有毒中药钩吻Gelsemii Elegantis Herba为马钱（Loganiaceae）科植物胡蔓藤Gelsemium elegans (Gardn. et Champ.) Benth. 的全草，共有3个种，包括中国钩吻1种和北美钩吻2种^[1]。中国钩吻盛产于闽、浙、桂等地，在民间可用来治疗疼痛、炎症和肿瘤等，具有药用价值。但钩吻是一种毒性植物，民间俗称“断肠草”“大茶药”，民间也常见误食或药食钩吻中毒事件报道。钩吻中毒事件时有发生，主要是误食或被下毒。钩吻中毒尚无特效的解毒剂，中毒后处理原则立即给予催吐、洗胃、导泻，可用活性碳洗胃，血透。然后对症治疗，如给予新斯的明或阿托品^[2]。此外，《本草纲目》记载，人误食断肠草的叶子会致死，而羊食其叶则大肥。猪羊食其叶不但无毒，还会使毛色光润，有增肥和防瘟之效。《广西中药志》也记载：“当猪胃纳不良时，用钩吻（断肠草）饲喂，能增加食欲”。说明钩吻体内药效和代谢存在种属差异性。有报道采用液相色谱-质谱联用对大鼠血浆中钩吻生物碱进行检测^[3]，但设备昂贵不易普及；钩吻生物碱人体内的代谢及动力学研究尚未见报道。目前从钩吻中分离出的生物碱多达49种，钩吻素子（koumine，KM）和钩吻素甲（gelsemine，GM）为中国钩吻中量最多的2种单体成分，因此测定人体液或组织中钩吻素甲和钩吻素子浓度有助于人钩吻中毒鉴定、解救方案的制定，也为钩吻的种属差异性研究提供方法学基础。本研究拟建立人血浆中KM和GM的HPLC测定方法，为钩吻生物碱人体药物临床研究及中毒解救提供参考。

KM和GM，为本课题组从钩吻中分离纯化得到，质量分数达99%以上^[4]；奥卡西平对照品，质量分数98%，批号1001474257，美国Sigma公司

人血浆，由福建医科大学附属协和医院招募的健康志愿者提供。

高效液相色谱仪岛津20A（包括LC-20AB泵，SIL-20A自动进样器，CTO-10Asvp柱温箱，DGU-20AB自动脱气装置，SPD-M20A二极管阵列检测器，CBM-20A系统控制器，LC solution色谱工作站），日本岛津公司产品；Waters固相萃取柱（HLB，1 cc，30 mg）；HSC-12A氮吹仪；奥豪斯电子分析天平CP114。甲醇，乙腈为色谱纯（Fisher Scientific），水为灭菌注射用水（福州海王福药制药有限公司），其他试剂均为分析纯。

色谱柱为Shim-Pack C₁₈色谱柱（250 mm×4.6mm，5 μm）；流动相为甲醇-水-二正丁胺（58∶42∶0.01）；体积流量1.0 mL/min；进样量50 μL；柱温30 ℃；检测波长263 nm。

精密称取GM 5.0 mg和KM 5.0 mg，用20%甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，制得质量浓度分别为500 μg/mL的对照品储备液，置4 ℃冰箱中保存；准确称取内标奥卡西平对照品5.0 mg加入80%甲醇溶解并定容至100 mL量瓶中，使其质量浓度为50 μg/mL，置于4 ℃冰箱中，备用。

取血浆和混合对照品溶液适量加至尖底离心管中配成400 μL的含药血浆，涡旋30 s，再加内标奥卡西平溶液（50 μg/mL）20 μL。涡旋30s，取上清液400 μL加入活化的HLB固相萃取小柱（活化方法：1 mL甲醇和水分别依次过柱）。先用1 mL灭菌注射用水洗柱（萃取液弃去），再用500 μL 5%甲醇洗柱（萃取液弃去），最后用1.5 mL纯乙腈过柱，收集所过柱乙腈，于氮吹仪水浴60 ℃，氮气吹干，80%甲醇150 μL复溶，取50 μL进样分析。

精密吸取GM、KM对照品储备液适量，用空白血浆分别配成质量浓度0.05、0.1、0.5、2.0、10、20 μg/mL的系列含药血浆，与空白血浆分别以“2.3”项方法处理样品后，进样分析。计算GM、KM各自与内标奥卡西平峰面积的比值，以峰面积比值为纵坐标（Y），以质量浓度为横坐标（X），用最小二乘法进行回归运算。以信噪比（S/N）≥10作为最低定量限。求得回归方程：GM为Y＝0.203 4 X－0.05，r＝0.999 4；KM为Y＝0.254 7 X－0.021 9，r＝0.999 5；结果表明GM、KM在0.05～20 μg/mL线性关系良好，最低定量限均为50 ng/mL。

取6份来自不同健康志愿者的血浆，于空白血浆中加入GM、KM对照品储备液及内标溶液制得含药血浆，空白血浆及含药血浆均按照“2.3”项方法操作，取空白血浆、混合对照品溶液（含内标）及含药血浆适量，进样测定，记录色谱图，结果见图 1。按内标奥卡西平、KM、GM顺序出峰，保留时间依次为6.45、9.81、11.78 min，图中各组分峰形较对称，无其他干扰峰，分离效果较好。

图 1 空白人血浆 (A)、对照品溶液＋内标(B) 和含药血浆 (C) HPLC色谱图 Fig.1 HPLC of blank human plasma (A),reference solution +internal standard (B),and plasma containing drug (C)

（1）提取回收率：精确配制同时含GM和KM0.05、5.0、20 μg/mL的含药血浆各5份，以“2.3”项的方法处理样品后，进样分析。另取400 μL空白血浆5份，以“2.3”项的方法处理样品，氮气吹干后残渣分别加入相应质量浓度GM和KM对照品溶液，使其终质量浓度分别为0.05、5.0、20 μg/mL，进样分析。含药血浆经过固相萃取所得的峰面积与相应质量浓度未经固相萃取对照品溶液进样直接所得的峰面积比值计算提取回收率。结果见表 1。

表 1(Table 1)

表 1 GM和KM的精密度及回收率 (x±s,n = 5) Table 1 Precisions and recoveries of GM and KM in human plasma (x±s,n = 5) 成分 ρ/(μg∙mL−1) 提取回收率/% 方法回收率/% 日内精密度 日间精密度 测定值/(μg∙mL−1） RSD/% 测定值/(μg∙mL−1) RSD/% GM 0.05 91.61±5.26 102.91±3.28 0.054±0.006 11.11 0.052±0.005 9.62 5.0 89.52±5.53 97.51±5.13 5.120±0.410 8.00 5.160±0.310 6.00 20 91.52±5.94 95.54±3.96 21.810±2.250 10.32 20.940±1.620 7.74 KM 0.05 87.63±4.55 95.65±5.94 0.055±0.005 9.09 0.053±0.003 5.66 5.0 89.34±6.16 96.97±5.85 5.220±0.640 12.26 5.080±0.460 9.06 20 86.56±7.28 96.32±5.56 22.120±2.330 10.53 21.420±2.140 9.99

表 1 GM和KM的精密度及回收率 (x±s,n = 5) Table 1 Precisions and recoveries of GM and KM in human plasma (x±s,n = 5)

（2）方法回收率：精确配制同时含有GM和KM，质量浓度均为0.05、5.0、20 μg/mL的含药血浆各5份，以“2.3”项的方法处理样品后，进样分析。以“2.4.1”项所得的标准曲线计算测定的质量浓度，以实测质量浓度与理论质量浓度比值计算方法回收率。结果见表 1。

精确配制同时含有GM和KM，质量浓度为0.05、5.0、20 μg/mL的含药血浆各5份，以“2.3”项的方法处理样品后，进样分析。每个质量浓度于1日内分别测定5次，计算日内精密度；每个质量浓度连续测定5 d，计算日间精密度。结果见表 1。

精确配制同时含有GM和KM，质量浓度为0.05、5.0、20 μg/mL的含药血浆，共设置4组，每组含3个质量浓度水平血浆各3份。第1组：置常温避光25 ℃放置，0、3、6、12 h取样，以“2.3”项的方法处理样品后，进样分析；第2组：置4 ℃冰箱放置3 d，以“2.3”项的方法处理样品后，进样分析；第3组：置−20 ℃冰箱放置冷冻后，观察持续15 d，室温融化，以“2.3”项的方法处理样品后，进样分析；第4组：3个质量浓度水平血浆−20 ℃冰箱反复冻融3次，以“2.3”项的方法处理样品后，进样分析。

结果提示，在室温25 ℃避光的条件下保存12 h，GM和KM各质量浓度血浆样品保持稳定，GM高、中、低质量浓度回收率为93.21%～97.35%，KM各质量浓度在室温回收率为90.25%～96.73%；在4 ℃冰箱保存的条件下，第1、2天GM、KM各质量浓度回收率在90%以上波动，在第3天后质量浓度回收率均降至85%以下。在−20℃冰箱保存的条件下，在15 d的观察时间内GM和KM均较为稳定，回收率维持在91%以上；反复冻融结果提示，低、中、高3个质量浓度的GM和KM回收率均在90%以上，且RSD也均小于9%，说明含KM和GM的血浆在反复冻融条件下稳定性较好。

钩吻素生物碱单体在多种实验性疼痛模型上呈现显著的抗慢性疼痛、抗风湿性关节炎等药理作用，且作用机制有别于传统解热镇痛药，且没有依赖性^[5]。钩吻生物总碱有极强的神经毒性，对中枢作用强烈，主要为抑制延髓呼吸中枢，抑制脑和脊髓运动中枢，使呼吸麻痹，呼吸衰竭^[2]。但生物碱单体毒性差别大，其中以KM治疗指数最大，提示钩吻生物碱单体有望开发为临床新型镇痛药的潜在价值^{[6, 7, 8, 9]}。

课题组近几年动物实验研究表明，KM具有较强药理活性，治疗指数高，治疗剂量毒性远小于GM^{[6, 7, 8]}。

人血浆钩吻生物碱浓度检测未见相关文献报道。有报道采用液相色谱-质谱联用对大鼠血浆中钩吻生物碱进行检测^[3]，其设备昂贵不易普及。本研究建立的检测方法采用普通高效液相色谱法进行检测，方法相对简单，设备要求低，易普及。本课题组前期研究KM在大鼠体内药动学及组织分布，对KM的检测方法，采用液液萃取，采用氢氧化钠调节样本pH，醋酸乙酯等提取，操作较为复杂^[10]。本研究改进采取固相萃取方法提取纯化人血浆中钩吻生物碱，操作相对简单，提取回收率高，色谱背景杂峰低。本研究采用奥卡西平作为内标物，因为钩吻生物碱和奥卡西平都含有苯并氮杂环结构，有相似的极性且彼此分离度好，色谱出峰时间较为合适。对GM及KM不同条件下的血浆稳定性进行了考察。结果提示如没有马上检测，放置室温12 h内血浆中GM和KM稳定性较好，也可将血浆于4 ℃冰箱避光保存，但不要超过3 d。如超过不能及时检测，最好于−20 ℃以下冰箱冷冻保存。血浆GM和KM反复冻融稳定也较好。由于伦理问题，目前无法在人身上口服KM和GM后进行检测验证，只能等待有钩吻中毒患者样本。如经过人体代谢，可能产生的代谢产物和原药是否能完好分离。解决此问题，只需在今后实际检测过程中，轻微改变流动相极性即可。

综上，本研究所建立GM和KM检测方法线性范围满足临床检测要求，适合今后GM或KM人体临床药代药效动力学和毒性研究，亦可运用于临床钩吻误食急性中毒后血药浓度监测，制定解救方案。