甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.为豆科（Leguminosae）甘草属Glycyrrhiza L.多年生草本植物，是中国传统大宗补益中草药，药用部位是根及根茎。甘草具有祛痰止咳、清热解毒、抗癌和免疫调节等诸多功能，已被列入多国药典（《中国药典》2010年版、《日本药典》JP16、《美国药典》USP34和《欧洲药典》Ph.Eur.7）^[1]。甘草主要分布于新疆、宁夏、内蒙古和甘肃等省区的干旱、半干旱的荒漠草原、沙漠边缘和黄土丘陵地带，根系发达，耐逆性强，具有防风固沙的功能，对于我国西北部荒漠地区生态环境的保护和改善具有重要意义^[2]。

microRNA（miRNA）是一类在真核生物中发现的长度约为21 nt的单链非编码小分子RNA。最早发现的miRNA是秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans的lin-4和let-7^[3-4]。miRNA的成熟形式主要在细胞质中通过与靶基因的碱基互补配对，进而介导靶基因的降解或翻译抑制，在转录后水平对基因表达进行调控^[5]。在植物中，miRNA通过负调控转录因子和其他重要的功能基因，广泛参与植物器官的生长发育、形态建成、逆境胁迫应答和次生代谢调控^[6]。

目前已经鉴定了超过72种植物的7 385种miRNA，在每种植物中发现的miRNA种类数介于几十个到几百个之间^[7]。整体说来，对于拟南芥、水稻、毛果杨等模式植物的miRNA研究较多，对于中草药等植物的研究相对较少。中草药在中国传统医药中具有重要地位。miRNA在植物体内发挥重要的调控作用，参与植物环境逆境应答以及次生代谢产物的生物合成，研究药用植物miRNA的生物学功能对于理解药用成分形成和积累的生态调控机制，培育高产优质的中药材具有重要意义。近年来，对药用植物miRNA的研究正在迅速开展起来，研究人员利用高通量测序、miRNA芯片、生物信息分析等方法研究了人参、毛地黄、半夏、千里光等中草药的miRNA^[8-9]。但迄今为止，未见甘草miRNA的相关研究。本研究拟应用生物信息学工具，基于甘草转录本序列鉴定miRNA，并确定其靶基因，为进一步研究miRNA在甘草逆境应答和次生代谢途径调控中的作用奠定基础。

甘草种子来自内蒙古自治区鄂尔多斯市，经中央民族大学生命与环境科学学院刘博博士鉴定为甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的根及根茎。

Trizol试剂购自美国英杰生命技术有限公司（Invitrogen），逆转录试剂和荧光定量PCR试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。其余试剂均为分析纯。

在NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）下载甘草的高通量测序数据和EST序列。高通量数据登录号为DRR006519、DRR006520、DRR006521、DRR006522、DRR006523、DRR006524、DRR006525和DRR006526。表达序列标签（EST）数据有55 942条。数据过滤软件使用Trimmomatic（http://www.usadellab.org/cms/index.php?page＝trimmomatic）^[10]和solexaQA（http://solexaqa.sourceforge.net/）^[11]。拼接软件使用Trinity（http://trinityrnaseq.github.io/）^[12]和iAssembler（v1.3.2，http://bioinfo.bti.cornell.edu/tool/iAssembler/）^[13]，拼接采用默认参数进行。聚类去冗余软件使用CD-HIT（http://weizhong-lab.ucsd.edu/cd-hit/）^[14]。

整体预测流程参考文献方法^[15]进行。简言之，首先从植物miRNA数据库（http://bioinformatics.c au.edu.cn/PMRD）中下载10 898个植物来源的miRNA茎环结构前体，去除不同物种miRNA之间的重复序列以及不可靠的数据后，剩余的4 835条miRNA前体序列作为预测甘草miRNA前体的参照序列与拼接得到的甘草转录本序列进行同源比对分析（Blastn），筛选出E＜1e-6的转录本序列。这些转录本序列去除冗余后，用Mfold软件（http://mfold.rna.albany.edu/q＝mfold/RNA-Folding-Form）^[16]进行折叠，预测候选miRNA前体序列的二级结构，分析是否有miRNA成熟形式存在茎环结构上茎的部分，评价茎环结构的稳定性。miRNA前体的二级结构筛选标准参照Zhang等^[17]的方法。

基于甘草的主要药用部位是根茎，选取培养了8周的甘草幼苗根部，用Trizol法提取根中的总RNA，并分别用Nano Drop^TM2000分光光度计、琼脂糖凝胶电泳验证总RNA的纯度、浓度、完整性。

随机选取生物信息学预测中的12条miRNA，并分别设计逆转录茎环引物及荧光定量PCR引物（表 1），利用stem-loop荧光定量PCR验证miRNA。

表 1(Table 1)

表 1 待验证的miRNAs及其对应引物 Table 1 Selected miRNAs and their corresponding primers miRNAs miRNA序列(5′-3′) 逆转录引物(5′-3′) 正向引物(5′-3′) 反向引物(5′-3′) gur-miR159e-3p UUUGGAUUGAAGG GAGCUCUA GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGG TATTCGCACCAGAGCCAACAGAGCT GTGGGTTTGGAT TGAAGGG GTGCAGGGTCCG AGGT gur-miR390-5p AAGCUCAGGAGGG AUAGCG GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGG TATTCGCACCAGAGCCAACGGCGCT GTTGAAGCTCAG GAGGGAT GTGCAGGGTCCG AGGT gur-miR393b-5p UCCAAAGGGAUCG CAUUGAUC GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGG TATTCGCACCAGAGCCAACAATCAA GTGTTCCAAAGG GATCGCA GTGCAGGGTCCG AGGT gur-miR482a-3p UUCCCAAAGCCGC CCAUUCCGA GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGG TATTCGCACCAGAGCCAACTCGGAA TTGTTCCCAAAG CCGCCC GTGCAGGGTCCG AGGT gur-miR164a-5p UGGAGAAGCAGGG CACGUGCA GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGG TATTCGCACCAGAGCCAACTGCACG GTTTTGGAGAAG CAGGGCA GTGCAGGGTCCG AGGT gur-miR396i-5p UUCCACAGCUUUC UUGAACUG GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGG TATTCGCACCAGAGCCAACCAGTTC GGGGTTCCACAG CTTTCTT GTGCAGGGTCCG AGGT gur-miR156b-5p UUGACAGAAGAUA GAGAGCAC GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG TATTCGCACTGGATACGACGTGCTC CCGCGTTGACAG AAGATAGAGA CAGTGCAGGGTC CGAGGTA gur-miR394b-5p UUUGGAUUGAAGG GAGCUCAA GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGG TATTCGCACCAGAGCCAACGGAGGT GTTGGTTGGCATT CTGTCC GTGCAGGGTCCG AGGT gur-miR166g-3p UCGGACCAGGCUU CAUUCCCC GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG TATTCGCACTGGATACGACGGGGAA CGGTCGGACCAG GCTTCATT CCAGTGCAGGGT CCGAGGTATTC gur-miR167b-5p UGAAGCUGCCAGC AUGAUCUGA GCGTGGTCCACACCACCTGAGCCGC CACGACCACGCTCAGATCA GAGCCGTGAAGC TGCCAG TCCACACCACCT GAGCCG gur-miR168a-5p UCGCUUGGUGCAG GUCGGGAA CTCAGCGGCTGTCGTGGACTGGGTG CTGCCGCTGAGTTCCCGACTTCCCG CGGTGTGTCGCT TGGTGC GGCTGTCGTGGA CCTGGGTG gur-miR2118-3p UUGCCGAUUCCAC CCAUUCCU GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGG TATTCGCACTGGATACGACTAGGAA AAGGCGTTTCCG ATTCCA CAGTGCAGGGTC CGAGGTAT

表 1 待验证的miRNAs及其对应引物 Table 1 Selected miRNAs and their corresponding primers

将全部靶基因序列比对到拟南芥蛋白数据，用拟南芥蛋白注释靶基因，以了解靶基因的生物学功能，截取标准为E＜1e-5。使用agriGO（ http://bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/analysis.php）中的GO分析工具对靶基因进行功能分类和富集分析。

首先用Trimmomatic软件对Illumina HiSeq2000测序所得数据进行滤过；用solexaQA对EST数据进行滤过，获得去除测序接头、去除低质量数据、去除冗余序列的可用于拼接的数据。然后分别用Trinity和iAssembler混合拼接Illumina Heseq 2000和EST数据。最后将上述2部分拼接好的数据用CD-HIT合并聚类。

本研究拼接获得的unigene的平均长度为896 bp，略小于Ramilowski等^[18]的拼接结果，但远大于Li等^[19]的拼接结果。本研究的unigene的N50（1 493 bp）和拼接总长度（67 122 825 bp）明显大于其他2个拼接结果。总的来看，本研究获得的转录本数据覆盖度最高，质量较好，可以用于miRNA的生物信息学预测等分析。

以已知植物miRNA前体序列为探针与拼接获得的88 263条甘草转录本序列进行BLASTN比对分析，筛选出685条候选miRNA前体序列。去除其中的蛋白编码基因后，进一步对这些转录本进行手动筛选，确定了其中能够用Mfold软件折叠形成稳定的茎环结构，并符合相应筛选标准的核酸序列共50条，代表 30个茎环前体序列（表 2和图 1）。在这些前体序列上分布着分属于17个不同家族的49个miRNA的成熟序列（表 3）。其中，家族成员最多的是miR156家族，有8个成员；其次为miR159家族，有7个成员。

表 2(Table 2)

表 2 甘草中新发现的miRNA前体 Table 2 Precursors of miRNA newly discovered from G. uralensis 名称 茎环前体序列 前体同源物 E值 MFE/(kcal·mol-1) MFEI gur-MIR156a gagagacUGACAGAAGAGAGUGAGCACAugcugcuagugauuguaugaa ggguauacaauugcgggugcguGCUCACUUCUCUUUCUGUCAGCuucuc gma-MIR156a 2×10-25 52.80 1.12 gur-MIR156b ggugaugcugUUGACAGAAGAUAGAGAGCACagaugaugaaaugcauga aagggaauggcaucucacuccuuuguGCUCUCUAUACUUCUGUCAUCacc gma-MIR156e 1×10-35 47.90 1.09 gur-MIR156a ggugaugcugCUGACAGAAGAUAGAGAGCACagaugaugaaaugcauga aagggaauggcaucuuacuccuuuGUGCUCUCUAUUCUUCUGUCAucacc gma-MIR156e 2×10-34 45.70 1.04 gur-MIR156g uugggacauagaaauUGACAGAAGAGAGUGAGCACAcagaggcacucga uauagcuauauacuguugcuuuuguguGCUCACUUCUCUCUCUGUCACC uuccagugccuga tcc-MIR156g 1×10-29 55.50 1.11 gur-MIR159a uggagcucucuuuccuccauuucugaaacgaggugauaguagaccuuagcugcuaguuca uggauaccucuggcuucgcuagcaaauggaccauacuuaugcgaaggucaugggucugca ugaacuuggagaugagguuaaucaccuucaccguuuugguAUUGGAGUGAAGG GAGCUCCA gma-MIR159f 2×10-21 82.30 0.97 gur-MIR159e guuauggaguggagcuccuugaaguccaaacgaggauguugcuggguuugauagAGCU GCUGAGCUAUGGAUCCCauagugcuacccuuuaucaugugugguaguccugc ggcuuccauaucccgggagcuucauccccuuuugcucuuauccuucUUUGGAUUGA AGGGAGCUCUAcaccuuaau gma-MIR159e 4×10-37 83.50 0.93 gur-MIR162 ggaaggugaagucacUGGAGGCAGCGGUUCAUCGAUCucuuccugaguuu ggauguggaagaacacaaagcaugaaucggUCGAUAAACCUCUGCAUCCAG cgcucacuuugcc vun-MIR162 1×10-38 44.40 0.77 gur-MIR164k ggucuuguUGGAGAAGCAGGGCACGUGCAacacaucaagaucucucucaa acuaguaguuugucugauuuugcacgugcuccccuuuuccaacaugauu gma-MIR164k 3×10-12 43.30 0.96 gur-MIR164a guUGGAGAAGCAGGGCACGUGCAaauuauaaucuccugguucucucaaug ccauugaucaaugcuuUGCACGUGCUCCCCUUCUCCAac tcc-MIR164a 2×10-13 43.00 1.00 gur-MIR166g guugaggggaaugucgucugguucgagaucauucauaaauagucucaucucagguauaac ucuucacaugagugauuUCGGACCAGGCUUCAUUCCCCucagc gma-MIR166g 3×10-21 55.60 1.18 gur-MIR166e ggaagcuuuguuuuuugaggGGAAUGUUGUCUGGCUCGAGGacccuucu ccuugauccaguguauuaucccucucuauaguauguagagaguugaggaugugcugugua cuacuuguggucaaggaauguauaguguugUCGGACCAGGCUUCAUUCCCC ccaauuauaugcuucc csi-MIR166e 2×10-18 76.30 0.95 gur-MIR167b uaugcaccuucaguaguUGAAGCUGCCAGCAUGAUCUGAgcuuaccuaau ucuaauucuaauggugagaauagaucaugugguagcuucaccucuugaauguaagcaua lja-MIR167 3×10-23 49.80 1.16 gur-MIR167a ggucacaaaggaaaaagUGAAGCUGCCAGCAUGAUCUAgcuuugguuaga gagcgcugcgcuagcugaauaaggaguguuagcccugaauugaacccugacuaGGUCA UGCUGUGACAGCCUCACUccuuccuauuuggggacc lja-MIR167a 2×10-22 58.90 0.81 gur-MIR168a cgcggucucuaauUCGCUUGGUGCAGGUCGGGAAccgcuacugcugcgau uuucgcgcguaaugacggagcggucgccggcggugaauuggauCCCGCCUUGCAU CAACUGAAUcggaggccgcg gma-MIR168a 1×10-27 72.20 0.94 gur-MIR171c GAUAUUGGUGCGGUUCAAUCAgaaggcgguccuuuauaauccaaaaaagc ucuguguuauuUGAUUGAGCCGUGCCAAUAUC gma-MIR171c 3×10-25 39.10 1.15 gur-MIR171b agcaaGGUAUUGGCGCGUCUCAAUUUgaagacauggcuauuuaucaugag aauccagccauguaguuUGAUUGAGCCGCGUCAAUAUCuuguu lja-MIR171b 3×10-22 47.70 1.22 gur-MIR172 agucgcuguuugccgauGGAGCACCAUCAAGAUUCACAaguuuuugggu uuuuuuuuuugguuuuggggugguccccuaauugcugcuccaaaucuauuagcccuuug auaUGAGAAUCUUGAUGAUGCUGCAgcggcaauaaaugacu gma-MIR172e 1×10-28 62.20 1.22 gur-MIR2118 gagagagaaagggaaagggggaagagcuuggggaaguuaugGGAGAUGGGAGG UUCGGCAAAacagaucugaauccuucauacaaagauucuguauuucuUUGCCG AUUCCACCCAUUCCUAugauuuccucugguuccucucuuuccacucuccucuc mtr-MIR2118 5×10-34 79.00 1.07 gur-MIR319a ggauuuaauUAGCUGCCGACUCAUUCAUCCAaauguugagucaauuaag auccauacucaccaaaugcgugaaugaugcgggagacaaauugaaucu gma-MIR319a 9×10-23 30.70 0.81 gur-MIR319e gauugaaggggcucacuucaguccaguucgaggcgguggaagauggcugagcacagcugc ugacucguugguucgagagcucaccaugaauuagccucuuuaauuuggugugcuucugau ccaacgaugcgggagcugccacucagucguugcugucaugucuuggacugaaggggccucu ucauuc mes-MIR319e 3×10-22 101.90 1.03 gur-MIR390 aguaugggagaaucuguaAAGCUCAGGAGGGAUAGCGccauggauauugcu ucuccauuuugaugggauuuugcaauauuaauaucauuauucugaucuucucuauagCG CUAUCCAUCCUGAGUUUCauggguucuucauacu mes-MIR390 3×10-15 61.45 1.10 gur-MIR393b aggcaUCCAAAGGGAUCGCAUUGAUCCcaaaucucaguaccccuuaauuaa ucucucuguuuuucaccuuaauucccuuaauucucacaauauuugggAUCAUGCUAU CCCUUUGGAUUccu mtr-MIR393b 3×10-17 37.52 0.78 gur-MIR394b ucaugggggcuucacaaaggguagcuuacagaguuuuUUGGCAUUCUGUCCAC CUCCcucccucccuccacuucaauaauucauucccaaugucucuauagcucuguugcgcg ccgcguggAGGUGGGCAUACUGCCAACUcagcucucuuggcuucucuuugu aaagccuuccuga mdm-MIR394b 8×10-21 63.46 0.71 gur-MIR396i ggcccucuuuguauucUUCCACAGCUUUCUUGAACUGcauucaaagaguuc cuuugcaugcaugccauggcacucuugcucccaccacaccuuguuuugcaGUUCAAUA AAGCUGUGGGAAGauacagauaggguc gma-MIR396i 7×10-42 60.49 0.96 gur-MIR396g gucaugcuuUUCCACAGCUUUCUUGAACUUcuuauuaugcaucuuaaaagc ucucuacaggaucaauuaaaagcccuaggcuagcuacuagAAGCUCAAGAAAGCU GUGGGAgaauauggc gma-MIR396g 3×10-17 43.52 0.89 gur-MIR399a uaagcaaaucagcuaUAGGGCUUCUCUUUCUUGGcaggaaauuaucaugacca uuuccauggugugucuuGCCAAAGGAGAGUUGCCCUGuugcugcuuuagcu ua pvu-MIR399a 1×10-29 55.30 1.20 gur-MIR482a ggaaugggagauuggagcuaucagaaguugugGGAAUGGGCGGUUUGGGAA GAaaucaugaaauccuuaauuaauuucucuuuuuaguauuuuucUUCCCAAAGCC GCCCAUUCCGAugauuucuguugguuccucccuuucc mdm-MIR482a 2×10-18 73.50 1.23 gur-MIR482b gggaaugggagauuggagaauuuagaaguugugGGAAUGGGUUGGUUGGGA UGAaagauuuacuccaacaacaacauaacguuguguguguuuUCUUCCCAAUUC CGCCCAUUCCUAuuauuucuaauuucuccucccuuuccc mdm-MIR482a 1×10-20 69.30 1.16 gur-MIR1507b auguuugguAGAGGCGUAUGGAGUGAGAGAUuggaaagcucuuuccgauu ucuagucauuaaacuuucccucUUUCAUUCCAUAUGUCAUCUAAcgaacgu mtr-MIR1507 4×10-14 43.00 1.08 gur-MIR1507a auguuuggcagaggcauauggagugagagcuuagaaagcauuuuuccgauucuuugucauu gaaccuucccccUCUCGUUCCAUACGUCGUCUAAcgaacau gma-MIR1507a 1×10-13 30.40 0.67

表 2 甘草中新发现的miRNA前体 Table 2 Precursors of miRNA newly discovered from G. uralensis

图 1 部分miRNA前体的二级结构 Fig.1 econdary structures of some precursors of miRNA

表 3(Table 3)

表 3 甘草中新发现的miRNA Table 3 miRNAs newly discovered from G. uralensis 序号 家族 名称 序列 长度/nt 同源miRNA 与同源miRNA的差异碱基数 1 156 gur-miR156a-5p UGACAGAAGAGAGUGAGCACA 21 bna-miR156a 0 2 gur-miR156a-3p GCUCACUUCUCUUUCUGUCAGC 22 zma-miR156d-3p 0 3 gur-miR156b-5p UUGACAGAAGAUAGAGAGCAC 21 ath-miR157a-5p 0 4 gur-miR156b-3p GCUCUCUAUACUUCUGUCAUC 21 aly-miR157c-3p 1 5 gur-miR156e-5p CUGACAGAAGAUAGAGAGCAC 21 smo-miR156b 0 6 gur-miR156e-3p GUGCUCUCUAUUCUUCUGUCA 21 aly-miR157c-3p 3 7 gur-miR156g-5p UGACAGAAGAGAGUGAGCACA 21 bna-miR156a 0 8 gur-miR156g-3p GCUCACUUCUCUCUCUGUCACC 22 bdi-miR156b-3p 0 9 159 gur-miR159a-3p AUUGGAGUGAAGGGAGCUCCA 21 gma-miR159b-3p 0 10 gur-miR159e-3p UUUGGAUUGAAGGGAGCUCUA 21 ath-miR159a 0 11 gur-miR159e-5p AGCUGCUGAGCUAUGGAUCCC 21 gma-miR159d 1 12 162 gur-miR162-5p UGGAGGCAGCGGUUCAUCGAUC 22 csi-miR162-5p 0 13 gur-miR162-3p UCGAUAAACCUCUGCAUCCAG 21 ath-miR162a-3p 0 14 164 gur-miR164k-5p UGGAGAAGCAGGGCACGUGCA 21 ath-miR164a 0 15 gur-miR164a-5p UGGAGAAGCAGGGCACGUGCA 21 ath-miR164a 0 16 166 gur-miR166g-3p UCGGACCAGGCUUCAUUCCCC 21 pvu-miR166a 0 17 gur-miR166e-3p UCGGACCAGGCUUCAUUCCCC 21 pvu-miR166a 0 18 167 gur-miR167b-5p UGAAGCUGCCAGCAUGAUCUGA 22 ccl-miR167a 0 19 gur-miR167a-5p UGAAGCUGCCAGCAUGAUCUA 21 ath-miR167a-5p 0 20 gur-miR167a-3p GGUCAUGCUGUGACAGCCUCACU 23 aly-miR167b-3p 1 21 168 gur-miR168a-5p UCGCUUGGUGCAGGUCGGGAA 21 ath-miR168a-5p 0 22 171 gur-miR171c-5p AGAUAUUGGUGCGGUUCAAUC 21 gma-miR171c-5p 0 23 gur-miR171c-3p UGAUUGAGCCGUGCCAAUAUC 21 gma-miR171e 0 24 gur-miR171b-3p UGAUUGAGCCGCGUCAAUAUC 21 vvi-miR171b 0 25 172 gur-miR172e-3p UGAGAAUCUUGAUGAUGCUGCA 22 vvi-miR172d 0 26 2118 gur-miR2118-5p GGAGAUGGGAGGUUCGGCAAA 21 gma-miR2118a-5p 2 27 gur-miR2118-3p UUGCCGAUUCCACCCAUUCCU 21 gma-miR2118a-3p 0 28 159 gur-miR319a-5p UAGCUGCCGACUCAUUCAUCCA 22 ppe-miR319b 1 29 gur-miR319e-5p AGCUGCUGACUCGUUGGUUC 20 mtr-miR4414a-3p 0 30 gur-miR319e-3p AUCCAACGAUGCGGGAGCUGC 21 mtr-miR4414a-3p 0 31 gur-miR319b-3p UUGGACUGAAGGGGCCUCUU 20 gma-miR319f 0 32 390 gur-miR390-5p AAGCUCAGGAGGGAUAGCG 21 ath-miR390a-5p 0 33 gur-miR390-3p CGCUAUCCAUCCUGAGUUUCA 21 aly-miR390a-3p 0 34 393 gur-miR393b-5p UCCAAAGGGAUCGCAUUGAUC 21 mtr-miR393b-5p 0 35 gur-miR393b-3p AUCAUGCUAUCCCUUUGGAUU 21 mtr-miR393b-3p 0 36 394 gur-miR394b-5p UUGGCAUUCUGUCCACCUCC 20 gma-miR394c-5p 0 37 gur-miR394b-3p AGGUGGGCAUACUGCCAACU 20 gma-miR394b-3p 1 38 396 gur-miR396i-5p UUCCACAGCUUUCUUGAACUG 21 gma-miR396a-5p 0 39 gur-miR396i-3p GUUCAAUAAAGCUGUGGGAAG 21 gma-miR396i-3p 40 gur-miR396g-5p UUCCACAGCUUUCUUGAACUU 21 gma-miR396b-5p 0 41 gur-miR396g-3p AAGAAAGCUGUGGGAGAAUAUGGC 24 gma-miR396d 0 42 399 gur-miR399a-3p UGCCAAAGGAGAGUUGCCCUG 21 pvu-miR399a 0 43 482 gur-miR482a-5p GGGAAUGGGCGGUUUGGGAAGA 22 mdm-miR482a-5p 2 44 gur-miR482a-3p UUCCCAAAGCCGCCCAUUCCGA 21 mdm-miR482a-3p 3 45 gur-miR482b-5p GGGAAUGGGUUGGUUGGGAUGA 22 mdm-miR482a-5p 3 46 gur-miR482b-3p UCUUCCCAAUUCCGCCCAUUCCUA 24 gma-miR482a-3p 0 47 1507 gur-miR1507b-5p AGAGGCGUAUGGAGUGAGAGAU 22 mtr-miR1507-5p 5 48 gur-miR1507b-3p UUUCAUUCCAUAUGUCAUCUAA 22 mtr-miR1507-3p 4 49 gur-miR1507a-3p UCUCGUUCCAUACGUCGUCUAA 22 gma-miR1507a 3

表 3 甘草中新发现的miRNA Table 3 miRNAs newly discovered from G. uralensis

在甘草中预测到的49条成熟miRNA的长度范围为20～24 nt，其中21 nt长度的miRNA最多（31/49，63%），其次为22 nt的miRNA（11/49），其他长度的miRNA数量较少。预测的30个stem-loop前体的序列长度介于82～187 nt，这些前体都能折叠成稳定的二级结构，最小自由能MFE介于-101.9～-30.4 kcal/mol，最小自由能指数MFEI介于0.67～1.03（表 2）。

本实验考察了49个预测的甘草miRNA与其他植物来源的同源miRNA的序列相似性（表 3）。71%（35/49）的甘草miRNA与其他植物中对应miRNA的序列完全相同，10%（5/49）的甘草miRNA出现1个差异碱基，出现多于1个差异碱基的甘草miRNA共有8个，占16%。这说明本研究预测的miRNA多数为保守miRNA。还考察了31个预测的甘草miRNA前体与其他植物来源的miRNA前体的序列相似性（表 3）。发现所有前体与其他植物来源的miRNA前体都有程度不同的相似性，E值最大为3e-12，最小为7e-42。这一结果说明，与蛋白编码基因类似，同源miRNA的成熟形式和茎环结构前体在序列上也具有保守性。

为了确定生物信息学预测中的miRNA真实存在，本研究随机选取了12条新发现的miRNA，通过stem-loop qRT-PCR实验进行验证。实验结果显示，12条miRNA荧光定量扩增产物的熔解曲线均为单峰，将12条miRNA荧光定量PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，均出现明显单一条带，大小约60 bp，与荧光定量PCR扩增产物的实际大小一致（图 2），证明本研究通过生物信息学预测的miRNA在甘草中确实存在。

图 2 miRNA stem-loop qRT-PCR产物电泳图 Fig.2 Electrophoresis of miRNA stem-loop qRT-PCR products

根据预测的49条甘草miRNA序列以及拼接获得的转录本序列，通过在线软件psRNATarget对其靶基因进行了预测，共预测到32条甘草miRNA的273个靶基因，其中有172个靶基因可以用拟南芥蛋白序列进行注释。靶基因编码的蛋白具体包括以下几类：（1）转录因子，包括SBP类、myb类、GRAS类、bHLH类、NAC类、bZIP类、TCP类等转录因子；（2）激酶和磷酸酶，包括MAPKKK5、富含亮氨酸重复的蛋白激酶Leucine-rich repeat protein kinase、U-box domain-containing protein kinase、protein phosphatase 2CA等；（3）激素信号转导成员，包括ARF（生长素响应因子）、生长调节因子5（GRF5 | growth-regulating factor 5）、AFB2 | auxin signaling F-box 2等；（4）抗病蛋白，如NB-ARC domain-containing disease resistance protein、LRR and NB-ARC domains-containing disease resistance protein、Disease resistance protein（TIR-NBS-LRR class）family；（5）其他类别的酶等。GO分类和富集分析结果（图 3）表明被富集的生物学过程为DNA依赖的转录调控（GO：0006355）、器官发育（GO：0048513）和防御反应（GO：0006952）。被富集的分子功能包括转录因子活性（GO：0003700）和泛素蛋白连接酶活性（GO：0004842）。以上分析结果表明，甘草miRNA主要通过调控转录因子等靶基因参与基因转录调控、信号转导、胁迫应答、蛋白翻译后修饰等生物学过程。

图 3 甘草miRNA靶基因编码蛋白的GO分类情况 Fig.3 GO classification of predicted miRNA target genes in G. uralensis

与动物miRNA相比，植物miRNA的研究相对较晚。尽管如此，随着第二代测序技术的飞速发展，研究人员已从数十种植物中鉴定出少到几十个、多至几百个的miRNA，并对部分植物的miRNA进行了进一步的功能分析。这些研究表明miRNA广泛参与调控植物的生长发育、形态建成、次生代谢物生成、信号转导以及环境因子应答等^[20]。甘草作为我国传统大宗中草药，同时也是维持我国西北部干旱区域生态系统健康的重要植物^[1-2]，其次生代谢产物的调控、积累机制和干旱等逆境适应机制都与miRNA存在密切的内在联系，鉴定甘草miRNA、研究miRNA的生物学功能将促进对其相关分子机制的了解。

目前对于中草药等非模式植物的miRNA的鉴定主要依赖于转录组序列。转录组序列有两类来源：表达序列标签（EST）和高通量转录组测序数据。目前随着高通量测序费用的不断降低，对中草药植物进行的高通量转录组测序研究不断增加^[21]，为miRNA的鉴定提供了数据基础。miRNA鉴定的关键是找到miRNA的茎环结构前体，因此获得高覆盖度的转录本数据是鉴定miRNA前体的前提。在GenBank中的甘草核酸数据中，既有5万余条来自Sanger测序的EST序列，也有若干个高通量测序数据。为了获得高质量的转录本序列数据，应用Trinity等常用拼接软件，将不同来源的转录本数据拼接在一起，拼接得到的转录本数据覆盖度较好，这一高质量的转录本数据将有助于后续的miRNA的生物信息学鉴定和靶基因预测研究。

在miRNA的诸多鉴定方法中，生物信息学预测无须进行测序，简便快捷，因而得到较多的应用^{[15, 17, 22-23]}。在这些研究中，主要采用2种方法进行miRNA的生物信息学鉴定。第1种鉴定方法是，将相关物种的miRNA成熟形式比对到转录本上，允许3～4个碱基错配，然后取一定长度的侧翼序列（如200 nt），用mfold等RNA折叠软件进行分析^[17]。第2种方法是本研究采用的方法^[15]。这种做法与第一种方法的主要区别在于，比对到转录本序列上的是相关物种的已知miRNA的茎环前体序列，而不是成熟形式的序列。这2种方法各有特点，也都有一定的应用。本研究在预试验中比较了这2种鉴定方法，发现第2种方法更方便易行，人工验证部分工作量相对较少，因而采用了这个方法。

总之，本研究应用生物信息学手段，在转录本序列拼接的基础上，预测了甘草miRNA，确定了一批甘草miRNA的靶基因，为认识甘草miRNA的生物学功能提供了初步数据。