仙灵骨葆胶囊（Xianling Gubao Capsule，XGC）是具有贵州特色的苗药，主要用于治疗老年骨质疏松的中药制剂^[1]，收载于《国家中成药标准汇编·骨伤科分册》，由淫羊藿、续断、补骨脂、丹参、知母和地黄6味中药组成，具有滋补肝肾、接骨续筋、强筋健骨的功效，可用于肝肾不足、瘀血阻络所致骨质疏松症的治疗^[2]。方中以淫羊藿补肾壮阳为君药，续断补肝肾、强筋骨、调血脉、续折伤，补骨脂温阳补肾共为臣药，目前文献多以淫羊藿苷、朝藿定C等进行定量研究并控制该制剂质量，或以川续断皂苷VI、补骨脂素等分别进行研究^[3-9]。为更有效控制该制剂质量，本实验采用多波长HPLC法同时测定3种有效成分川续断皂苷VI、补骨脂素及异补骨脂素，该方法操作简便、分离度良好，为该品种质量标准提高提供参考。

安捷伦1200型高效液相色谱仪，包括VWD、DAD，美国Agilent公司；XS105Du十万分之一电子天平，Mettler Toledo仪器有限公司；DS-350L超声波萃取仪，福州德森精工有限公司；密里博DQ5超纯水制水机，Merck Millipore公司。

甲醇，分析纯，国药集团化学试剂有限公司；超纯水自制；乙腈，色谱纯，默克公司。川续断皂苷VI（批号111685-200802，以质量分数92.5%计）、补骨脂素（批号110739-201115，以质量分数99.3%计）、异补骨脂素（批号110738-201012，以质量分数100%计），均由中国食品药品检定研究院提供。仙灵骨葆胶囊，批号1505028、1406053、1504051、1505024、1407016，贵州同济堂制药有限公司。

色谱柱为月旭Ultimate^® XB-C₁₈柱（250 mm×4.5 mm，5μm）；流动相为乙腈-水，梯度洗脱：0～30 min，5%～60%乙腈；30～35 min，60%～80%乙腈；35～40 min，80%乙腈；40～45 min，80%～5%乙腈；检测波长：0～23 min，212 nm；24～45 min，246 nm；体积流量1.0 mL/min；柱温25℃。按上述色谱条件，各指标成分分离度均大于1.5，按川续断皂苷VI峰计算理论塔板数不低于5 000。

精密称取川续断皂苷VI 15.58 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得A贮备液；补骨脂素13.55 mg、异补骨脂素16.60 mg，置同一50 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，得B贮备液。再精密量取A贮备液5 mL、B贮备液1 mL，置同一25 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

取供试品内容物约1 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，超声处理（功率140 W，频率42 kHz）45 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

按处方比例及制法制备不含续断及补骨脂的粉末，按“2.3”项方法提取，制备阴性对照溶液，按上述色谱条件测定。结果阴性对照分别在川续断皂苷VI、补骨脂素及异补骨脂素相应的保留时间无干扰，见图 1。

图 1 对照品(A)、仙灵骨葆胶囊样品(B)和阴性对照(C) HPLC图 Fig.1 HPLC of reference substances (A), XGC samples (B), and negative control (C)

分别精密吸取混合对照品溶液0.5、1、2、5、10、20μL，按上述色谱条件进样测定，以峰面积为纵坐标（Y），以各指标成分的进样量为横坐标（X）绘制回归曲线，得回归方程分别为川续断皂苷VI Y=209.6 X+4.250，r=0.999 6；补骨脂素Y=8 979.6 X+13.92，r=0.998 0；异补骨脂素Y=8 403.5 X+3.068，r=0.998 5；结果表明川续断皂苷VI进样量在144.1～5 764.0 ng、补骨脂素在5.4～215.2 ng、异补骨脂素在6.6～265.6 ng与峰面积呈良好线性关系。

精密吸取对照品溶液5μL，连续进样6次，按“2.1”项色谱条件分别计算峰面积的RSD，结果续断皂苷VI的RSD为0.92%、补骨脂素的RSD为1.05%、异补骨脂素的RSD为0.99%，表明其进样精密度良好。

取同一样品（批号为1505028），按“2.3”项下方法制备，室温下放置，分别在0、2、4、8、12、16、24 h测定，结果川续断皂苷VI、补骨脂素及异补骨脂素的RSD分别为1.29%、1.65%、1.94%，结果表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

称取同一样品（批号为1505028）6份，按“2.3”项下方法同法制备成供试品溶液，按“2.1”项色谱条件测定，结果川续断皂苷VI、补骨脂素及异补骨脂素的RSD分别为1.87%、2.05%、2.14%，表明该方法重复性良好。

精密称取已测定的同批号样品（批号为1505028）9份，每份约0.5 g，分别加入A贮备液1、3、5 mL，B贮备液1、2、3 mL，再精密加入甲醇50 mL，按“2.3”项下方法制备测定溶液，按“2.1”项色谱条件测定，结果川续断皂苷VI、补骨脂素及异补骨脂素平均回收率分别为98.11%、97.86%、98.22%，RSD分别为1.29%、0.93%、1.07%。

取各批次样品，按“2.3”项下方法制备样品溶液，重复3次，进行测定，结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 样品测定结果(n=3) Table 1 Determination of samples (n=3) 样品批号 质量分数/(mg·g−1) 川续断皂苷VI 补骨脂素 异补骨脂素 1505028 8.62 0.63 0.69 1406053 7.16 0.89 0.93 1504051 9.31 0.76 0.78 1505024 8.26 0.81 0.93 1407016 8.94 0.79 0.86

表 1 样品测定结果(n=3) Table 1 Determination of samples (n=3)

流动相曾选择甲醇-0.5%磷酸、乙腈-0.5%磷酸、乙腈-水、甲醇-水等系统进行不同梯度洗脱实验，由于处方中丹参酮类等强保留成分的干扰影响，以及考虑指标峰的保留时间、峰形、分离度等因素，选择了本实验中乙腈-水系统进行梯度洗脱，并在30 min后增加乙腈至80%进行洗脱，在此条件下各检测指标成分分离度、峰形良好，45 min后基本无其他杂峰，能为川续断皂苷VI、补骨脂素及异补骨脂素的定性、定量提供较好的色谱条件。

取上述对照品溶液在400～200 nm进行扫描，结果检测波长川续断皂苷VI在212 nm、补骨脂素及异补骨脂素在246 nm处有最大吸收。另按“2.1”项色谱条件川续断皂苷VI峰的保留时间在21.7 min，补骨脂素及异补骨脂素峰保留时间分别为25.9、26.5 min，故选择23 min变换检测波长为246 nm。采用了Zorbax SB-C₁₈柱、岛津ODS-VP C₁₈、菲罗门Luna-C₁₈柱进行实验，结果各指标峰分离度均符合HPLC要求，变换波长的时间为川续断皂苷VI峰的保留时间加1 min即可顺利进行实验。

根据检测指标成分溶解性并参照文献方法^[2-6]选择稀乙醇、65%甲醇、甲醇等进行超声处理，并考察了不同时间及不同溶剂体积的提取效果，表明采用甲醇50 mL超声处理45 min的提取效果最佳。

续断、补骨脂为温阳补肾、强筋健骨的要药，在仙灵骨葆胶囊处方中起到滋补肝肾、接骨续筋、强筋健骨的作用，文献报道的多指标成分研究^[7]也是2个系统分别控制续断及补骨脂的检测方法，为了提高效率、节约能源，本研究用一个系统对多指标成分进行测定，即能显著地提高效率，又可减少有机溶剂的使用，为更好地控制其质量提供参考，今后将进一步研究一测多评法，节约对照品，更好地节约能源。