2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.13.026 |
大黄叶为蓼科（Polygonaceae）植物大黄Rheum officinale Baill的干燥叶，其原植物的根及根茎作为传统中药大黄临床应用，《中国药典》2015年版收载为中药大黄正品之一[1]。现代研究表明，大黄叶具有清热解毒、活血消肿、泻下、止血、生肌、收敛、抗炎、等传统功效与生理活性，主要含有蒽醌类、酚类、鞣质、氨基酸、微量元素等化学成分[2-6]。大黄叶在民间有使用习惯，在藏族医药学中，大黄的叶和柄，习称“秋久”，性温，可治培根病等多种疾病，与大黄的药理作用和化学成分有类似之处[7]。
大黄为中药大黄的主要来源之一，在我国已有多年应用历史。作为药用植物资源，药用大黄叶相对于其根及根茎不仅资源丰富，而且生长快、采收期长，更重要的是大黄叶资源开发和利用具有可持续性，如能对其研究开发利用，将产生很大的经济效益和社会效益。目前尚未见有关大黄叶多成分定量测定报道。为使该资源进一步地充分利用，本实验通过对陕西省镇巴县大黄叶中相关化学成分进行测定，初步探索与其根及根茎中成分的差异性，为大黄叶开发利用提供科学依据。
1 仪器及材料 1.1 仪器Waters 2695高效液相色谱仪（美国Waters公司），包括四元超高压溶剂系统、自动进样恒温样品管理器，Waters2998 PAD检测器，Empower色谱工作站；GB204型电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；KQ-200KED超声波清洗机（江苏昆山市超声仪器有限公司）。
1.2 材料对照品没食子酸（批号122811，质量分数大于99%）、番泻苷B（批号11z15，质量分数大于98%）购自天津西玛科技有限公司；大黄素（批号110795-200505，质量分数大于98%）、大黄酚（批号110796-200615，质量分数大于99%）、大黄酸（批号0757-200206，质量分数大于99%）、大黄素甲醚（批号110758-200610，质量分数大于98%）、芦荟大黄素（批号03071201，质量分数大于99%）、大黄酚-1-O-葡萄糖苷（批号110796-200615，质量分数大于98%）、大黄素-8-O-葡萄糖苷（批号10756-200110，质量分数大于98%）购自中国 食品药品检定研究院。色谱甲醇（批号20150603）上海泰坦科技有限公司；娃哈哈纯净水（批号20150702）杭州娃哈哈集团有限公司；其他试剂均为分析纯。
大黄叶22批样品于2015年8月上旬均采自陕西省镇巴县，经陕西中医药大学胡本祥教授鉴定均为大黄Rheum officinale Baill的叶。大黄叶片样品采集信息见表 1。
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表 1 22批样品采集信息 Table 1 Collected information of 22 samples |
2 方法和结果 2.1 色谱条件
武本C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相由甲醇（A）和0.2%乙酸水（B）组成，梯度洗脱（0～5 min，5%～15% A；5～15 min，15%～30% A；15～25 min，30%～35% A；25～31 min，35%～42% A；31～46 min，42%～53% A；46～66 min，53%～68% A；66～75 min，68%～100% A；75～85 min，100% A），检测波长260 nm，柱温30 ℃，体积流量1.0 mL/min。进样量为10 μL。在上述色谱条件下分析，理论板数按各个成分计算均不低于5 000，与相邻组分峰的分离度均大于1.5，色谱峰对称因子均在0.95～1.05。典型色谱图见图 1。
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图 1 混合对照品 (A) 及样品 (B) HPLC图 Fig.1 HPLC of mixed reference substances (A) and sample (B) |
2.2 溶液的制备 2.2.1 对照品溶液制备
分别取没食子酸、番泻苷B、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚9种对照品适量，精密称定，分别置10 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度分别1.010、1.030、0.202、0.224、0.015、0.010、0.191、0.702、0.025 mg/mL的对照品储备液，分别精密量取上述对照品储备液1 mL至10 mL量瓶中，用甲醇稀释10倍，摇匀，得质量浓度分别为101.0、103.0、20.2、22.4、1.5、1.0、19.1、70.2、2.5 μg/mL没食子酸、番泻苷B、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的混合对照品储备液。4 ℃保存备用。
2.2.2 供试品溶液制备取大黄干燥叶，研细（过60目筛），混匀，取1 g，精密称定，置具50 mL塞锥形瓶中，精密加入45 mL甲醇，称定质量。超声处理（功率500 W，频率40 kHz）30 min，放至室温，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液过0.45 μm微孔滤膜，作为供试品溶液，待测。
2.3 方法学考察 2.3.1 线性关系考察精密量取混合对照品储备液0.1、0.4、0.8、1.6、2.0、3.0 mL，分别置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，得系列混合对照品溶液。按照“2.1”项下色谱条件分别进样10 μL，记录色谱图。分别以对照品溶液质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），进行线性回归，9种待测成分的线性回归方程、线性范围和相关系数（r），见表 2。
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表 2 9种成分回归方程及线性范围 Table 2 Regression equations and linear ranges of nine constituents |
2.3.2 精密度试验
取混合对照品溶液，每次进样5 μL，连续进样6次，记录没食子酸、番泻苷B、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积积分值，计算RSD，分别为0.92%、2.18%、1.76%、1.86%、2.08%、1.42%、0.86%、0.68%、1.56%，表明仪器精密度良好。
2.3.3 稳定性试验精密吸取同8号样品的供试品溶液，分别于制备后的0、2、4、8、16、24 h进样10 μL测定，记录没食子酸、番泻苷B、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚的峰面积积分值，计算RSD，分别为1.48%、1.76%、2.36%、3.24%、2.62%、1.46%、2.12%、0.89%、1.24%，表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.3.4 重复性试验取8号大黄干燥叶粉末样品6份，精密称定，按“2.2.2”项下方法平行制备供试品溶液，分别进样，测定峰面积。计算没食子酸、番泻苷B、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚平均质量分数的RSD，分别为2.15%、2.82%、2.16%、1.72%、2.24%、2.56%、1.82%、1.62%和1.48%，结果表明方法的重复性良好。
2.3.5 加样回收率试验取8号大黄叶样品粉末（过6号筛）各约0.5 g 6份，精密称定，分别加入低、中、高3个质量浓度的对照品溶液（分别相当于大黄叶原有质量分数的80%、100%、120%），每一质量浓度取2份，按“2.2.2”项下方法制备，根据测得量和加入量计算各成分的加样回收率和RSD。结果没食子酸、番泻苷B、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚的的平均回收率分别为98.26%、97.66%、 96.38%、95.76%、 98.64%、96.82%、98.36%、95.84%和96.26%，RSD分别为2.36%、1.84%、1.46%、1.72%、2.43%、2.36%、1.96%、2.03%和1.64%。
2.4 样品测定取22批待测大黄干燥叶样品各20 g，研成细粉，过60目筛。精密称取各样品约1 g，每个样品平行称2份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1”项下色谱条件进行9种化学成分的定量分析，测定各成分峰面积，代入回归方程，计算各成分在样品中的质量分数。结果见表 3。进一步分析结果，1、2、3年生的大黄叶中9种化学成分量，其中游离型蒽醌总量的平均值分别为0.757 5、0.816 5、0.686 2 mg/g；结合型蒽醌总量的平均值分别为0.111 4、0.072 8、0.074 4 mg/g；没食子酸的平均值分别为0.085 5、0.122 3、0.094 9mg/g；番泻苷B的平均值分别为0.564 8、0.389 1、0.291 0mg/g。
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表 3 22批样品中9种成分的测定结果 (n = 3) Table 3 Determination of nine constituents in 22 batches of samples (n = 3) |
3 讨论 3.1 测定成分的筛选
现代研究表明，大黄中主要含有蒽醌类、酚类、鞣质类、氨基酸等多种化学成分，其中没食子酸、(+)-儿茶素、番泻苷A、番泻苷B、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚、大黄素甲醚等的生物活性比较显著[8-10]。根据同一种植物不同器官中化学成分积累的近似性，以及前期预试验结果分析，为了合理开发利用大黄叶片资源，综合分析本实验确定同时检测没食子酸、番泻苷B、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、大黄酚和大黄素甲醚9种成分[11]。
3.2 色谱条件选择本实验分别考察了乙腈-0.05%乙酸水、乙腈-0.1%乙酸水、乙腈-0.2%乙酸水；甲醇-0.05%乙酸水，甲醇-0.1%乙酸水，甲醇-0.2%乙酸水等色谱条件。甲醇-0.2%乙酸水梯度洗脱时，色谱峰分离度良好，最终选择甲醇-0.2%乙酸水的色谱条件研究大黄叶中化学成分。采用PDA检测器在200～400 nm对检测波长进行了考察；结果表明，检测波长在260 nm时色谱图所包含的信息量较大，杂质干扰较少，线性关系和重复性良好，各色谱峰分离较好，参考文献报道[11-12]，故本实验选择检测波长为260 nm。
3.3 样品提取方法考察以9种成分的提取率为指标，考察了2种提取溶剂甲醇和乙醇，结果表明甲醇优于乙醇；考察了甲醇回流、超声2种提取方法，结果表明两者无明显差异；考察了甲醇超声提取30、45、60 min 3种提取时间，结果表明三者也无明显差异。综合分析，提取方法最终确定为甲醇超声30 min。
3.4 结果分析从测定结果分析，1、2、3年生的大黄叶中9种化学成分量，其中游离型蒽醌总量的平均值分别为0.757 5、0.816 5、0.686 2 mg/g，其中2年生的最高；结合型蒽醌总量的平均值分别为0.111 4、0.072 8、0.074 4 mg/g，其中1年生的最高；没食子酸的平均值分别为0.085 5、0.122 3、0.094 9mg/g，其中2年生最高；番泻苷B的平均值分别为0.564 8、0.389 1、0.291 0mg/g，其中1年生最高；分析其原因与生长年限有关，同时还与大黄化学成分在其地上、地下部位的积累和转运规律相关。至于光照、水分、伴生物等其他因素有待进一步研究分析。
另外，与《中国药典》2015年版对大黄药材中游离蒽醌总量要求不能低于0.20%要求比较，大黄叶中的游离蒽醌总量超过0.20%，这将为大黄叶的开发应用提供理论依据。
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