茄科（Solanaceae）枸杞属Lycium L. 植物国产7种3变种；其果实、根或叶在各地多药用或作为保健品食用，具有很高的药用及经济价值^[1]。《中国药典》2015年版^[2]规定中药枸杞子的基原植物为该属宁夏枸杞Lycium barbarum L.，但实际应用情况较为复杂，该属一些近缘植物的红色果实亦作为混淆品使用^[3]。同时，宁夏枸杞及枸杞Lycium chinense Mill. 的干燥根皮作为中药地骨皮入药。

因枸杞属植物近缘物种形态相近，营养器官变异幅度较大，加上产地、环境等因素的影响，应用传统鉴定方法存在一定局限性。近年来，随着分子生物学技术的快速发展，植物DNA序列被大量应用于药用植物的分子鉴定，显示出极大的优势^[4-6]。然而，对于亲缘关系相近的物种，仅凭单一DNA序列片段常无法提供很好的物种分辨率；往往通过筛选大量多基因组序列，寻找多片段组合有效物种鉴定信息，以提升鉴别效率。

目前，已有学者^[3]进行枸杞类核基因组ITS2条形码鉴定等工作，取得一定进展。在参考国内外相关研究工作的基础上，本课题组扩大国产枸杞属近缘物种采集数量，并进一步开展了核基因组ITS区、叶绿体基因组matK、rbcL、rpoC1、trnL(UAA)intron、psbA-trnH、atpB-rbcL、trnS(GCU)-trnG(UCC)、rpl20-rps12、trnL(UAA)-trnF(GAA)及线粒体基因组nad1第2内含子（nad1/b-c）和nad5第4内含子（nad5/d-e）序列（共12个片段）的筛选，评价各片段的物种鉴定意义，寻找稳定、高效的片段组合，构建各物种的DNA条形码，以期为国产枸杞属药用植物物种鉴定及遗传背景分析提供基础资料。

标本均为自采，同时取新鲜叶片，经硅胶快速干燥，备用。凭证标本经赵志礼教授鉴定，存放于上海中医药大学中药学院药用植物标本室，样品信息及鉴定结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 样品与凭证标本 Table 1 Samples and voucher specimens 植物名称 凭证标本 采集地 黑果枸杞Lyciumruthenicum NX2015001 宁夏同心县河西镇 黄果枸杞L.barbarumvar.auranticarpum NX2015002 宁夏同心县河西镇 宁夏枸杞-1L.barbarum宁夏枸杞-2L.barbarum NX2015003-1 宁夏同心县河西镇 NX2015003-2 宁夏同心县河西镇 枸杞-1L.chinense枸杞-2L.chinense SH2015001 上海中医药大学百草园 SH2015002 上海中医药大学百草园 新疆枸杞-1L.dasystemum新疆枸杞-2L.dasystemum 2015LZ001-1 甘肃兰州白塔山 2015LZ001-2 甘肃兰州白塔山 全萼秦艽Gentianalhassica（外类群） XZ201303-1 西藏米拉山口山坡草地

表 1 样品与凭证标本 Table 1 Samples and voucher specimens

取上述干燥植物叶片，液氮中研磨成粉末，采用改良CTAB法^[7]进行总DNA提取。

对核糖体ITS区、叶绿体matK、rbcL、rpoC1、trnL(UAA)intron、psbA-trnH、atpB-rbcL、trnS(GCU)-

trnG(UCC)、rpl20-rps12、trnL(UAA)-trnF(GAA)

及线粒体nad1/b-c和nad5/d-e共12个片段进行扩增，引物及PCR反应条件参考相关文献方法^[8-9]。扩增产物经电泳确认有清晰目的条带后送上海生工生物有限公司纯化并测序（ABI 3730xl型测序仪）。

各片段的起止范围参考GenBank中相关序列。应用MEGA 5.03软件计算ITS区各段的碱基量，并计算成对比较时的位点变异值及K2P遗传距离。各物种的ITS区、叶绿体DNA和线粒体DNA序列分别应用ClustalW对齐，分析变异位点。

直接测序法获得108条序列，全部上传至GenBank，共获得108个登录号（表 2）。物种内各样品间序列均分别一致。

表 2(Table 2)

表 2 序列GenBank登录号 Table 2 GenBank accession numbers 物种 ITS matK rpoC1 trnL rbcL trnS-trnG psbA-trnH atpB-rbcL rpl20-rps12 trnL-trnF nad1/b-c nad5/d-e 黑果枸杞 KT906358 KT906308 KT906328 KT906333 KT906318 KT906343 KT906313 KT906303 KT906323 KT906338 KT906348 KT906353 黄果枸杞 KT906359 KT906309 KT906329 KT906334 KT906319 KT906344 KT906314 KT906304 KT906324 KT906339 KT906349 KT906354 宁夏枸杞-1 KT906360 KT906310 KT906330 KT906335 KT906320 KT906345 KT906315 KT906305 KT906325 KT906340 KT906350 KT906355 宁夏枸杞-2 KU314470 KU314446 KU314458 KU314461 KU314452 KU314467 KU314449 KU314443 KU314455 KU314464 KU314473 KU314476 枸杞-1 KT906361 KT906311 KT906331 KT906336 KT906321 KT906346 KT906316 KT906306 KT906326 KT906341 KT906351 KT906356 枸杞-2 KU314471 KU314447 KU314459 KU314462 KU314453 KU314468 KU314450 KU314444 KU314456 KU314465 KU314474 KU314477 新疆枸杞-1 KT906362 KT906312 KT906332 KT906337 KT906322 KT906347 KT906317 KT906307 KT906327 KT906342 KT906352 KT906357 新疆枸杞-2 KU314472 KU314448 KU314460 KU314463 KU314454 KU314469 KU314451 KU314445 KU314457 KU314466 KU314475 KU314478 全萼秦艽 KJ947801 KJ947441 KJ947631 KJ947676 KJ947541 KJ947766 KJ947491 KJ947394 KJ947586 KJ947721 KP718881 KR184744

表 2 序列GenBank登录号 Table 2 GenBank accession numbers

ITS区序列分析显示，枸杞属5种样品的ITS区长度范围在611～630 bp，其中ITS1长度为222～241 bp，5.8 S区均为164 bp，ITS2长度为220～225 bp。任意两组序列比较，均有位点变异情况，变异位点数为14～56；同时，每个物种均有可与其他4个物种区分的鉴别位点，其中新疆枸杞鉴别位点最为丰富，共有22个。K2P遗传距离变异幅度为0.025～0.107，新疆枸杞与其他物种的遗传距离相对较远（表 3和表 4）。

表 3(Table 3)

表 3 ITS区序列信息 Table 3 Basic information of ITS sequences 物种 占比/% 长度/bp 鉴别位点数 T C A G ITS1 5.8S ITS2 总长 黑果枸杞 19.31 32.57 18.49 29.62 222 164 225 611 7 黄果枸杞 19.42 32.04 18.93 29.61 229 164 225 618 5 宁夏枸杞 20.32 31.04 19.04 29.60 241 164 220 625 18 枸杞 18.25 33.81 17.14 30.79 241 164 225 630 7 新疆枸杞 20.00 32.06 19.68 28.25 241 164 225 630 22

表 3 ITS区序列信息 Table 3 Basic information of ITS sequences

表 4(Table 4)

表 4 ITS序列成对比较时的位点变异值 (上三角：变异位点；下三角：K2P遗传距离) Table 4 Pairwise comparison on ITS sequences of point mutations (above diagonal) and K2P genetic distance (below diagonal) 物种 黑果枸杞 黄果枸杞 宁夏枸杞 枸杞 新疆枸杞 黑果枸杞 — 14 53 33 56 黄果枸杞 0.025 — 48 34 55 宁夏枸杞 0.098 0.088 — 38 54 枸杞 0.059 0.061 0.069 — 41 新疆枸杞 0.107 0.102 0.100 0.075 —

表 4 ITS序列成对比较时的位点变异值 (上三角：变异位点；下三角：K2P遗传距离) Table 4 Pairwise comparison on ITS sequences of point mutations (above diagonal) and K2P genetic distance (below diagonal)

基于叶绿体DNA序列比对，各物种的atpB-rbcL、rpoC1和rbcL序列分别完全一致，无变异位点；而其他6个片段均具有变异位点，且每个物种均具有鉴别位点（表 5）。基于trnL(UAA)intron片段可鉴别黑果枸杞；trnL(UAA)-trnF(GAA) 和psbA-trnH片段均可鉴别黄果枸杞；rpl20-rps12片段可鉴别宁夏枸杞和枸杞；trnS(GCU)-trnG(UCC)片段可鉴别新疆枸杞。黄果枸杞的鉴别位点最为丰富，其中trnL(UAA)-trnF(GAA)片段中有1个，psbA-trnH片段中有10个。

表 5(Table 5)

表 5 叶绿体DNA片段变异位点信息 Table 5 Variable sites of chloroplast DNA segments 物种 matK/bp rpl20-rps12/bp trnL/bp trnL-trnF/bp trnS-trnG/bp psbA-trnH/bp 206 508 61c 208d 681 159a 381 31 306b 311 377 429e 10个位点b 220 313 黑果枸杞 C G C C T A C C A A A C — G G 黄果枸杞 C G C C T G C C G A A C * G G 宁夏枸杞 A A A C C G T A A T T C — T T 枸杞 A A C A C G T A A T A C — G T 新疆枸杞 A A C C C G T A A T T A — T T a-黑果枸杞鉴别位点 b-黄果枸杞鉴别位点 c-宁夏枸杞鉴别位点 d-枸杞鉴别位点 e-新疆枸杞鉴别位点 黄果枸杞的10个鉴别位点 a-black fruit wolfberry loci identified b-cambogia wolfberry differential sites c-means Ningxia wolfberry differential sites d-lysergic wolfberry differential sites EUI of L.barbarum differential sites psbA-trnH sequence cambogia medlar ten loci identified

表 5 叶绿体DNA片段变异位点信息 Table 5 Variable sites of chloroplast DNA segments

基于线粒体DNA序列比对，nad1/b-c片段具有1个变异位点；nad5/d-e片段具有3个变异位点，基于此2个片段可鉴别枸杞和黄果枸杞（表 6）。

表 6(Table 6)

表 6 线粒体DNA片段变异位点信息 Table 6 Variable sites of mitochondrial DNA segments 物种 nad5/d-e变异位点/bp nad1/b-c变异位点/bp 597a 704 880b 902 黑果枸杞 T A A T 黄果枸杞 T A C T 宁夏枸杞 T C A G 枸杞 G C A G 新疆枸杞 T C A G a-枸杞鉴别位点 b-黄果枸杞鉴别位点 a-lysergic wolfberry differential sites EUI of L.barbarum differential sites b-cambogia wolfberry differential sites

表 6 线粒体DNA片段变异位点信息 Table 6 Variable sites of mitochondrial DNA segments

综合以上分析，ITS区及筛选出的6个叶绿体DNA片段均具有物种鉴别意义；线粒体DNA 2个片段可鉴别枸杞、黑果枸杞和黄果枸杞，但不能区别宁夏枸杞及新疆枸杞2个物种。为提高DNA条形码的实用性及可操作性，分别选取各基因组鉴别位点最为丰富的片段，进一步优化组合，提出该物种的DNA条形码鉴定序列（表 7）。

表 7(Table 7)

表 7 枸杞属5种植物物种鉴定DNA条形码推荐序列组合 Table 7 Proposed DNA barcoding markers for five taxa of Lycium L. 物种 序列组合 黑果枸杞 ITS、trnL(UAA)intron、nad5/d-e、nad1/b-c 黄果枸杞 ITS、psbA-trnH、nad5/d-e、nad1/b-c 宁夏枸杞 ITS、rpl20-rps12 枸杞 ITS、rpl20-rps12、nad5/d-e、nad1/b-c 新疆枸杞 ITS、trnS(GCU)-trnG(UCC)

表 7 枸杞属5种植物物种鉴定DNA条形码推荐序列组合 Table 7 Proposed DNA barcoding markers for five taxa of Lycium L.

分别将各样品的ITS区、9个叶绿体片段和2个线粒体片段组合，以全萼秦艽为外类群，基于所有序列构建NJ系统树（Kimura 2-parameter模型，bootstrap 1 000次重复）。结果显示，外类群首先单独区分开；宁夏枸杞和新疆枸杞聚为一小支，再与枸杞聚为一支；黑果枸杞和黄果枸杞聚为一支（图 1）。

图 1 基于所有DNA序列构建的NJ系统树 Fig.1 NJ phylogenetic tree based on all DNA sequences

鉴于植物物种进化程度、物种数量的多样性及各自遗传背景的复杂性等，构建相应的DNA条形码是一项长期艰巨的系统工作。核基因组核糖体DNA ITS区因其具多拷贝^[10]，易扩增、进化速率快及变异位点丰富等特点，常被用作构建条形码的候选序列。但双亲遗传，存在杂合现象，较易受环境等因素影响而发生变异。而被子植物叶绿体和线粒体DNA均为单亲遗传，不存在序列杂合的影响^[11]，且序列较为保守。同时，对来源于植物地下部分的药材（如根、根茎类等）而言，获取线粒体DNA鉴定信息更为可行^[12]。

本实验分别评价了3个基因组12个片段的枸杞属物种鉴别意义，即具物种分辨率的ITS区序列及筛选出的6个叶绿体DNA片段；线粒体DNA 2个片段可鉴别枸杞、黑果枸杞和黄果枸杞，但不能区别宁夏枸杞及新疆枸杞2个物种。为提高DNA条形码的实用性及可操作性，分别选取各基因组鉴别位点最为丰富的片段，进一步优化组合，提出了该物种的DNA条形码鉴定序列，以提升这些条形码的实际应用价值。同时，本实验可为枸杞类遗传背景分析提供基础资料。

据《中国植物志》记载，黄果枸杞为宁夏枸杞一变种，与原种的主要区别在于叶形狭窄，果实橙黄色，种子较少^[1]。而在上述NJ系统树中，黄果枸杞和黑果枸杞聚为一支，与宁夏枸杞相对较远，在基因水平上显示了显著的物种间断特性，提示该分类群可能为一与黑果枸杞近缘的独立物种。陈天云等^[13]发表一新种小叶黄果枸杞，据原始文献描述，该新种与宁夏枸杞相接近，且模式标本采自中宁县；然而令人遗憾的是并未指出其与黄果枸杞的系统关系。本实验DNA数据似支持黄果枸杞独立为一个物种。当务之急是开展该分类群系统位置及合法名称的进一步确定；黄色果实品质的深入评价、栽培学研究及市场开发可行性的分析等。

枸杞属植物栽培历史悠久，同一物种具有不同的品种（系），品种（系）间遗传背景复杂多样，给应用分子手段进行种间区分带来一定难度，特别是变种与原变种的区分^[14-15]。下一步需加大样本量，广泛筛选更多DNA片段，为解决复杂的品种鉴定问题提供坚实的基础资料。