2016, Vol. 47
引用本文 | doi: 10.7501/j.issn.0253-2670.2016.13.025 |
2. 天士力制药集团股份有限公司 创新中药关键技术国家重点实验室, 天津 300410 ;
3. 中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所, 北京 100193 ;
4. 中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所 广西分所, 广西 南宁 530002 ;
5. 贵阳中医学院, 贵州 贵阳 550025 ;
6. 中国医学科学院 北京协和医学院药用植物研究所 云南分所, 云南 西双版纳 666100
, ZHOU Gui-rong2, HUO Zhi-peng2, HE Yi2, GUO Bao-lin3, YU Li-ying4, WEI Sheng-hua5, LI Hai-tao6, LI Ping1
2. State Key Laboratory of Critical Technology in Innovative Traditional Chinese Medicine, Tianjin Tasly Group Co., Ltd., Tianjin 300410, China ;
3. Institute of Medicinal Plant Development, Chinese Academy of Medical Science, Beijing 100193, China ;
4. Botanical Garden of Guangxi Medicine, Chinese Academy of Medical Science, Nanning 530002, China ;
5. Guiyang University of Traditional Chinese Medicine, Guiyang 550025, China ;
6. Botanical Garden of Xishuangbanna South Medicine, Chinese Academy of Medical Science, Xishuangbanna 666100, China
羊耳菊Inula cappa (Buch. -Ham.) DC. 为菊科（Compositae）旋覆花属Inula L. 植物，亚灌木，分布于四川、云南、贵州、广西、广东等地[1]。云南、贵州省和广西壮族自治区中药材标准中收载羊耳菊为全草或地上部分，广东省中药材标准中收载山白芷为羊耳菊干燥根及根茎，具有祛风散寒、解毒消肿、行气化滞、利湿止痛的功效，可用于风热风寒感冒、咽喉肿痛、食积不化、胸膈痞闷、风湿疼痛等[2-5]。
羊耳菊在贵州、云南、广西等地及民族用药使用较多，但研究比较薄弱，文献报道数量较少，多为药材的化学成分研究[6-9]及二咖啡酰基奎宁酸类单成分或总黄酮的测定[10-11]。侯靖宇等[12]建立了UPLC-MS/MS同时测定羊耳菊药材中6种成分量的方法。本实验采用UPLC法测定了羊耳菊药材（地上部分）中7种咖啡酰基奎宁酸类成分的量，并结合指纹图谱对不同产地的药材进行分析，建立一种快速全面便捷的羊耳菊药材分析方法，也为含有羊耳菊制剂的质量控制提供参考。
1 仪器与试药 1.1 仪器ACQUITY超高效液相色谱系统（美国Waters公司，包括二元梯度泵、真空脱气机、自动进样器、柱温箱、TUV检测器、Empower2工作站），XS205电子天平（瑞士Mettler Toledo公司），粉碎机（MF10，德国IKA公司），ST16R高速冷冻离心机（美国Thermo公司），Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司），KQ-500DV超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。
1.2 试药乙腈、甲醇（色谱纯，北京欧姆尼科技有限公司），乙酸（色谱纯，天津市康科德科技有限公司），超纯水（Milli-Q制备），1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸（中国食品药品检定研究院，批号201402，质量分数94.5%），1,5-O-二咖啡酰基奎宁酸（天津士兰科技有限公司，批号2015104，质量分数98.6%），3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸（中国食品药品检定研究院，批号201405，质量分数92.0%），4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸（天津一方科技有限公司，批号AB051C，质量分数98.9%），3-O-咖啡酰基奎宁酸（中国食品药品检定研究院，批号201415，质量分数96.2%），4-O-咖啡酰基奎宁酸（天津士兰科技有限公司，批号20150401，质量分数98.3%），5-O-咖啡酰 基奎宁酸（天津士兰科技有限公司，批号20150104，质量分数98.7%）。
1.3 药材样品采集20批羊耳菊药材地上部分于2013—2015年野外采集于广西、贵州、云南3个省，采集后阴干即得，置于20 ℃，相对湿度小于40%的环境中避光保存，分别经中国医学科学院药用植物研究所广西分所余莉莹研究员、贵阳中医学院汪毅教授和中国医学科学院药用植物研究所云南分所李海涛研究员鉴定为菊科（Compositae）植物羊耳菊Inula cappa (Buch. -Ham.) DC. 的干燥地上部分。药材编号、产地与采收时间见表 1。
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表 1 20批羊耳菊药材信息 Table 1 Twenty batches of I. cappa samples |
2 方法与结果 2.1 色谱条件
采用WATERS ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。流动相0.1%乙酸水溶液（A）-乙腈（B），体积流量0.4 mL/min，梯度洗脱程序见表 2，检测波长329 nm，柱温30 ℃，样品管理器温度4 ℃，进样量2 μL。
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表 2 UPLC梯度洗脱程序 Table 2 UPLC gradient elution procedure |
2.2 对照品溶液的制备
分别称取各化合物于25 mL棕色量瓶中，加入40%甲醇配制成含1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸145.0 mg/L、1,5-O-二咖啡酰基奎宁酸513.9 mg/L、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸683.1 mg/L、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸624.8 mg/L、3-O-咖啡酰基奎宁酸639.0 mg/L、4-O-咖啡酰基奎宁酸155.6 mg/L、5-O-咖啡酰基奎宁酸163.5 mg/L的混合对照品储备液。
2.3 供试品溶液的制备20批羊耳菊药材粉碎，取每批样品粉末（过四号筛）各500 mg，精密称定，置于25 mL量瓶中，加入甲醇、0.1%乙酸水（甲醇与0.1%乙酸水体积比为2∶3）的混合溶液20 mL，超声提取30 min（功率500 W，频率40 kHz），放至室温，用提取溶液稀释至刻度，摇匀，12 000 r/min离心10 min，取上清液，即得。
2.4 系统适用性试验取混合对照品储备液和羊耳菊供试品（S10）溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测，记录色谱图，见图 1。供试品中7种成分的理论塔板数均不低于6 000，分离度大于1.5，说明本实验方法系统适用性良好。
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图 1 混合对照品 (A) 和羊耳菊样品 (S10,B) UPLC图 Fig.1 UPLC of mixed reference substances (A) and I. cappa (S10,B) |
2.5 羊耳菊药材7种成分测定 2.5.1 线性关系考察
精密吸取“2.2”项下的混合对照品储备液，加40%甲醇稀释2、5、10、20、50、100倍，得到6个不同质量浓度梯度的对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以7种成分的质量浓度为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行标准曲线回归，计算标准曲线方程及相关系数，见表 3。
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表 3 7种成分线性方程 Table 3 Linear regression equations of seven constituents |
2.5.2 精密度试验
精密称取羊耳菊药材（S10）500 mg，按“2.3”项下方法制得供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，供试品中7种待测成分峰面积的RSD值范围为1.2%～1.6%，表明本方法精密度良好。
2.5.3 重复性试验精密称取羊耳菊药材（S10）6份，各500 mg，按“2.3”项下方法平行制得6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，计算供试品中7种成分的量，其RSD值范围为2.2%～2.9%，表明本方法重复性良好。
2.5.4 稳定性试验精密称取羊耳菊药材（S10）500 mg，按“2.3”项下方法制得供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0、1、2、3、4、6、8、12 h进样，计算供试品中7种成分峰面积的RSD值，其范围为1.2%～2.5%，表明供试品溶液在4 ℃时于12 h内稳定。
2.5.5 加样回收率试验精密称取已测定（S10）的羊耳菊样品6份，各250 mg，置于25 mL量瓶中，分别精密加入7种对照品溶液适量，按照“2.3”项下供试品制备方法制得供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，计算7种成分的加样回收率。1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸、1,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、3-O-咖啡酰基奎宁酸、4-O-咖啡酰基奎宁酸、5-O-咖啡酰基奎宁酸的平均回收率分别为98.92%、102.35%、98.44%、101.86%、100.82%、101.68%、99.28%；RSD值分别为2.9%、2.3%、2.1%、1.7%、1.5%、0.92%、2.9%。
2.5.6 样品测定精密称取20份羊耳菊样品，按“2.3”项下方法制得供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样，测定峰面积，代入回归方程，计算7种成分在药材中的量。各样品测定结果见表 4。
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表 4 羊耳菊中7种成分的量 Table 4 Contents of seven constituents in I. cappa |
2.6 羊耳菊药材指纹图谱研究 2.6.1 羊耳菊药材指纹图谱的建立
分别称取20批羊耳菊药材，按“2.3”项下方法制得供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样检测，指纹图谱色谱图见图 2。采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”软件对羊耳菊指纹图谱进行处理，确定20个共有峰，按中位数法生成对照指纹图谱，见图 3。选择13号峰（3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸）为参比峰，计算20个共有峰的相对保留时间及相对峰面积。20批羊耳菊药材指纹图谱与对照指纹图谱的相似度见表 5。
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图 2 20批羊耳菊的UPLC指纹图谱 Fig.2 UPLC fingerprints of 20 batches of I. cappa |
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图 3 羊耳菊对照指纹图谱 Fig.3 Reference fingerprint of I. cappa |
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表 5 20批羊耳菊UPLC指纹图谱与对照指纹图谱的相似度 Table 5 Similarity of UPLC fingerprint and reference fingerprint of 20 batches of I. cappa |
2.6.2 精密度试验
精密称取羊耳菊药材（S10）500 mg，按“2.3”项下方法制得供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜2%，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱技术要求。
2.6.3 重复性试验精密称取羊耳菊药材（S10）6份，各500 mg，按“2.3”项下方法平行制得6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样分析，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜2%，符合指纹图谱技术要求。
2.6.4 稳定性试验精密称取羊耳菊药材（S10）500 mg，按“2.3”项下方法制得供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别在0、1、2、3、4、6、8、12 h进样，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD＜2%，表明供试品溶液在4 ℃时于12 h内稳定。
2.7 数据分析 2.7.1 单因素方差分析为了分析羊耳菊中化学成分差异是否与产地有关，采用SPSS 19.0统计软件，将产地作为观测变量，将羊耳菊中7种成分的量及与指纹图谱的相似度共8个因素作为控制变量进行单因素方差分析。结果显示，显著性水平α为0.05时，1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸、1,5-O-二咖啡酰基奎宁酸2种成分量在产地间存在显著差异，其余6个因素受产地的影响不显著。
2.7.2 聚类分析以20批羊耳菊中7种成分的量及与对照指纹图谱的相似度共8个因素为变量，采用SPSS 19.0统计软件对样品进行聚类分析。以组间平均链锁距离（Between groups linkage）及欧氏距离（Euclidean distance）作为样品测度，采用Q型聚类进行聚类分析，聚类树状图见图 4。
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图 4 20批羊耳菊聚类分析 Fig.4 Cluster analysis of 20 batches ofI. cappa |
根据聚类树状图，S9为异常数据点，将其排出，因此可将其余19批样品分为二类，S3、S5、S7、S8、S17为一类，其余样品为一类，如要得到更加全面的聚类结果，需要增加羊耳菊样品的数量。
2.7.3 主成分分析在聚类分析的基础上，对原有变量进行主成分分析。提取出2个主成分PC1、PC2，2个因子的贡献率分别为51.86%、22.53%，累计贡献率为74.39%。PC1主要代表羊耳菊中4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、3-O-二咖啡酰基奎宁酸、4-O-二咖啡酰基奎宁酸的量，PC2主要代表羊耳菊中1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸、1,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、5-O-二咖啡酰基奎宁酸的量。根据2个主成分的得分系数，计算20个样品的PC1、PC2得分变量的变量值，并以PC1、PC2得分变量值为横纵坐标作散点图，见图 5。根据图 5中信息，广西壮族自治区样品分布比较集中，表明广西壮族自治区样品均一性强。
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图 5 样品主成分得分变量散点图 Fig.5 Score plot of variable of principle component analysis |
3 讨论
考察了不同比例的提取溶剂（20%、40%、60%、80%、100%甲醇和20%、40%、60%、80%、100%乙醇），不同的提取方式（回流、超声、索氏提取），不同的提取时间（30、45、60 min）对指纹图谱的影响，以色谱峰数、峰分离度和基线平稳程度为主要因素，同时在考虑节约能源的基础上，初步选择40%甲醇超声提取30 min作为供试品溶液的制备方法。在方法学的稳定性考察中，使用此制备方法所得的样品，其色谱图中约10.2 min处色谱峰峰面积随着进样时间的延长逐渐减小，这可能是由于待分析成分不稳定造成的，考虑到待分析成分多为酸性物质，在样品制备过程中加入酸可以抑制其解离，提高稳定性，因此将配制40%甲醇的溶液由二纯水改为不同比例的酸水（0.1%甲酸水、0.2%甲酸水、0.1%乙酸水、0.2%乙酸水），在不减少色谱峰数的基础上，经过稳定性考察，最终选择甲醇、0.1%乙酸水（体积比为2∶3）的混合溶液超声提取30 min作为供试品溶液的制备方法。
考察了不同有机相（乙腈、甲醇），不同水相（0.1%磷酸、0.2%磷酸、0.1%甲酸、0.2%甲酸、0.1%乙酸、0.2%乙酸），不同的色谱柱温度（30、35、40 ℃），不同的样品管理器温度（4、10 ℃、不控温）对指纹图谱的影响，最终选择乙腈为有机相，0.1%乙酸为水相进行梯度洗脱，色谱柱温度为30 ℃，样品管理器温度为4 ℃，此条件下基线较平稳、色谱峰峰数较多，峰形较好，分离效果较佳，样品稳定性更好。采用PDA检测器对样品进行全波长扫描，比较各波长下指纹图谱的峰数、基线及响应值，最终选择329 nm为检测波长，此条件下，羊耳菊中所测7种成分的响应均较高，且指纹图谱的峰数较多，基线较平稳。
本实验采用UPLC法测定了20批羊耳菊药材中7种咖啡酰基奎宁酸类成分的量，并进行了指纹图谱研究。结果显示，20批样品中1,3-O-二咖啡酰基奎宁酸、1,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、3,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、4,5-O-二咖啡酰基奎宁酸、3-O-咖啡酰基奎宁酸、4-O-咖啡酰基奎宁酸、5-O-咖啡酰基奎宁酸的范围分别为0.067～1.860、0.383～8.859、2.886～15.398、3.152～21.185、1.081～7.205、0.358～1.828、0.308～1.410 mg/g。
通过单因素方差分析，有2种成分的量在3个产地间存在显著差异，这种差异是否与产地的药效差异相关可通过后续药效实验验证。聚类分析的结果显示，样品的分类存在产地交叉现象，此结果可为扩大羊耳菊产区提供参考。主成分分析的结果表明广西壮族自治区羊耳菊样品均一性强。本实验所做的单因素方差分析，聚类分析及主成分分析并未将样品的采收时间作为变量考察，如要得到数据结果与采收时间的关联性，后续可收集不同采收时间的样品量，并结合地理位置进行分析。
本实验进行羊耳菊地上部分的研究，避免药材的破坏性采集，有利于野生药材资源的保护。本方法在20 min内完成，提高了分析效率，可为羊耳菊及相关制剂的质量控制提供参考。
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