2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.14.004 |
2. 成都大学药学与生物工程学院, 四川 成都 610106 ;
3. 四川大学华西药学院, 四川 成都 610041
2. School of Pharmacy and Bioengineering, Chengdu University, Chengdu 610106, China ;
3. West China School of Pharmacy, Sichuan University, Chengdu 610041, China
姜黄Curcuma Longa Rhizoma为姜黄属植物姜黄Curcuma longa L.的干燥根茎，主产于中国，是我国传统中医药常用药物，具有破血行气、通经止痛之功效。研究表明，以姜黄素（curcumin）、脱甲氧基姜黄素（demethoxycurcumin，DMC）、双脱甲氧基姜黄素（bisdemethoxycurcumin，BDMC）为代表的姜黄素类化合物，以及倍半萜类化合物是姜黄的主要化学成分，目前国内外已经从姜黄中分离得到了10多个不同类型的姜黄素类[1-4]以及二十多个倍半萜类化合物[5-6]。大量的现代药理研究表明，姜黄及其主要化学成分具有广泛的药理活性，包括抗氧化、抗炎症、抗肿瘤及抗老年痴呆症等[7-11]。
为了更深入了解姜黄的化学成分，寻找更多的姜黄素类新化合物，并从中发现具有药用价值的先导性化合物，本实验建立了基于LC-MS分析技术和多种柱色谱技术的中药导向分离方法，以“寻找-定位-纯化-鉴定”为研究思路从姜黄根茎95%甲醇提取物中发现1个具有姜黄素类成分骨架结构的新化合物，通过定位该新化合物所在的提取物流分并进行富集，采用MCI小孔树脂、ODS-C18反相柱色谱及RP-HPLC色谱技术将其分离纯化，并通过NMR技术进行结构鉴定，最终确认新化合物为姜黄素-没药烷型倍半萜二聚体新化合物3, 4′′′-epoxy-5′′′-C-(1α, 2β, 3β-bisabola-4, 10-diene-9-one)-(2→5′′′)-curcumin（1），命名为姜萜素G。体外细胞毒活性检测表明该化合物对HepG2、A549和CT-26肿瘤细胞表现出较强的细胞毒活性。
1 材料与仪器Agilent1100高效液相色谱仪（Agilent Technologies，德国），配有四元泵溶剂洗脱系统，自动进样器及紫外检测仪；Finnigan LCQ Advantage离子肼质谱仪（Thermo Finnigan，San Jose，CA，美国），ESI；YMC-Pack-ODS-A C18 reversed column（250 mm×4.6 mm，5μm）色谱柱及Agilent Zorbax SB-C18（12.5 mm×4.6 mm，5μm）保护柱。核磁共振光谱仪：INOVA-500（1H-NMR 500 MHz，13C-NMR 125 MHz）和JEOL JNM-AL300（1H-NMR 300 MHz，13C-NMR 75 MHz）核磁共振仪；高分辨质谱仪：Bruker APEX IV FT-MS；Varian Cary 300 UV紫外-可见光分光光度仪；Thermo Nicolet Avatar傅里叶红外光谱仪；半制备HPLC分析仪：岛津LC-8AHPLC色谱系统；YMC ODS-A半制备色谱柱（250 mm×10 mm，5μm）；Horiba SEPA-300型数字旋光仪。
常规提取分离用甲醇、醋酸乙酯、丙酮、氯仿等均为分析纯，制备用乙腈为色谱纯，成都科龙化工厂产品；去离子水由纯净水经Millipore Simplicity纯水系统制备。小孔树脂（MCI-GEL）购自成都科贸有限公司；ODS反相色谱填料均在成都迪维乐普公司购买；柱色谱用凝胶Sephadex LH-20（25～100μm）为Pharmacia公司产品；薄层色谱用硅胶GF254购自青岛海洋化工厂。
本实验姜黄样品于2013年12月采自四川乐山犍为县，药材标本（编号201312）经西华大学制药工程系何宇新教授鉴定为姜黄Curcuma longa L.的干燥根茎。
2 新化合物的导向发现 2.1 药材提取物流分的分段处理将1 kg姜黄药材干燥后粉碎到40目，以10倍量95%甲醇，加热回流提取3次，每次2 h，合并3次提取液，减压浓缩得浸膏200 g。以甲醇-氯仿（3:4、9:10、99:1）经MCI-GEL梯度洗脱，分别获得流分1～3。将流分1～3经LC-MS检测，寻找姜黄素类新化合物。
2.2 LC-MS检测条件流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B）；洗脱程序：0～30 min，40%～50% A；30～35 min，50%～65% A；35～42 min，65%～70% A；42～55 min，70% A；55～60 min，70%～100% A；柱温30℃；体积流量1.0 mL/min；检测波长425 nm。质谱参数设定：ESI电离源，扫描模式：负离子扫描；扫描范围m/z 120～1 200；源电压4.0 kV；毛细管温度320℃；毛细管电压30.0 V；透镜补偿电压−40.0 V；源裂解电压10.0 V。
2.3 姜黄素类化合物特征性质谱裂解规律及UV吸收实验结果表明在(−) ESI-MS/MS模式下，姜黄素的特征性裂解行为：m/z 367→217→173 [M－H]−，而作为二苯基庚酸类化合物，拥有不饱和双键，其在UV下的特征性最大吸收波长位于425 nm，与已有报道一致[12-13]。
2.4 流分1～3的LC-MS质谱分析对流分1、2中的色谱峰进行了质谱检测，实验结果表明流分1和2中色谱峰的相对分子质量、质谱裂解规律和已报道姜黄素类化合物包括姜黄素、脱甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素等相对分子质量一致[14]，没有发现新的姜黄素类天然产物。在流分3的分析中，本实验以导向分离的思路发现1个新的姜黄素类天然产物（化合物1），过程如下：（1）化合物1的UV λmax为426 nm，为姜黄素类化合物的特征吸收，见图 1；（2）化合物1的分子离子峰为m/z 583 [M－H]−（图 1），大于已知姜黄素的分子离子峰m/z 367 [M－H]−，在MS2裂解中发现化合物1的碎片离子具有[M－H]− m/z 217、[M－H]− m/z 173的姜黄素结构的特征碎片离子，证明化合物1是一个具有姜黄素类化合物骨架结构、但相对分子质量远比姜黄素更大的化合物；（3）对已报道的姜黄素类化合物数据库进行全面的文献检索和查询，没有任何文献报道类似结构的化合物在自然界中分离得到。
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图 1 化合物1的MS1、MS2图谱及最大UV吸收波长 Fig.1 MS1, MS2 spectra, and UVmax of compound 1 |
综合以上信息，推测化合物1是一个具有姜黄素母核结构的化合物，并且具有更大的相对分子质量和更复杂的结构，所以将化合物1作为目标化合物进行分离纯化。
3 提取与分离采用中压柱色谱系统，将“2.1”项中流分3浸膏用ODS反相色谱柱经甲醇-水（40:60、55:45、60:40、75:25和95:5）洗脱，得到5个洗脱部位：FIII-1（0.5 g）、FIII-2（1.5 g）、FIII-3（2 g）、FIII-4（1.5 g）和FIII-5（1 g）。FIII-4（1.5 g）和FIII-5（1 g）进一步以甲醇为洗脱液，在Sephadex LH-20凝胶柱色谱上除杂，得到FIII-4-3（400 mg）、FIII-5-3（200 mg）、FIII-5-4（20 mg）。再将3个洗脱部位以HPLC制备液相色谱（岛津LC-8AHPLC色谱系统；YMC ODS-A柱，250 mm×10 mm，5μm）在乙腈-水系统中制备分离。洗脱部位FIII-5-4（20 mg）经制备液相色谱得到化合物1（12 mg，乙腈-水48:52，体积流量3.0 mL/min，tR＝160 min）。
4 结构鉴定化合物1为黄色无定形粉末，经高分辨质谱（HR-ESI-MS）测定m/z 607.266 69 [M+Na]+（计算值607.266 62），得出分子式为C36H40O7，不饱和度为17，mp 93～98℃；[α]D25 −219°(c 0.15, CH3OH)；(nm): 426 nm；IR波谱显示3 423 cm−1的1个自由羟基强吸收，1 718，1 627 cm−1的2个羰基的吸收峰，以及1 512 cm−1的苯环吸收峰。13C-NMR数据（表 1）与DEPT波谱数据同样表明该化合物有36个C信号，包括6个甲基碳（2个甲氧基碳同在δC 55.4处）、2个亚甲基、4个次甲基、12个亚乙烯基以及12个季碳（包括3个羰基碳δC 183.6, 183.6, 199.1）。1H-NMR总共发现12个烯属氢原子，其中2对反式-α, β-不饱和双键(δH 6.58, d, J=15.6 Hz和δH7.47, d, J=15.6 Hz; δH 6.60, d, J=15.6 Hz和δH 7.53, d, J=15.6 Hz)；1组ABX系统氢原子(δH 7.20, s; δH 6.76, d, J=8.4 Hz; δH 7.05, d, J=8.4 Hz)，再加上1个烯属单氢(δH5.87, s)，以上部分核磁数据与姜黄素骨架的特征信号相近[12]，且在LC-MS分析中已证明化合物1具有姜黄素的骨架结构，因此为了快速准确地鉴定复杂化合物1的结构，将姜黄素与化合物1姜黄素类骨架部分的13C、1H-NMR数据进行比对。
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表 1 化合物1与已知化合物的13C-NMR和1H-NMR数据 Table 1 13C-NMR and 1H-NMR data of compound 1 and known curcumin |
由表 1中数据可知，化合物1姜黄素类骨架部分与姜黄素的13C-NMR数据除C-5′′′外，其余几乎完全吻合。化合物1的C-5′′′(δC 132.8)相比姜黄素C-5′′′(δC 115)向低场位移。此外，在化合物1的苯环b中，发现ABX系统的1H-NMR信号消失，只存在2个烯氢质子的信号，化学位移分别为δH7.12和7.13，见表 1。在1H-NMR数据中，与姜黄素数据相比，发现化合物1的H-5′′′信号缺失。以上证据表明，化合物1姜黄素骨架部分在苯环b的5′′′位存在一个取代，不但造成H-5′′′的信号缺失，同时使C-5′′′信号发生位移。
除化合物1姜黄素骨架部分的13C-NMR与1H-NMR信号外，其余信号皆来自于化合物1的侧链取代基团，经过分析发现其13C-NMR和1H-NMR数据与已知化合物类似，故将两者数据进行对比，以确定结构。通过与文献进行比对[6]，发现其与没药烷型倍半萜（bisabolane）：2-methoxy-5-hydroxybisabola-3, 10-diene-9-one相近。结合HSQC数据，将化合物1的倍半萜类侧链中的13C-NMR与1H-NMR数据归属如下：2个三取代乙烯基和2个季碳[δC 127.1 (δH 5.71, d, J=4.8 Hz), δC 130.3, δC 123.7 (δH 5.88, s), δC 153.5]；1个羰基酮碳(δC 199.1)；2个亚甲基[δC 23.4 (δH 1.77, m；δH 1.89, m)；δC 49.8 (δH 2.21, dd, J=6.2, 15.2 Hz；δH2.25, dd, J=7.6, 15.2 Hz)]；4个次甲基[δC 84.7 (δH 4.75, d, J=7.2 Hz)；δC 42.9 (δH 3.11, dd, J=7.2, 11.0 Hz)；δC 38.9 (δH 1.35, dt, J=3.8, 11.0 Hz); δC 27.6 (δH 2.41, m)]；4个甲基[δC 13.6 (δH 0.89, d, J=6.8 Hz); δC 19.5 (δH 1.84, s); δC 19.9 (δH 1.77, s); δC 26.5 (δH 1.62, s)]。
姜黄素骨架与倍半萜骨架的取代位点是该化合物结构鉴定的关键，在图 2中，由1H-1H COSY相关可知，在倍半萜部分的六元环中存在1个H-6 (δH1.77/1.89)→H-1 [δH 1.35 (dt, J=3.8, 11.0 Hz)]→H-2 [δH 3.11 (dd, J=7.2, 11.0 Hz)→H-3 [δH 4.75 (d,J=7.2 Hz)]的可旋转的质子偶合系统，其相互位置由1H-1H COSY以及HMBC远程相关得以确认，见图 2。进一步将H-2 (δH 3.11)与H-3 (δH 4.75)；C-2 (δH 42.9)与C-3 (δH 84.7)的信号加以分析发现，H-3与C-3的信号较H-2与C-2处于更低场，3位应连接1个较强的亲电子基团；此外，在HMBC中发现H-3到C-4′′′(δC 150.2)微弱的远程相关；以及H-2同时与C-5′′′、C-6′′′和C-4′′′极强的远程相关信号，见图 2。加上此前已发现姜黄素骨架部分的5′′′位存在一个取代，造成H-5′′′的信号缺失，以上的数据证明了化合物1中C-3与C-4′′′以3→4′′′的“C-O-C”键方式相连，而C-2与C-5′′′以2→5′′′的“C-C”键方式相连。综上所述，化合物1中的姜黄素骨架部分和倍半萜骨架部分同时以“C-O-C”键和“C-C”键方式相连使其形成了1个新的呋喃五元环（2-3-O-4′′′-5′′′）。
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图 2 化合物1的结构和主要HMBC及1H-1H COSY相关 Fig.2 Structure and key HMBC, and 1H-1H COSY correlations of compound 1 |
化合物1的NOESY实验结果为倍半萜骨架部分相对构型的确立提供了直接依据，结构见图 3。在图谱中，发现明显的H-2与H-3、H-1与H-7的信号相关，证明了H-2与H-3、H-1与H-7之间分别处于顺式构型（cis），而H-3与H-1之间无任何NOE相关处于反式构型（trans）。因此，结合以上证据，化合物1的结构为姜黄素骨架部分与倍半萜侧链部分通过呋喃五元环以“C-O-C”键和“C-C”键相连，确定为3, 4′′′-epoxy-5′′′-C-(1α, 2β, 3β-bisabola-4, 10-diene-9-one)-(2→5′′′)-curcumin；命名为姜萜素G。
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图 3 化合物1的NOESY相关 Fig.3 NOESY correlations of compound 1 |
5 化合物细胞毒活性
由于文献报道姜黄素类化合物具有显著的抗肿瘤活性，本研究采用改良的MTT细胞毒活性测定法[15]，以姜黄素、DMC、BDMC为对照，对化合物1进行了细胞毒活性筛选，所测试的细胞株为HepG2、A549和CT-26（表 2）。结果表明，化合物1对所选3种肿瘤细胞株的IC50值均小于10μmol/L，并优于已报道的3种主要姜黄素类化合物：姜黄素、DMC及BDMC[1-2]，其中对HepG2和CT-26有较高的细胞毒活性，IC50值分别为4.82、5.40μmol/L。
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表 2 化合物1的细胞毒活性 Table 2 Cytotoxic activity of compound 1 |
6 讨论
本实验采用基于LC-MS技术的导向分离法，从姜黄的提取物中发现了具有姜黄素骨架与倍半萜骨架的新化合物1，经提取分离后结构鉴定为3, 4′′′-epoxy-5′′′-C-(1α, 2β, 3β-bisabola-4, 10-diene-9-one)-(2→5′′′)-curcumin；命名为姜萜素G。该化合物的姜黄素与倍半萜部分经过缀合形成呋喃五元环，尚未见已有文献报道类似结构，其可能的生源合成途径见图 4。在本研究中，化合物1的手性碳（C-1/2/3/7）相对构型得到了初步确认，课题组正在累积化合物1质量，将在后续研究中通过X单晶衍射实验进一步确认化合物1的绝对构型。
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图 4 化合物1可能的生源合成途径 Fig.4 Proposed biosynthetic pathway for compound 1 |
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