天然化合物姜黄素（curcumin，Cur）是从姜科（Zingiberaceae）、天南星科（Araceae）等植物的根茎中提取出来的一种相对分子质量较小的多酚类物质^[1-2]。通常认为它是姜黄中最有效的活性成分^[3]，在食品生产中常用作色素和调味剂^[4]，在植物界中是很少见的二酮类色素，为二酮类化合物^[5-6]。近年来，很多学者研究发现，Cur具有抗氧化、抗菌、抗炎、抗肿瘤、保护肝肾、清除体内自由基等药理作用，对心脑血管、消化系统也具有保护功能^[7-8]。Cur开发应用前景广阔，具有较为理想的药用价值，且毒性很低，具有良好的临床应用潜力^[9-10]。但是Cur水溶性差，口服生物利用度低，使其应用受到了限制。

为了提高难溶性药物的溶解度，可以通过制备颗粒小、粒径分布均匀的纳米粉来解决，药物纳米化常用的方法有湿磨法、气流粉碎法、高压均质技术、超临界流体技术和反溶剂法等，其中机械粉碎法是目前应用最广泛的，但是缺点是耗能大、效率低和粒径分布不均匀。高压均质技术和超临界流体技术存在投资大、产率低、不易在工业中放大等缺点。反溶剂法^[11-13]是把药物溶于它的良溶剂中后，加入到它的不良溶剂中，从而通过降低良溶剂的溶解能力，使药物迅速达到过饱和状态而结晶析出的一种传统微粉化技术。随着含有药物的溶液滴加到反溶剂中，溶剂与反溶剂体系对药物的溶解度骤降，药物达到过饱和，从而结晶析出。可通过添加相应的表面活性剂，控制药物的结晶，促进晶核的形成，抑制结晶的团聚，获得平均粒径较理想的纳米药物。此方法操作简单、效率高、成本低、生产过程可以一步完成，得到的药物颗粒的特点是制备的粉体颗粒小、活性中心多、吸附能力强、粒度分布均匀。目前，通过该方法已成功制备了多种难溶性口服药物。例如，许文佳等^[14]采用反溶剂重结晶法制备甘草酸纳米粒，得到的纳米粒平均粒径为220 nm左右；赵修华等^[15]利用反溶剂法进行反式肉桂酸微粉化的工艺研究，所得微粉化反式肉桂酸的粒径为130 nm左右。

近年来，已有很多学者通过脂质体^[16]、胶束^[17]、微乳^[18]、熔融^[19]、纳米结晶^[20]等方法进行Cur纳米化研究，虽然得到的纳米Cur提高了其溶解度和生物利用度，但是Cur纯度低、辅料多、在生产中不易放大，以高分子材料作为辅料会产生安全性等问题。所以本研究通过反溶剂法制备Cur纳米粒（curcumin nanoparticles，CN）冻干粉（CN lyophilized powder，CNLP）来提高Cur的溶解度和生物利用度，减少其用药量，节省资源；改变Cur传统剂型，丰富Cur的剂型选择和给药途径，增强Cur的临床药效^[21-22]。本研究主要利用反溶剂法制备CNLP，采用单因素优化实验方法对药物质量浓度、表面活性剂用量、水和有机相的比例、搅拌速率、沉积时间、Cur和甘露醇的质量比6个因素进行考察研究，得到制备CNLP的最优制备条件，并对CNLP的粒径检测、饱和溶解度、溶出速率情况进行研究。

SHJ-A4水浴恒温磁力搅拌器，常州华奥仪器制造有限公司；ZetaPALS激光粒度仪，美国布鲁克海文；Quanta-200扫描电子显微镜（SEM），荷兰FEI公司；Scientz-18N型冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司；LXJ-IIB型离心机，上海安亭科学仪器厂；Waters1525高效液相色谱仪，美国Waters公司。

Cur，质量分数98%，西安源森生物科技有限公司，批号B20614；Cur对照品，质量分数≥98%，中国食品药品检定研究院，批号20140516；聚山梨酯-80（P80）、甘露醇，分析纯，天津市天力化学试剂有限公司；丙酮，天津市富于精细化工有限公司；去离子水，实验室自制；乙腈，色谱级，山东禹王实业有限公司；盐酸，分析纯，新乡市宏盛化工有限公司；冰乙酸、磷酸二氢钾、氢氧化钠，分析纯，天津市致远化学试剂有限公司。

本实验通过反溶剂法制备CNLP。将一定质量的Cur溶解在适量溶剂丙酮中，超声10 min，然后以4 000 r/min离心10 min去除杂质，取上清。在磁力搅拌器适当搅拌速率条件下，将Cur丙酮溶液匀速加入含有P80的水溶液中，搅拌5 min。将得到的CN混悬液用旋转蒸发仪进行旋蒸，去除溶剂丙酮，最后在混悬液中加入适量甘露醇作为冻干保护剂，混合均匀后放入-40℃冰箱中预冻（12 h），再将其放入冻干机中进行冷冻（-80℃）干燥48 h，最后得到CNLP。

通过预试验进行考察研究，确定了以丙酮作为溶剂、水作为反溶剂，影响粒径大小的因素有药物质量浓度、P80用量、溶剂和反溶剂体积比（丙酮-水体积比）、搅拌速率、沉积时间、Cur和甘露醇的质量比共6个因素。例如，研究沉积时间时，其他因素设置为药物质量浓度8 mg/mL、溶剂和反溶剂的比例1：5、表面活性剂P80用量0.1%、搅拌速率1 200 r/min，每组实验重复3次，得到的Cur纳米混悬液通过激光粒度仪来检测粒径，计算平均值。因素范围设置如下：Cur质量浓度为0.1～10 mg/mL，溶剂和反溶剂的比例为1：1～1：20，表面活性剂P80用量为0.01%～0.3%，沉积时间为2～60 min，搅拌速率为200～2 000 r/min，甘露醇与Cur质量比为0：1～6：1。

保持其他实验工艺条件不变（Cur质量浓度为10 mg/mL、反溶剂与溶剂比例为1：5、沉积时间为10 min、搅拌速率为1 200 r/min）的情况下考察表面活性剂P80用量分别为0.01%、0.015%、0.025%、0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%对得到的CN混悬液平均粒径的影响，结果平均粒径分别为（547.9±6.2）、（517.9±5.3）、（125.0±3.1）、（49.5±4.3）、（57.5±6.7）、（52.4±2.1）、（52.1±3.9）、（51.4±4.1）、（56.1±3.3）nm。当表面活性剂P80用量从0.01%增加到0.05%时（按P80水溶液计算），CN混悬液的平均粒径从547.9 nm降低至49.5 nm，然而随着表面活性剂P80用量增加至0.3%时，CN混悬液的平均粒径并没有发生明显变化。通过观察，平均粒径先随着表面活性剂用量增加而减小，然后基本保持不变，原因是P80作为非离子型表面活性剂，用量越高时它的亲水能力就越强，这样也会增强Cur在水中的分散性，所以导致CN混悬液的平均粒径变小，但是用量过大时，因P80为油性物质，所以导致在冻干过程中不易冻干。继续增加表面活性剂用量时，粒径基本保持不变，综合考虑，0.05%的表面活性剂P80用量被确定为最佳用量。

在其他工艺条件不变（表面活性剂用量为0.05%、反溶剂与容积比为1：5、沉积时间为10 min、搅拌速率为1 200 r/min）的情况下考察Cur质量浓度分别为0.1、0.25、0.5、1、2、4、6、8、10 mg/mL对得到的CN混悬液平均粒径的影响，结果平均粒径分别为（151.9±2.3）、（162.8±1.6）、（182.0±2.9）、（136.6±3.1）、（61.4±2.8）、（51.70±1.7）、（55.8±2.6）、（46.1±3.1）、（61.5±2.5）nm。Cur的质量浓度从0.1 mg/mL增加至4 mg/mL时，Cur平均粒径呈减小趋势，增加至8 mg/mL时平均粒径无明显变化，当增加到10 mg/mL时平均粒径有增大趋势。这是由于Cur丙酮溶液质量浓度过高时，沉积过程中产生的药物微粒数量增多，同样也会增大药物微粒间的碰撞和团聚几率，在重结晶过程中就会生成大量的微粒团聚物，导致粒径增大；药物质量浓度过小易造成产品得率较低等问题。因此综合考虑，将8 mg/mL作为Cur最佳质量浓度用来制备CN。

在其他工艺条件不变（表面活性剂用量为0.05%、Cur质量浓度为8 mg/mL、沉积时间为10 min、搅拌速率为1 200 r/min）的情况下考察溶剂与反溶剂体积比分别为1：2、1：2.5、1：3、1：4、1：5、1：10、1：15、1：20对得到的CN混悬液平均粒径的影响，结果平均粒径分别为（102.3±2.9）、（94.9±3.1）、（65.7±2.5）、（65.7±1.4）、（44.5±3.2）、（62.2±2.8）、（76.0±3.6）、（107.6±2.6）nm。当体积比从1：1增加到1：5时，CN混悬液的平均粒径从102.27 nm减小到44.53 nm；当体积比从1：5增加到1：20时，平均粒径又持续增大至107.63 nm。原因是随着反溶剂比例的增加会使药物在短时间内达到过饱和，这时在沉积过程中Cur粒子会迅速结晶析出，会产生很小的Cur微粒子，反之在继续增加反溶剂的比例时，虽然会继续增大过饱和度，但是产生的小微粒不稳定，会产生团聚和聚合现象，所以粒径也随之增大。因此，选择体积比1：5为最优条件。

在其他工艺条件不变（表面活性剂用量为0.05%、Cur质量浓度为8 mg/mL、溶剂与反溶剂比为1：5、搅拌速率为1 200 r/min）的情况下考察沉积时间分别为2、5、10、20、30、60 min对得到的CN混悬液平均粒径的影响，结果平均粒径分别为（114.8±3.9）、（49.8±2.6）、（51.9±1.6）、（55.2±3.8）、（53.4±2.9）、（47.6±2.3）nm。沉积过程在5 min之前，平均粒径迅速减小，5 min以后直至60 min，平均粒径大小虽有变化但幅度相当小，基本趋于稳定。这是因为CN在重结晶过程中，短时间内尚未沉积完全，导致粒径变大；达到5 min以后，随着沉积时间的延长，搅拌过程中，由于奥斯瓦尔德熟化效应，小粒子会相互碰撞并聚集生长为大颗粒^[23]。但是在不断搅拌的条件下，又将团聚的大粒子拆分成小粒子，所以其平均粒径并未发生明显变化。综合考虑，沉积时间的长短对CN的得率有影响，需要进一步进行优化。

在其他工艺条件不变（表面活性剂用量为0.05%、Cur质量浓度为8 mg/mL、溶剂与反溶剂比为1：5、沉积时间为5 min）的情况下考察搅拌速率分别为200、400、800、1 200、1 600、2 000 r/min对得到的CN混悬液平均粒径的影响，结果平均粒径分别为（84.8±3.5）、（50.9±2.3）、（49.9±3.3）、（51.0±3.1）、（51.6±1.9）、（52.1±2.6）nm。搅拌速率由200 r/min到400 r/min时，平均粒径迅速从75.00 nm减小到50.93 nm；继续加速到800 r/min，平均粒径减小到49.93 nm；再继续加速，随着搅拌速率的增加，平均粒径基本保持不变。这是因为在低搅拌速率下，沉积出的粒子不能在体系中均匀的分散，从而使粒子团聚；反之，在沉积刚开始时，高搅拌速率，会使粒子不易团聚，破坏了粒子的聚合，继续搅拌时，也会使沉积体系更加均匀，最后粒子粒径变化趋于稳定。虽然搅拌速率为800 r/min时粒径最小，但综合考虑到节能环保等因素，因此选择搅拌速率较小而粒径差别不大的400 r/min为最佳搅拌速率。

在上述条件下（表面活性剂用量为0.05%、Cur质量浓度为8 mg/mL、溶剂与反溶剂比为1：5、沉积时间为5 min、搅拌速率为400 r/min）制备的CN混悬液，按照甘露醇与Cur的质量比为0：1、0.5：1、1：1、2：1、3：1、4：1、5：1、6：1的比例加入到CN混悬液中，使其充分溶解后，进行真空冷冻干燥，最后得到CNLP，再用去离子水复溶后，检测粒径，结果平均粒径分别为（310.3±5.1）、（220.4±4.3）、（227.9±2.6）、（212.3±3.9）、（195.6±3.1）、（172.2±4.6）、（176.9±2.5）、（175.1±3.9）nm。不加甘露醇的平均粒径为310.3 nm，质量比从0.5：1增加到4：1，CN的平均粒径从220.4 nm减小到172.2 nm；增加到5：1，平均粒径大小为176.9 nm；增加到6：1，平均粒径大小为175.1 nm。可以看出，Cur与甘露醇的质量比增加到1：4后，当甘露醇的用量继续增加时，平均粒径大小并无明显变化。因此，得到了最优的Cur与甘露醇的质量比为4：1。

综合上述单因素考察结果得出制备CNLP最优工艺：Cur质量浓度8 mg/mL、溶剂与反溶剂比1：5、表面活性剂P80用量0.05%、沉积时间5 min、搅拌速率400 r/min、甘露醇与Cur质量比4：1。在最优条件下制备CNLP，其正态分布曲线如图 1所示，图 1-a为CN混悬液，其平均粒径为（50.9±2.3）nm，图 1-b为CNLP经过复溶后样品，其平均粒径为（172.2±4.6）nm；CN混悬液和CNLP复溶液Zeta电位如图 2所示，其电位为（-15.1±2.9）和（-19.7±3.7）mV；SEM图谱如图 3所示，图 3-a为Cur原粉，呈不规则的大块状，粒径在20μm左右。图 3-b为CN冻干粉，呈不规则的均匀的块状结构，粒径在170 nm左右，与原粉相比粒径明显减小。从以上CNLP的形态来看，由激光粒度仪测得的CNLP平均粒径是基本一致的。甘露醇作为冻干保护剂时，会将CN均匀地分散开，而不会破坏粒子结构，在冻干过程中起到框架支撑作用，能够很好地将CN分散均匀。在冷冻干燥过程中，粒径产生团聚，导致粒径增大，因此，冻干粉复溶后的平均粒径大于混悬液平均粒径。

图 1 CN混悬液(a)和CNLP复溶液(b)的平均粒径正态分布曲线(n=3) Fig.1 Normal distribution curves of mean particle size of CN suspension (a) and redispersion fluid of CNLP (b) (n=3)

图 2 CN混悬液(a)和CNLP复溶液(b)的Zeta电位图(n=3) Fig.2 Zeta potential diagrams of CN suspension (a) and redispersion fluid CNLP (b) (n=3)

图 3 Cur原粉(a)和CNLP (b)的SEM图谱 Fig.3 SEM graphs of raw curcumin powder (a) and CNLP (b)

液相色谱柱Diamonsil反相C₁₈（150 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为乙腈-4%冰乙酸水溶液（48：52），柱温30℃，检测波长430 nm，体积流量1.0 mL/min，进样量20μL。

本研究采用去离子水、人工胃液和人工肠液作为溶出介质。人工胃液配制方法：用5 mL 37%盐酸和1 000 mL的去离子水制成混合溶液。人工肠液的配制方法：将6.8 g/L磷酸二氢钾加水500 mL溶解，用氢氧化钠将溶液的pH值调至6.8，加水稀释至1 000 mL。

将过量的Cur原粉、CNLP和物理混合物（Cur、甘露醇、P80的比例和CNLP相同）分别加入到2 mL溶出介质（去离子水、人工胃液、人工肠液）中，水浴温度（37.0±0.5）℃，搅拌速率100 r/min，连续搅拌48 h后，取1 mL样品，再以10 000 r/min的速率离心5 min，取上清液20μL进行HPLC检测。检测分析条件按照“2.4.1”项色谱条件检测。实验重复3次，取平均值。

如表 1所示，根据标准曲线计算回归方程Y＝135 472 582.065 6 X-100 339.948 7（R²＝0.999 9），得出Cur原粉、CNLP和物理混合物（Cur、甘露醇、P80）在不同溶出介质中的饱和溶解度。在去离子水溶出介质中，Cur原粉、CNLP和物理混合物的饱和溶解度分别为15.44、636.4、16.35μg/mL，CNLP饱和溶解度是原粉的41.32倍；在人工胃液溶出介质中，Cur原粉、CNLP和物理混合物的饱和溶解度分别为52.38、91.23、50.02μg/mL，CNLP饱和溶解度是原粉的1.74倍；在人工肠液溶出介质中，Cur原粉、CNLP和物理混合物的饱和溶解度分别为5.47、22.48、8.03μg/mL，CNLP饱和溶解度是原粉的4.11倍。因此，可以看出能够改变粒径大小的因素并不是加了甘露醇和P80的原因，而是通过反溶剂法的重结晶过程来改变Cur粒径大小的，加入P80的原因是起到表面活性剂的作用，增加了重结晶过程中粒子的表面活性，起到分散作用，而加入甘露醇的原因是在冻干过程中为了防止粒子的聚合，起到框架支撑作用。从而使得到的CNLP粒径小、比表面积大，在去离子水、人工胃液、人工肠液中的饱和溶解度远高于原粉，因此服用同样剂量的药物，纳米粒能够更好地在体内吸收、发挥药效。

表 1(Table 1)

表 1 Cur原粉、CNLP和物理混合物的饱和溶解度 Table 1 Saturated solubility of raw curcumin powder, CNLP, and physical mixture   样品名称 不同介质中饱和溶解度/(μg∙mL−1) 去离子水 人工胃液 人工肠液 Cur原粉 15.44±2.81 52.38±5.13 5.47±1.97 CNLP 636.43±6.92 91.23±6.91 22.48±3.84 物理混合物 16.35±1.53 50.02±4.70 8.03±2.11

表 1 Cur原粉、CNLP和物理混合物的饱和溶解度 Table 1 Saturated solubility of raw curcumin powder, CNLP, and physical mixture

将去离子水、人工胃液和人工肠液作为溶出介质，搅拌速度100 r/min，水浴温度（37.0±0.5）℃。称取26 mg Cur原粉和Cur质量为26 mg的CNLP分别加入200 mL去离子水中，称取5.2 mg Cur原粉和Cur质量为5.2 mg的CNLP分别加入200 mL人工胃液中，称取3 mg Cur原粉和Cur质量为3 mg的CNLP分别加入200 mL人工肠液中，并且在10、20、30、45、60、90、180、240、360、480、600、720 min时间点上进行溶出取点。每次取5 mL，每次取完样品溶液后重新添加5 mL溶出介质，再以10 000 r/min的速率离心5 min，取上清液20μL直接进行HPLC检测，检测分析条件按照“2.4.1”项色谱条件检测。实验重复3次，取平均值。然后计算出Cur原粉和CNLP在3种不同介质中的累积溶出率。

C₁表示第1个取样点药物质量浓度，C_i表示每个时间点中取样样品中的药物质量浓度，C_i′为每个时间间隔药物质量浓度增加量，V为溶出介质的总体积，V_i为每次取样体积，M为药物质量，Q_i为每个取样点上溶出速率

由于物理混合方法（Cur原粉、甘露醇和P80）不能提高Cur在3种介质中的溶解度，排除了干扰因素。所以本课题只做了Cur原粉和CNLP在3种介质中的溶出实验。图 4-a为Cur原粉和CNLP在水中溶出曲线，在溶解度实验开始30 min内，Cur原粉的溶出率为4.3%，CNLP的溶出率已经达到了62.4%，是原粉的14.51倍。图 4-b为Cur原粉和CNLP在人工胃液中的溶出曲线，在溶解度实验开始90 min内，Cur原粉的溶出率为32.02%，CNLP的溶出率已经达到了74.65%，是原粉的2.33倍。图 4-c为Cur原粉和CNLP在人工肠液中的溶出曲线，在溶解度实验开始90 min内，Cur原粉的溶出率为1.22%，CNLP的溶出率已经达到了54.65%，是原粉的44.79倍。在3种溶出介质中，CNLP的溶出率较原粉均有显著提升，这应归因于CNLP的粒径减小、比表面积大，增加了Cur的溶解度。Noyes-Whitney方程指出，药物的溶解速度与药物在溶剂中的表面积呈正比^[24]。因为该药纳米粉的粒径减小，增大了与溶出介质接触的表面积，所以与Cur原粉相比，低结晶度和药物粒径小的CNLP有较高的溶解速率和溶解度，可以使CNLP能够更好地在体内吸收，提高了Cur在体内的生物利用度，为其体外与体内相关性分析提供了有利依据。

图 4 CNLP和Cur原粉在去离子水(a)、人工胃液(b)和人工肠液(c)中溶出曲线 Fig.4 Dissolution profiles of CNLP and raw curcumin powder in deionized water (a), simulated gastric fluid (b), and simulated intestinal fluid (c)

本实验利用单因素实验对CNLP的制备工艺进行优化。采用反溶剂法对药物溶液质量浓度、表面活性剂用量、溶剂与反溶剂比、沉积时间、搅拌速率、冻干保护剂用量6个因素进行考察研究，总结出CNLP的最优制备条件如下：药物溶液质量浓度为8 mg/mL、表面活性剂用量为0.05%、溶剂与反溶剂比为1：5、沉积时间为5 min、搅拌速率为400 r/min、Cur与甘露醇的质量比为1：4。在上述最优条件下，所得CNLP复溶后的平均粒径为172.2 nm。通过溶解度检测，在去离子水中，CNLP的饱和溶解度是原粉的41.32倍；在人工胃液溶出介质中，CNLP饱和溶解度是原粉的1.74倍；在人工肠液溶出介质中，CNLP饱和溶解度是原粉的4.11倍。通过溶出率检测，同等时间内，在去离子水中，CNLP的溶出率是原粉的14.51倍；在人工胃液中，CNLP的溶出率是原粉的2.33倍；在人工肠液中，CNLP的溶出率是原粉的44.79倍。通过反溶剂法得到的CNLP粒径小，在去离子水、人工胃液、人工肠液中的溶解度和溶出速率远高于原粉。

本实验以水溶性差药物Cur为研究对象，考察了反溶剂法制备CNLP的可行性，并确定了最佳制备工艺条件。CNLP的粒径的减小增大了药物的比表面积，从而带来了溶解度和溶出率的提高，使得药物更好被吸收。本研究为提高Cur类药物的生物利用度提出了新思路。