2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.14.008 |
2. 广东医学院, 广东 东莞 523808
2. Guangdong Medical College, Dongguan 523808, China
介孔硅纳米粒子（mesoporous silica nanoparticles，MSNs）是20世纪90年代迅速兴起的一种新型有序介孔纳米材料，具有纳米孔道结构规则、孔径可在2～50 nm连续可调、表面基团易于修饰、生物相容性良好等优点，目前以MSNs为基础的多功能传输载体研究非常广泛[1-4]。通过MSNs表面功能化修饰，利用官能化的高分子、纳米粒子、蛋白质等作为纳米阀门，将药物封装在孔道内部实现药物因pH值、生物环境等条件变化，实现在组织内部的可控制释放[5-6]。但是，由于其粒径较大，这一类传输载体在水溶液中容易聚集、沉淀，从而限制其应用。聚乙二醇（PEG）具有良好的生物相容性、生物安全性和水溶性，利用PEG化学修饰纳米粒子、纳米胶束，可提高载体的水分散性和缓释能力[7-8]。丹参素是从丹参中提取的一种水溶性的有效成分，具有舒张血管、保护心肌细胞、抗炎、抗氧化作用[7, 9]。但是丹参素在碱性条件下易发生自氧化，并且有研究发现丹参素生物利用度较低[8]。为了提高丹参素的稳定性和循环释放时间，本研究通过点击化学法，在MSNs表面引入PEG链段，制备了一系列负载丹参素的MSNs-PEG传输载体，并系统考察了该传输载体的形态及药物的释放规律。
1 仪器与材料Nicolet MX-1E红外光谱（FTIR）仪，德国Bruker公司；JEM-100CX透射电子显微镜（TEM），日本电子株式会社；Zeta PALS电位分析仪，美国Brookhaven；Rigaku Ultima IV diffractometer射线粉末衍射（XRD），日本理学株式会社；TU1900紫外分光光度计，北京普析仪器有限公司。
3-氯丙基三乙氧基硅烷（CPTES）、正硅酸乙酯（TEOS）、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、叠氮化钠、五水硫酸铜、抗坏血酸钠、对甲苯磺酰氯（TsCl）等购于安耐吉化学试剂公司；聚乙二醇（PEG，相对分子质量25 000）、聚乙烯酰亚胺（PEI，相对分子质量25 000）、2-炔丙胺购于Sigma-Aldrich公司；胎牛血清、杜氏改良液（DMEM液）、青霉素-链霉素、四甲基偶氮唑蓝（MTT）和胰蛋白酶购于美国Gibco公司；丹参素钠，相对分子质量220.16，质量分数99%，广州市药品检验所，批号090843-201309；其他试剂用为分析纯。
2 方法与结果 2.1 MSNs-PEG纳米传输载体的制备 2.1.1 合成含叠氮基的MSNs（MSN-N3）3-叠氮基丙基三乙氧基硅烷（APTES）的合成采用文献方法[10]。1.0 g CTAB溶于480 mL水与3.5 mL 2.0 mol/L NaOH溶液中，升温至70℃，分别滴加5.0 mL（22 mmol）TEOS和不同比例APTES（TEOS-APTES 100∶5、100∶7.5、100∶10，分别命名为MSN-N35、MSN-N37.5、MSN-N310），升温至70℃，剧烈搅拌反应2 h。反应完毕，滤过沉淀物，用甲醇洗涤，将得到的产物分散在含有2 mL 37%浓盐酸的50 mL乙醇中，80℃剧烈搅拌10 h，除去CTAB，最后滤过沉淀，真空干燥，即得[10]。
2.1.2 合成端基含炔基的PEG（炔基修饰PEG）取2.0 g PEG（0.08 mmol）溶于20 mL CH2Cl2，加入到含0.38 g TsCl的吡啶（8.0 mL）溶液中，充分混合，室温反应24 h。反应完毕后，用50 mL 3 mol/L HCl萃取，有机层加入碳酸氢钠剧烈搅拌，滤过，滤液蒸干得白色粉末状粗产品。40℃搅拌下将产物溶于10 mL四氢呋喃（THF）中，滴至乙醚中，析出沉淀后滤过，真空干燥。产物与0.50 mL炔丙胺于100℃密闭反应24 h，然后冷却至室温，用CH2Cl2 20 mL萃取，饱和Na2CO3溶液反复洗涤3次后，旋转除去溶剂，真空干燥，即得[11]。
2.1.3 PEG接枝MSNs（MSNs-PEG）将0.50 g MSN-N3分散于8 mL含0.33 g（0.02 mmol）炔基修饰PEG的二甲基甲酰胺（DMF）溶液中，在室温、氮气环境中搅拌2 h。然后，先后注入0.10 mL硫酸铜（9 mg，0.03 mmol）水溶液和0.15 mL抗坏血酸钠（25 mg）水溶液，50℃、氮气条件下搅拌反应24 h[12]。离心分离，蒸馏水反复分散洗涤离心3次，除去未反应的PEG，沉淀冷冻干燥，即得。根据MSN-N3样品中叠氮基的不同接枝量，PEG接枝MSNs分别命名为MSNs-PEG5、MSNs-PEG7.5、MSNs-PEG10。
2.2 FTIR表征MSNs-PEG样品研磨成粉末，KBr压片，FTIR表征测试样品中基团的变化。图 1为MSN-N3（MSN-N35、MSN-N37.5、MSN-N310）和MSNs-PEG（MSNs-PEG5、MSNs-PEG7.5、MSNs-PEG10）的FTIR光谱。由图 1-A所示，通过TEOS前驱体与含叠氮基的硅烷偶联剂共水解缩合后，在2 110 cm-1处出现叠氮基的振动吸收峰，并且随着叠氮基数量的提高，2 110 cm-1处的吸收峰强度也随之提高，这表明通过共水解的方法，能够有效、可控地在纳米粒子中引入叠氮基[13-14]。点击化学反应后，FTIR（图 1-B）显示2 110 cm-1处的吸收峰消失，这说明纳米粒子中的叠氮基已经充分反应，并且在1 450 cm-1处出现新的吸收峰，对应为点击化学反应生成的1, 2, 3-咪唑环震动吸收峰。FTIR表明，通过化学点击法，PEG分子链成功接枝到纳米粒子。热失重数据分析表明，PEG接枝到纳米载体的量（质量分数）可达20%左右，且接枝量（质量分数）随着叠氮基数量的升高而升高。
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图 1 MSN-N3 (A)和MSNs-PEG (B)样品的FTIR图 Fig.1 FTIR spectra of MSN-N3 (A) and MSNs-PEG (B) samples |
2.3 MSNs-PEG形态表征
将样品粉末超声分散在水中。取适量滴加到铜网上，TEM观察纳米粒子形态；通过Zeta电位分析仪测定纳米粒子的粒径；样品研磨成粉末，XRD表征材料的有序结构，Cu靶辐射，1°～10°散射角观察。图 2为不同PEG接枝量的MSNs-PEG纳米粒子（MSNs-PEG5、MSNs-PEG7.5、MSNs-PEG10）的TEM照片，从图 2-A可以看出，通过溶胶-凝胶法制得的MSNs粒径分散均匀，约100 nm左右，并且表面具有明显的孔道结构，药物分子可以封装到这些孔道中，提高载体的负载能力。由图 2-B～D可以看出，MSNs接枝PEG分子链后，可以清楚地观察到纳米粒子表面的聚合物层，粒子与粒子之间产生了一定的粘连，这也充分说明了PEG分子链成功接枝到MSNs纳米粒子上。同时在纳米粒子表面能够清楚地观察到平行条带，这表明纳米粒子接枝后，载体仍然能够有效地维持纳米粒子的介孔结构。
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图 2 MSN-N3 (A)、MSNs-PEG5 (B)、MSNs-PEG7.5 (C)和MSNs-PEG10 (D)样品的TEM照片 Fig.2 TEM images of MSN-N3 (A), MSNs-PEG5 (B), MSNs-PEG7.5 (C), and MSNs-PEG10 (D) |
粒度分析结果显示MSNs、MSNs-PEG5、MSNs-PEG7.5、MSNs-PEG10的平均粒径分别为（106.0±18.7）、（118.0±22.5）、（126.0±17.1）、（136.0±10.9）nm，表明随着PEG接枝量的提高，纳米粒子的粒径随之提高，粒径可控制在150 nm左右。MSNs-PEG的Zeta电位均趋向于0 mV，主要是由于亲水性的PEG链能在MSNs的外层形成中性的PEG水化层，降低纳米胶束的电负性，能够有效地提高MSNs-PEG纳米粒子在水溶液中的稳定性。
XRD（图 3）显示了纳米传输载体在100、110、200有3个面，这也说明点击化学反应并没有破坏纳米粒子有序结构，纳米粒子接枝PEG后，依然能够保持粒子的介孔结构[15]。
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图 3 MSNs-PEG5 (A)、MSNs-PEG7.5 (B)和MSNs-PEG10 (C)样品的XRD图 Fig.3 XRD patterns of MSNs-PEG5 (A), MSNs-PEG7.5 (B), and MSNs-PEG10 (C) |
2.4 MSNs-PEG安全性考察
MTT法测定载体的体外细胞毒性。将293T细胞接种于含有DMEM（含10%胎牛血清）的96孔细胞培养板（1×104细胞/孔）中，每孔培养基终体积为200μL，37℃、5% CO2环境下培养24 h，待细胞长到80%左右，吸去培养液，加入无血清培养液，在细胞孔中加入不同质量浓度的载体溶液，每个浓度组设5个复孔。24 h后，每孔加入20μL MTT，继续培养箱内孵育，4 h后将培养基和MTT吸出，加入150μL DMSO，摇床摇匀15 min，在酶标仪上490 nm波长处检测吸光度（A490）值。根据下面的公式计算细胞存活率：细胞存活率=A490样品/A490对照，其中A490样品、A490对照分别在MSNs-PEG和聚乙烯酰亚胺（PEI）下获得。结果如图 4所示，由图 4可以看出，PEG化的MSNs显示出较低的细胞毒性和良好的生物相容性，细胞的存活率可以维持在90%以上，说明纳米粒子不会影响细胞的生长。并且从图 4中可以看出，在不同浓度样品溶液中，细胞存活率基本随着PEG接枝量的提高而提高，这也说明了在载体中引入PEG分子链，能够有效提高MSNs-PEG传输载体的生物安全性和降低细胞毒性。
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图 4 MTT法评价MSNs-PEG纳米粒子的安全性 Fig.4 Safity evaluation of various MSNs-PEG by MTT |
2.5 丹参素/MSNs-PEG载体制备及丹参素的定量分析 2.5.1 负载丹参素载体的制备
取PEG不同接枝量的MSNs-PEG样品50 mg，分散于5 mL含丹参素的甲醇溶液（丹参素质量浓度10.0 mg/mL）中，避光搅拌24 h，离心收集沉淀，以甲醇洗涤载体，除去未被吸附的丹参素，所得样品冷冻干燥，即得负载丹参素的丹参素/MSNs-PEG载体，4℃冰箱保存，备用。
2.5.2 丹参素标准曲线绘制丹参素定量测定方法参考课题组前期工作进行[8]：精密称取丹参素钠对照品10 mg，溶于10 mL甲醇中。分别精密吸取对照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL于10 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。紫外分光光度计280 nm处测定A值，绘制标准曲线，进行线性回归得回归方程Y=102.71 X＋8.242，r=0.999 9，线性范围为10.2～102.0μg/mL。
2.5.3 精密度试验精密吸取丹参素低、中、高质量浓度（10.2、51.0、102.0μg/mL）对照品溶液3 mL，分别于1 d内测定5次，连续测定3 d，记录A值，计算日内及日间精密度。日内精密度RSD分别为0.92%、1.15%、1.67%，日间精密度RSD分别为1.07%、0.88%、0.92%，符合方法学要求。
2.5.4 稳定性试验分别称取不同负载丹参素的载体0.10 g，加入pH 7.4的PBS缓冲液10 mL，在37℃水浴中释放。吸取释放液的供试品溶液，分别测定0、0.5、1、2、4、7、10 h时A值。结果表明，A值的RSD为1.63%，表明在10 h内样品溶液稳定性良好。
2.5.5 重复性试验精密吸取同一批丹参素/PEG-MSNs释放液的供试品溶液3 mL，连续测定5次，测定A值，RSD为1.89%。
2.5.6 加样回收率试验精密量取5份已测定的丹参素/MSNs-PEG释放液所制备的的供试品溶液2.5 mL，加入含丹参素10.2μg/mL的对照品溶液0.5 mL，摇匀制成5份供试液，分别测定A值，计算回收率，丹参素的平均回收率为（99.60±0.97）%，RSD为1.29%。
2.5.7 包封率及载药量的测定采用“碱破壳”方法测定载药量，利用标准曲线计算出丹参素的载药量和包封率，其载药量和包封率分别为6.8%和22.8%。具体步骤如下：称取20 mg丹参素/MSNs-PEG，加入20 mL 0.20 mol/L的NaOH溶液中，震荡反应24 h，用紫外-可见分光光度计测定A值，根据标准曲线计算丹参素的质量浓度，分别按照下面的公式计算丹参素/MSNs-PEG颗粒的载药量和包封率，重复实验3次取平均值。
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分别称取负载丹参素的载体0.10 g，加入pH 7.4的PBS缓冲液10 mL，在37℃水浴中进行释放。分别于1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、36 h取样3 mL，同时用pH 7.4的PBS缓冲液补足取出量。每个样品取3个重复样品进行测定。以时间为横坐标，药物的累积释放率为纵坐标作图，结果见图 5。
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图 5 MSNs-PEG纳米传输载体负载丹参素的累积释放率(n=3) Fig.5 Cumulative release rate of drug released from MSNs-PEG nanocarriers (n=3) |
控制和延缓药物的释放可提高药物的疗效，因而药物的释放速率是评价药物传递系统的一个重要指标。采用美国FDA推荐使用的相似因子（f2）法评价体外释放曲线差异，以考察其内在质量的相似性[16-17]。f2数值的大小量度了2条释放曲线之间累积释放率的相似性。f2越小，表明2条释放曲线差异越大，如果f2＜50，可认为2条释放曲线具有不同的释放特点。以丹参素/MSN-N3释放曲线为参比，丹参素/MSNs-PEG5、丹参素/MSNs-PEG7.5和丹参素/MSNs-PEG10的f2分别为23.6、21.7和19.5，这个结果表明，PEG接枝到MSN粒子上，极大地改变了丹参素的释放规律。
从图 5中可以看出，随着PEG接枝量的增加，丹参素的累积释放率急剧下降。从累积释放曲线可看出，没有PEG修饰过的MSNs，丹参素的释放速度非常快，在前5 h时，累积释放率已经超过70%，处于爆释状态[18]，10 h左右时，药物释放已经基本达到平衡。而PEG接枝MSNs后，使丹参素的释放速度明显得到控制，释药曲线相对比较平稳，在10 h时，累积释放率达到50%左右，并且随着PEG接枝量的提高，10 h时的累积释放率下降到40%左右。这表明增加PEG接枝量的提高，可以有效控制药物的释放速率，降低药物初期的爆释。
3 讨论MSNs接枝PEG的接枝量主要是通过MSNs中叠氮基的数量来控制，而叠氮基是通过硅烷偶联剂与前驱体共水解缩合的方法定量引入。从理论上讲，叠氮基的数量可以在很大的范围内调节，但是实验中发现，含有叠氮基的硅烷偶联剂质量分数超过15%时，会导致纳米粒子的介孔结构消失，TEM照片很难观察到粒子表面的有序结构。因此在制备传输载体时，控制硅烷偶联剂的质量分数不超过10%，保持MSNs的结构基本一致。
FTIR是表征PEG链段能否有效接枝到MSNs粒子上的有力测试手段，通过表征样品中叠氮基的数量，可以确定MSNs粒子中叠氮基反应程度。从FTIR测试结果看，MSNs粒子中叠氮基基本消失，这说明定量引入的叠氮基，可以定量的引入PEG链段。TEM和XRD测试结果表明，PEG能够有效接枝到MSNs上，并且能够保持纳米粒子的介孔特性；粒度分析结果显示，PEG修饰的介孔硅纳米粒子粒径保持在100～150 nm。有效的粒径控制和PEG的引入，使纳米粒子在水中具有良好的水分散性和稳定性。
通过负载丹参素发现，纳米粒子的介孔结构能够大量负载丹参素，这有利于提高载体的负载率和负载效率，为高效的传输载体提供了基础。亲水性的PEG接枝MSNs粒子，在纳米粒子外层形成水化层，能够有效提高MSNs-PEG纳米粒子在水溶液中稳定性，而且PEG的接枝，改变了药物的释放规律，能够有效延长丹参素的释放时间，并随着PEG接枝量的提高，能够有效控制丹参素的释放速度。
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