < 0.01 vs control group; #P < 0.05 ##P < 0.01 vs model group, same as below

表 1 各组裸鼠不同组织中VEGF mRNA表达量的比较(x±s) Table 1 Comparison on mRNA expression level of VEGF in different tissues of nude mice in each group (x±s)

与对照组比较，模型组裸鼠结肠、肝、肺及盲肠肿瘤组织的ES mRNA表达量显著降低（P＜0.05、0.01）；与模型组比较，健脾消癌方2组裸鼠结肠、肝、肺和盲肠肿瘤组织的ES mRNA表达量显著升高（P＜0.01）；4个组织中ES mRNA表达水平基本相当，结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 各组裸鼠不同组织中ES mRNA表达量的比较(x±s) Table 2 Comparison on mRNA expression level of ES in different tissues of nude mice in each group (x±s) 组别 剂量/(g·kg−1) 动物数/只 ES mRNA相对表达量(×10−3) 结肠 肝 肺 盲肠肿瘤 对照 — 8 6.31±1.40 6.25±1.35 6.90±1.34 5.75±1.16 模型 — 8 4.32±1.30* 4.04±1.23** 3.78±1.22** 2.64±0.89** 健脾消癌方 40 7 6.63±1.48## 7.59±1.40## 7.48±1.36## 5.98±1.50## 10 8 5.56±1.35 7.46±1.36## 7.21±1.37## 6.75±1.41## 5-FU 0.13 8 2.42±0.86 2.73±0.78 2.77±0.81 2.11±0.71

表 2 各组裸鼠不同组织中ES mRNA表达量的比较(x±s) Table 2 Comparison on mRNA expression level of ES in different tissues of nude mice in each group (x±s)

血管形成受血管生成因子与抗血管生成因子所调控。在肿瘤的形成或伤口愈合时，血管生成因子占主导，血管内皮细胞被激活，血管扩张和通透性增加，血管内皮细胞增殖、迁移和成管^[3]。研究表明，结直肠癌转移患者采用VEGF抑制剂靶向治疗取得良好的临床疗效，然而，但有些患者很快耐药或无效，其原因是患者处于高脂肪合成高氧化磷酸化状态和存在丝氨酸合成信号^[8]。

来源于胶原蛋白的ES具有血管生成和血管内皮细胞自噬调节剂双重活性，可能成为治疗癌症的新靶点，人工重组ES（恩度）已取得较好的治疗效果^[9]。然而，一些癌症包括结直肠癌，其血液中ES浓度升高，尽管有研究证明，ES水平升高可能是由于结直肠癌浸润肠道壁致使肌层胶原蛋白XVⅢ降解增加，但肿瘤组织中ES未见升高^[10]。但这种情况往往使临床治疗非常困难。

中医认为，大肠癌发病的根本原因是先天不足，正气亏虚；六淫邪毒、情志郁结、饮食内伤等。本课题组认为结直肠癌术后转移患者以脾胃亏虚、气血不足、瘀毒未尽，“虚、瘀、毒”并存为其病机特点，须健脾益气，化瘀解毒，方为良策^[11]。健脾消癌方是蒋益兰教授治疗结直肠癌临床经验的总结，以健脾益气、化瘀解毒为治法，由人参、茯苓、薏苡仁、仙灵脾、白花蛇舌草、石见穿、莪术、郁金等组成。前期研究证实本方能缓解结直肠癌术后肝转移，临床配合化疗，结果表明其可有效延长患者生存期，降低复发转移率^[5]。

虽然癌症靶向药物针对性很强，但治疗面有限。中医药从整体出发，全面治疗，但作用机制复杂。本实验研究发现，健脾消癌方能降低结直肠癌转移裸鼠肠、肝、肺组织中VEGF表达，升高ES表达，提示可能通过调节二者mRNA表达水平，达到拮抗结直肠癌转移的作用。但转录水平的改变与蛋白表达有一定的差距，另外，血管生成的影响因子较多，需进行更深入的研究。值得注意的是本研究采用5-FU为阳性对照药，因其为细胞毒性药物，对血管生成影响甚微。故在以后的研究中宜选用更合适的阳性对照药物进行深入探讨。