木瓜为蔷薇科（Rosaceae）植物贴梗海棠Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai的干燥近成熟果实，味酸性温，归肝、脾经，具有舒筋活络，和胃化湿等功效，主要用于治疗湿痹拘挛、腰膝关节酸重疼痛、暑湿吐泻、转筋挛痛、脚气水肿^[1]。

传统木瓜以“味酸”者为佳^[2-3]，木瓜有机酸组成复杂、种类丰富，如小分子脂肪酸莽草酸、柠檬酸等，具有抗炎、抗菌、镇痛的作用^[4-5]。原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、肉桂酸等酚酸类成分具有显著的抗炎、抗氧化、抗病毒、利胆等多种生物活性^[6-11]，熊果酸、齐墩果酸等三萜酸类成分具有抗炎抑菌、降低转氨酶、防止肝硬化、镇静、降血糖等多种功效^[12-16]，《中国药典》2015年版将熊果酸、齐墩果酸作为指标评价木瓜饮片的质量。但现有文献仅采用HPLC-UV法同时测定木瓜脂肪酸、酚酸2类有机酸^[17]，不能很好地整体评价木瓜的品质，本研究拟建立同时测定木瓜脂肪酸（莽草酸、柠檬酸）、酚酸（原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、肉桂酸）、三萜酸（齐墩果酸、熊果酸）3类有机酸的量的超高速液相色谱-质谱（UFLC-MS）方法，以期客观、综合地评价不同产地木瓜饮片的质量，并为其药效物质基础研究提供方法学依据。

Shimadzu LC 20A型快速液相色谱仪，AB Sciex Qtrap 5500型三重四级杆线性离子阱质谱仪，配有ESI离子源，Analyst 1.5.1 Software工作站；Shimadzu Librorael-40SM型电子分析天平（精确到0.01 mg）。

柠檬酸（批号100396-201302）、原儿茶酸（批号110809-201205）、绿原酸（批号110753-200413）、咖啡酸（批号110885-200102）、肉桂酸（批号110786-200503）、莽草酸（批号2014-0092），购自南京森贝伽生物科技有限公司。上述对照品经HPLC-UV法检测，归一化法计算质量分数均大于98.0%。齐墩果酸（批号110709-201206，质量分数94.9%）、熊果酸（批号110742-201421，质量分数93.8%），购自中国食品药品检定研究院。甲醇、水为质谱纯，德国Merck公司；其余试剂均为分析纯。

收集产地安徽（编号S1～S3）、湖北（编号S4～S6）、重庆（编号S7～S9）的9批木瓜药材，均经南京中医药大学吴啟南教授鉴定为蔷薇科植物贴梗海棠Chaenomeles speciosa (Sweet) Nakai的干燥近成熟果实。

Agilent Poroshell 120柱（100 mm×4.6 mm，2.7μm）；流动相为0.5%醋酸水溶液（A）-0.5%醋酸甲醇溶液（B），梯度洗脱：0～5 min，10% A；5～13 min，10%～30% A；13～15 min，30%～95% A；15～25 min，95% A；分析时间25 min；体积流量0.6 mL/min；柱温30℃；进样量2μL。

离子源为电喷雾离子化源（ESI）；多反应监测模式（MRM）进行定量分析；采用负离子检测模式；源喷射电压（IS）为−4 500 V；离子源温度为550℃；雾化气（GS1，N₂）压力为379.28 kPa（55 psi）；辅助气（GS2，N₂）压力为379.28 kPa（55 psi）；气帘气（N₂）压力为227.568 kPa（33 psi）。接口加热，全程通入氮气，MRM模式定量。监测的离子对，解簇电压（DP）和碰撞能量（CE）、碰撞室出口电压（CXP）见表 1。MEM质谱图见图 1。

表 1(Table 1)

表 1 8个成分的质谱数据 Table 1 ESI-MSn data of eight components     名称 母离子(m/z) 子离子(m/z) DP/V CE/eV CXP/eV 莽草酸 173.0 93.1 −90 −21 −15 柠檬酸 190.6 85.0 −185 −30 −11 原儿茶酸 153.0 109.0 −100 −30 −14 绿原酸 352.9 191.0 −95 −24 −21 咖啡酸 178.9 135.0 −70 −20 −19 肉桂酸 147.0 103.0 −60 −14 −11 齐墩果酸 455.2 407.2 −245 −54 −33 熊果酸 455.2 407.2 −245 −54 −33

表 1 8个成分的质谱数据 Table 1 ESI-MSn data of eight components

图 1 混合对照品溶液(Ⅰ)和供试品溶液(Ⅱ) 8个成分的MRM质谱图及溶剂空白质谱图 Fig.1 MRM chromatograms of eight components in mixed reference solution (Ⅰ) and sample solution (Ⅱ)

取各对照品适量，加甲醇制成含莽草酸37.41μg/mL、柠檬酸384.1μg/mL、原儿茶酸2.509μg/mL、绿原酸46.52μg/mL、咖啡酸201.8 ng/mL、肉桂酸5.104μg/mL、齐墩果酸60.82μg/mL、熊果酸62.75μg/mL的混合对照品溶液。

取本品细粉约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）20 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液1 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，即得。

精密量取混合对照品溶液1 mL，置于5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度。用倍比稀释的方法以甲醇制成系列对照品溶液，在上述色谱条件下，分别进样2μL，每个质量浓度进3针，测定峰面积值。以峰面积平均值与质量浓度进行线性回归。将混合对照品溶液用甲醇不断进行稀释后分析，得到8个成分的LOD值（S/N≈2～3）和LOQ值（S/N≈10）。结果见表 2。

表 2(Table 2)

表 2 8个成分的回归方程及LOD、LOQ值 Table 2 Regression equations and values of LOD and LOQ in eight components 化合物 回归方程 线性范围/(ng∙mL−1) r LOD/(ng∙mL−1) LOQ/(ng∙mL−1) 莽草酸 Y=7.19×104X＋2.69×104 149.6～74 820 0.999 7 3.09 9.27 柠檬酸 Y=2.17×105X－1.71×106 1 521～760 800 0.999 7 0.32 0.96 原儿茶酸 Y=5.85×106X－1.26×105 10.04～5 018 0.999 8 0.83 4.15 绿原酸 Y=7.73×106X＋4.30×106 186.1～93 040 0.999 8 0.29 2.04 咖啡酸 Y=2.23×108X－2.76×105 0.807～403.6 0.999 9 0.95 4.75 肉桂酸 Y=1.85×105X－1.06×104 20.42～10 210 0.999 8 3.85 19.25 齐墩果酸 Y=5.73×105X＋3.82×105 243.3～121 600 0.999 9 1.05 5.25 熊果酸 Y=5.61×104X＋2.65×104 251.1～125 500 0.999 2 3.76 18.80

表 2 8个成分的回归方程及LOD、LOQ值 Table 2 Regression equations and values of LOD and LOQ in eight components

取S3样品按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，进样2μL，连续进样6次，依法测定，分别记录峰面积，计算RSD，结果莽草酸、柠檬酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、肉桂酸、齐墩果酸、熊果酸峰面积的RSD分别为2.27%、1.63%、3.28%、2.85%、3.01%、1.47%、0.98%、1.13%。

取S3样品按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，于0、1、2、4、6、8 h分别进样2μL，依法测定，分别记录峰面积，计算RSD，结果莽草酸、柠檬酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、肉桂酸、齐墩果酸、熊果酸峰面积的RSD分别为2.42%、2.08%、1.93%、1.75%、3.18%、2.54%、1.58%、2.17%，表明供试品溶液中8个成分在8 h内稳定。

取编号为S3的木瓜饮片6份，每份0.5 g，按“2.3.2”项方法制备供试品溶液，依法测定并计算6份样品中8个成分的平均质量分数和RSD。结果莽草酸、柠檬酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、肉桂酸、齐墩果酸、熊果酸的平均质量分数分别为1.174 mg/g、16.46 mg/g、56.53μg/g、2.224 mg/g、6.712μg/g、207.4μg/g、3.294 mg/g、1.853 mg/g，RSD分别为2.08%、1.97%、2.53%、2.22%、3.06%、3.65%、1.00%、1.62%。

取编号为S3的木瓜饮片6份，每份0.25 g，精密称定，精密加入混合对照品溶液25 mL（含莽草酸18.9μg/mL、柠檬酸0.205 mg/mL、原儿茶酸0.932μg/mL、绿原酸27.0μg/mL、咖啡酸0.114μg/mL、肉桂酸7.15μg/mL、齐墩果酸31.3μg/mL、熊果酸15.8μg/mL），按“2.3.2”项方法制备供试品溶液，依法测定并计算6份样品中8个成分的平均加样回收率和RSD。结果莽草酸、柠檬酸、原儿茶酸、绿原酸、咖啡酸、肉桂酸、齐墩果酸、熊果酸的平均加样回收率分别为96.77%、97.05%、97.98%、96.14%、100.9%、101.2%、100.2%、99.23%，RSD分别为2.59%、1.72%、2.68%、1.72%、2.71%、1.08%、2.32%、1.71%。

取9批木瓜饮片，每批3份，按“2.3.2”项方法分别制备供试品溶液，各进样2μL，依法测定并计算每批样品中8个成分的平均质量分数，结果见表 3。

表 3(Table 3)

表 3 木瓜饮片中8个化合物质量分数(n=3) Table 3 Contents of eight components in Chaenomelis Fructus 样品 质量分数/(μg∙g−1) 莽草酸 柠檬酸 原儿茶酸 绿原酸 咖啡酸 肉桂酸 齐墩果酸 熊果酸 S1 1 252 19 280 541.80 5 120 8.740 3 964.0 4 241 1 973 S2 2 334 17 460 36.29 1 887 11.940 1 299.0 2 300 2 183 S3 1 969 16 780 73.66 2 402 5.140 315.1 3 293 1 815 S4 2 434 14 780 68.99 1 451 29.160 302.3 2 460 2 012 S5 2 628 17 330 25.23 3 998 5.628 947.6 1 410 6 369 S6 1 934 20 210 27.13 1 613 20.790 1 004.0 1 993 2 666 S7 1 084 15 880 108.80 4 092 4.690 3 763.0 3 838 4 024 S8 3 315 16 980 122.80 3 102 46.760 2 824.0 1 539 5 740 S9 2 515 20 690 22.31 2 074 23.700 1 553.0 4 562 3 327 表明齐墩果酸、熊果酸质量分数之和低于《中国药典》2015年版规定的0.5% Total contents of oleanolic acid and ursolic acid less than 0.5%, prescribed in Chinese Pharmacopoeia (2015 Edition)

表 3 木瓜饮片中8个化合物质量分数(n=3) Table 3 Contents of eight components in Chaenomelis Fructus

实验前期采用HPLC-PDA分离以上8种有机酸，小分子脂肪酸如苹果酸、莽草酸由于极性较大，普通十八烷基键合相不保留且因紫外仅有末端吸收，导致测定莽草酸的紫外灵敏度很低。酚酸、三萜酸类有机酸对照品基线虽然实现基本分离，但样品中其他成分对待测有机酸产生干扰，不能实现基线分离，影响定量结果的准确性，故采用UFLC-MS法，MRM模式检测，既可以缩短分析周期，也提高了检测灵敏度，实现待测化合物的准确定量。

遵循化合物的裂解规律，优化质谱离子源温度、辅助气和气帘气电压、子母离子的质荷比、解簇电压、碰撞电压、碰撞室出口电压，优选出最佳MRM测定条件。

实验结果表明，虽然熊果酸、齐墩果酸是《中国药典》2015年版规定的指标性成分，《中国药典》2015年版规定2者质量分数总和不低于0.5%。但是柠檬酸、绿原酸、莽草酸的量均较高，尤其柠檬酸的量超出其他有机酸的量10倍以上。初步推断可能与产地种植品种、不同的初加工方式有关^[18]。

本实验3类有机酸的量测定方法的建立，为完善木瓜质量控制提供了技术支撑，对木瓜产地种植、初加工方法、合理贮藏起到指导作用。实验室后期拟根据临床实际，结合药理模型，探索上述有机酸对木瓜药效的贡献，建立多指标的质量-效应评价体系，为全面揭示木瓜的药效作用物质基础提供依据。