芪白平肺颗粒（QPG）处方由黄芪、人参等7味药材组成，该方为治疗慢性阻塞性肺疾病的临床经验方，具有益气温阳、化痰散瘀之功效^[1-4]。为了保证处方中人参与黄芪皂苷类成分的转移率，工艺确定为人参与黄芪以70%乙醇提取，药渣与剩余药材再水提。为了简单快速地对人参与黄芪醇提物中化学成分进行鉴定，本实验对人参和黄芪乙醇提取物进行了UPLC-Q-TOF-MS分析，通过准分子离子峰和碎片离子并结合文献资料或与对照品对照，对26个碎片离子峰进行了鉴定，确定了22个离子的化学结构，并推测另外4个离子的化学结构。另外，中药化学成分复杂，在煎煮过程中，随着其中化学成分的溶出，往往会改变溶剂的理化性质，进而影响其他成分的溶出，含皂苷类成分的中药如人参、黄芪等，在提取过程中可形成胶团而发挥增溶作用^[5-7]。为了研究人参黄芪在配伍煎煮时相互之间是否发生了助溶作用，本实验通过主成分分析（PCA），对人参黄芪分提和合提提取液进行了分析，确定了12个化合物的含量发生了变化，并对其结构进行了推测。

Agilent 1290超高压液相色谱仪（美国Agilent公司）；Agilent 6538 Q-TOF质谱仪（美国Agilent公司）；BP211D型电子分析天平（德国Sartorius公司）；Centrifuge 5415D高速离心机（德国Eppendorf公司）；Milli-Q Academic纯水机（美国Millipore公司）；KQ-250DB型超声波清洗仪（昆山市超声波仪器有限责任公司）。

人参Ginseng Radix （GR）和黄芪Astragali Radix（AR）药材经连云港康缘大药房吴舟执业药师分别鉴定为五加科植物人参Panax ginseng C. A. Mey. 的干燥根和根茎；豆科植物蒙古黄芪Astragalus membranaceus (Fisch.) Bge. var. mongholicus (Bge.) Hsiao的干燥根。人参皂苷Rb₁（110704-201223，质量分数95.9%）、Rg₁（110703-201128，质量分数93.4%）、Re（110754-201324，质量分数92.7%）和黄芪甲苷（110781-201314，质量分数95.8%）均购自中国食品药品检定研究院；甲醇（色谱纯，Merck公司）；甲酸（色谱纯，Fluka公司）；Millipore超纯水。

Proshell 120 SB-C₁₈色谱柱（150 mm×4.6 mm，2.7 μm），柱温30 ℃；流动相A为乙腈，B为0.2%甲酸水溶液，线性梯度洗脱：0～2 min，5%～25% A；2～7 min，25%～30% A；7～27 min，30%～38% A；27～35 min，38%～75% A；35～40 min，75%～95% A；40～43 min，95% A；体积流量0.4 mL/min；进样量为10 μL。

电喷雾电离源（ESI），正负离子全扫描检测，扫描范围m/z 50～3 000，加热毛细管温度350 ℃，干燥气体积流量10 L/min，喷雾器压力310 kPa，毛细管电压4 000 V（正离子模式），碎裂电压135 V，锥孔电压65 V。

取人参和黄芪药材，粉碎，过65目筛，按QBPF颗粒处方比例进行配伍，并按照QBPF制备工艺进行提取，离心，取上清，作为合提提取液，平行制备8份。另外，取上述量人参和黄芪分别进行提取，分别平行制备8份，提取液临用前按照处方比例进行合并，混匀，离心，取上清，作为分提提取液。取上述提取液1 mL，加入4 mL甲醇，混匀，放置30 min，离心，取上清，作为供试品。

原始数据文件通过Masshunter B.03.01软件转换为mzData文件后，导入MZmine（version 2.2）进行处理^[8-9]。最终的数据可以CSV的格式导出，以Microsoft Office Excel（Microsoft Corporation）文件格式打开。将原始数据矩阵导入SIMCA-P（version 11.5，瑞典Umetrics公司）软件中，转置后，行对应样品号（observation），列对应变量的峰面积（variables），进行多变量统计分析。

人参与黄芪合提与分提提取液总离子流图见图 1，结合对照品及相关文献数据^[10-11]对比确认化学成分，对26个离子进行了鉴定，其中10个离子来自于人参，为人参皂苷类成分，16个离子来自于黄芪，为黄芪皂苷类成分和黄酮类成分（表 1）。下面以离子5和离子1为例，说明表 1中离子的鉴定过程。离子5保留时间5.38 min，质谱给出m/z 969.540 0 [M＋Na]⁺，表明该化合物相对分子质量为946。进一步对碎片离子进行识别，可发现碎片离子767.494 2 [M－C₆H₁₁O₆]⁺、621.436 6 [M－C₁₂H₂₁O₁₀]⁺、441.372 8 [M－C₁₈H₃₃O₁₆]⁺ 分别为准分子离子依次脱去1个葡萄糖、1个鼠李糖和1个葡萄糖，可以推断化合物1为由2分子葡萄糖、1分子鼠李糖与苷元相连。通过与对照品对照及参考相关文献，确定其为20S-人参皂苷 Re。离子1保留时间为3.78 min，质谱给出m/z 447.129 3 [M＋H]⁺，469.113 3 [M＋Na]⁺，表明该化合物相对分子质量为446。进一步对碎片离子进行识别，可发现碎片离子285.075 8 [M－C₆H₉O₅]⁺为准分子离子脱去1个葡萄糖，可以推断该化合物是由1分子葡萄糖与苷元相连。通过参考相关文献数据^[10-11]，推测其可能为毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、印度黄檀苷、3′-甲氧基-5′-羟基-异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷。

图 1 正离子模式下人参黄芪合提提取液 (A) 和分提提取液 (B) 总离子流图 Fig.1 Total ion chromatogram of mixed decoction (A) and separated decoction (B) of GR and AR

表 1(Table 1)

表 1 人参黄芪提取液化学成分UPLC-Q-TOF-MS数据及结果推测 Table 1 Speculation on UPLC-Q-TOF-MS data of chemical constituents in extract of GR and AR 峰号 tR/min 一级离子 测定值 理论值 误差 分子式 化合物 1 3.78 [M＋H]+ 447.129 3 447.128 6 −1.6 C22H22O10 毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷、印度黄檀苷、3′-甲氧基-5′-羟基- 异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷 2 4.19 [M＋Na]+ 985.535 3 985.534 3 −1.0 C48H82O19 20S-人参皂苷Re1、20S-人参皂苷Re2、20S-人参皂苷Re3、20-葡萄糖基-20S-人参皂苷Rf、20S-三七皂苷N 3 4.65 [M＋H]+ 533.129 3 533.129 0 −0.5 C25H24O13 毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷-6''-O-丙二酸酯 4 5.38 [M＋Na]+ 823.481 8 823.481 4 −0.5 C42H72O14 20S-人参皂苷Rg1 5 5.38 [M＋Na]+ 969.540 0 969.539 3 −0.7 C48H82O18 20S-人参皂苷Re 6 5.58 [M＋H]+ 489.139 3 489.139 1 −0.5 C24H24O11 毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷-6''-O-乙酸酯 7 5.86 [M＋H]+ 431.134 6 431.133 7 −2.0 C22H22O9 芒柄花苷 8 6.75 [M＋Na]+ 485.142 5 485.141 8 −1.5 C23H26O10 (−)-美迪紫檀素-3-O-β-D-葡萄糖苷 9 7.47 [M＋H]+ 465.175 1 465.175 5 0.9 C23H28O10 2'-羟基-3',4'-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D-葡萄糖苷、2',4'-二甲氧基-3'-羟基-异黄烷-6-O-β-D-葡萄糖苷、3'-羟基-2',4'-二甲氧基异黄烷-7-O-β-D-葡萄糖苷 10 7.69 [M＋H]+ 285.075 9 285.075 7 −0.7 C16H12O5 毛蕊异黄酮 11 10.18 [M＋Na]+ 823.482 2 823.481 4 −1.0 C42H72O14 20S-人参皂苷Rf 12 11.28 [M＋Na]+ 793.471 9 793.470 9 −1.3 C41H70O13 20S-人参皂苷R2 13 13.55 [M＋Na]+ 1 131.593 3 1 131.592 2 −1.0 C54H92O23 20S-人参皂苷Rb1 14 14.85 [M＋H]+ 269.080 6 269.080 8 0.7 C16H12O4 芒柄花黄素 15 15.17 [M＋Na]+ 1 233.624 6 1 233.623 9 −0.6 C58H98O26 20S-人参皂苷Ra1 16 15.48 [M＋Na]+ 979.488 7 979.487 3 −1.4 C48H76O19 人参皂苷Ro 17 15.52 [M＋H]+ 301.107 5 301.107 1 −1.2 C17H16O5 (−)-美迪紫檀素 18 15.83 [M＋Na]+ 807.451 8 807.450 1 −2.1 C41H68O14 黄芪皂苷Ⅳ 19 16.52 [M＋Na]+ 807.450 1 807.450 1 0.0 C41H68O14 黄芪皂苷Ⅲ、异黄芪皂苷Ⅳ 20 16.58 [M＋Na]+ 1 107.582 7 1 107.581 6 −1.0 C53H90O22 20S-人参皂苷Rb3 21 16.87 [M＋H]+ 303.123 1 303.122 7 −1.2 C17H18O5 (3R)-8,2'-二羟基-7,4'-甲氧基异黄烷 22 20.00 [M＋Na]+ 969.539 4 969.539 3 −0.1 C48H82O18 20S-人参皂苷Rd 23 21.76 [M＋Na]+ 849.461 6 849.460 7 −1.1 C43H70O15 黄芪皂苷Ⅱ 24 24.55 [M＋H]+ 827.479 1 827.478 7 −0.5 C43H70O15 异黄芪皂苷Ⅱ 25 30.45 [M＋H]+ 869.489 3 869.489 3 0.0 C45H72O16 黄芪皂苷Ⅰ 26 33.94 [M＋Na]+ 933.484 9 933.481 8 −3.3 C47H74O17 乙酰黄芪皂苷Ⅰ

表 1 人参黄芪提取液化学成分UPLC-Q-TOF-MS数据及结果推测 Table 1 Speculation on UPLC-Q-TOF-MS data of chemical constituents in extract of GR and AR

液质数据经过MZmine处理后，产生4 804个变量，将原始数据矩阵导入SIMCA-P（version 11.5，瑞典Umetrics公司）软件中，进行多变量统计分析。在PCA模式下，3个主成分被提取，R_X²和Q_Y²分别为0.903和0.807，其得分图如图 2-a所示，表明人参-黄芪分提组和合提组存在着明显的差异；在偏最小二乘判别分析（PLS-Da）模式下，2个主成分被提取，R_X²、R_Y²和Q_Y²分别为0.875、0.832和0.679，表明本实验所建立的主成分分析模式，不仅对变量具有很好的解释度，同时也有准确的预测性，其得分图如图 2-b所示^[12]。

图 2 人参、黄芪合提与分提提取液分别在PCA和PLS-Da模式下得分图 (a、b) 和PLS-Da模式下VIP＞1的VIP图 (c) Fig.2 Score plot (a and b) and VIP plot (VIP > 1,c) of mixed decoction and separated decoction of GR and AR in PCA and PLS-Da pattern recognition

根据分提组、合提组所构建的PLS-Da模型中每个模型的变量投影重要性（variable importance in the projection，VIP）筛选出相对应的变量，提取出VIP＞1的变量（图 2-c），并对这些变量进行单因素方差检验（P＜0.05）。通常来说，VIP值越大的变量，其对应的成分对分类意义越大。本实验共生成VIP＞1变量712个，通过方差分析确定了有统计学意义的变量286个，对286个变量所对应的离子进行鉴定，确定了12个离子能够解释人参黄芪分提与合提的差异性，分别对应表 1中化合物4、6～8、11～13、17、21、24～26，其在分提提取液和合提提取液中的变化趋势（以化合物一级离子峰面积均值表示）见图 3，相对于分提提取液，合提提取液中12个化合物的量均不同程度地上升，提示人参黄芪在煎煮过程中存在着相互助溶作用。

图 3 12个差异化合物的变化趋势 Fig.3 Change trend plots of 12 different compounds

在质谱条件优化中，对于质谱的正负离子模式分别进行了考察，发现正离子模式下，除了产生准分子离子峰响应度较高外，还能产生较多的碎片离子峰，因此，选取正离子模式为质谱的电离模式。另外，还考察了0.1%、0.2%和0.3%甲酸对于电离的影响，发现0.2%甲酸能够获得较高的离子强度，因此，选取0.2%甲酸作为流动相。人参中主要含人参皂苷类成分，黄芪中主要含黄芪皂苷类成分和黄酮类成分，皂苷类成分准分子离子峰主要为 [M＋Na]⁺，其碎片为脱糖基离子峰，黄酮类成分的准分子离子峰主要为 [M＋H]⁺。

本实验中，对人参黄芪提取液中26个离子进行了鉴定，其中10个离子来自于人参，为人参皂苷类成分，16个离子来自于黄芪，为黄芪皂苷类成分和黄酮类成分。另外，通过PCA对人参黄芪分提提取液和合提提取液进行了分析，确定了12 个化合物表出了较大差异，其中有8个来自于黄芪，4个来自于人参，且合提液中的量均高于分提液，提示人参和黄芪在煎煮时能够产生相互助溶作用，可能与其含有大量的皂苷类成分有关。

另外，人参皂苷Rg₁（4）、人参皂苷Re（5）、人参皂苷Rb₁（13）、黄芪甲苷（18）及毛蕊异黄酮（10）的转移率是芪白平肺颗粒工艺研究的主要指标。从本研究中可以发现，除人参皂苷Re外，其他4个化合物合提后的量均有所上升。因此，在进行芪白平肺颗粒的工艺时，有必要考虑人参黄芪配伍提取时的相互助溶作用。同时，人参皂苷Rg₁、Re、Rb₁及黄芪甲苷的量为芪白平肺颗粒的质量控制指标，因此，在确定上述4个指标成分的质量控制范围时，也应当考虑人参黄芪配伍提取时的相互助溶作用。